EXTRAÇÃO DE DNA_ SANGUE DE ANIMAL

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FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E AMBIENTAIS
CURSO DE BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR
Relatório de Aula Prática
Extração de DNA: sangue de animal
P3: Henry Granado, Vitor Bortolanza, Maíra Melo de Andrade
Profº. Drº. ALEXEIA BARUFATTI
DOURADOS - MS
7 de Abril de 2022
INTRODUÇÃO
A célula animal é a unidade básica dos animais e dos humanos. É uma célula
eucariótica, ou seja, possui núcleo definido e organelas celulares, como:
lisossomos e mitocôndrias.
A extração de DNA e RNA é obtida através de vários tipos de tecidos e
células, e para cada um, existe um método específico. Porém cada modo tem
uma aplicação diferente, por isso definir resultados e características é
importante para a compreensão do processo. A escolha de cada modo depende
de diversos fatores, tais como: tipo de tecido utilizado, grau de pureza
fundamental para a aplicação em que o DNA será utilizado. (OLIVEIRA.
MARCIA CRISTINA DE SENA, 2007)
Um exemplo de aplicação das extrações de DNA são as de sangue bovinos
que oferecem muitos estudos sobre diagnóstico de doenças, planejamento de
cruzamentos, melhoramento genético e entre outros. A extração do DNA é
dividida, basicamente, em duas fases, sendo a primeira delas a fase que se trata
da extração e a segunda fase que corresponde a ‘’retirada’’ dos restantes dos
componentes celulares da solução. (GOUVEIA. REGITANO)
OBJETIVOS
Aprendizado de técnicas para a extração de DNA em amostra de sangue,
melhorando as técnicas de pipetagem.
MATERIAIS
● Luvas;
● Suporte para microtubos;
● Micropipetas;
● Ponteiras;
● Banho-maria;
● Centrífuga;
● RNAse;
● Sangue;
● Proteinase K (20mg/ml);
● SDS 20%;
● Clorofórmio;
● Solução de precipitação protéica;
● Álcool etílico;
● Álcool 70%;
● Solução de TE 1X;
● Microtubos de polipropileno de 1,5 e 2 ml.
MÉTODOS
1. No começo da prática adicionamos 300 ul de sangue animal em um tubo
de polipropileno
2. Logo após adicionamos 6 ul de Proteinase K (20mg/ml) e 500 ul de SDS
20%, homogeneizando tudo em um vortex e colocamos a solução na
incubadora a 60° C por 1h30min.
3. Depois que passou o horário estabelecido na incubadora, foi adicionado
no tubo 800ul de clorofórmio e novamente agitado no vortex para
homogeneização.
4. O próximo passo foi a adição de 350ul de solução de precipitação
protéica e homogeneizamos novamente no vortex. Centrifugamos a
solução a 14000 rpm por 10 minutos.
5. Passados 10 minutos retiramos o tubo da centrífuga que apresentava
duas fases líquida e aquosa. Com a pipeta transferimos a fase aquosa
para putro tubo.
6. Adicionamos 1 ml de etanol (100%) gelado e homogeneizamos por
inversão. em torno de 30 segundos uma parte precipitada da solução
apareceu. Novamente a solução foi levada para a centrifuga a 14000 rpm
durante 5 minutos.
7. Depois desses 5 minutos, desprezamos o sobrenadante do tubo e
acrescentamos com a pipeta 1 ml de etanol (70%).
8. Levamos novamente a centrífuga por 2 minutos e passado esse tempo
desprezamos novamente o sobrenadante.
9. Invertemos o tubo e deixamos secar por um período de 10 a 15 minutos.
10. Adicionamos 30ul de TE com pH 8,7 e RNAse (homogeneizamos
lentamente).
11. Levamos a banho maria a 37°C por 1H.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Primeiramente no processo de extração de DNA, nos colocamos nossos
reagentes, que terão a função de romper as células, e condensar o DNA.
colocamos no banho maria para poder acelerar o processo de lise celular e
utilizamos a centrífuga para poder precipitar o material mais pesado deixando
assim no sobrenadante onde esta localizado o DNA, também fizemos a
utilização da capela para poder manipular compostos muito voláteis. Neste
experimento, podemos observar que na extração de DNA, dependendo da
ocasião, podemos ser capazes de visualizar uma pequena mancha
esbranquiçada, porém nem sempre isto pode acontecer.
Este processo ocorre sem muitas alterações em sangue, porém para a
extração de DNA das células das plantas, colocaríamos enzimas para ajudar a
degradar a parede celular e alguns outros reagentes.
Durante este processo, temos que sempre lembrar de guardar o DNA
extraído em um freezer, pois a molécula de DNA é degradável muito facilmente
em temperaturas levemente altas, desta forma mantê-lo no freezer prolonga o
tempo em que a molécula de DNA.
CONCLUSÃO
Com a aula prática aprendemos as três etapas de extração de DNA animal:
a lise celular, a purificação e a precipitação. Além da compreensão de
instrumentos, métodos e tempos corretos de uso de cada material necessário.
Aprendeu-se que a utilização de materiais específicos e processos
colaboram para a boa visualização e conclusão do procedimento com resultados
satisfatórios.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
OLIVEIRA. MARCIA CRISTINA DE SENA. et al. Fundamentos teórico-práticos e
protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação
em cadeia da polimerase. São Carlos, SP 2007.
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pd
f. acessado em: 12/04/2022
GOUVEIA. J. J. S. REGITANO, L.C.A. Protocolos de biologia molecular
aplicados à produção animal.
https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CPPSE/17536/1/PROCILCAR20
07.00415.pdf . Acessado em: 12/04/2022
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf
https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CPPSE/17536/1/PROCILCAR2007.00415.pdf
https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CPPSE/17536/1/PROCILCAR2007.00415.pdf