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Microbiologia de Alimentos Responsável pelo Conteúdo: Prof.ª Dr.ª Elisa Mara Prioli Ciapina Rochedo Revisão Textual: Prof. Me. Claudio Brites Características dos Microrganismos Características dos Microrganismos • Conhecer as características morfológicas e fisiológicas das bactérias, fungos e vírus; • Diferenciar os microrganismos observando suas características morfológicas; • Entender que os microrganismos estão presentes em diferentes ambientes e é preciso aprender a conviver com eles. OBJETIVOS DE APRENDIZADO • Contextualização; • Características dos Microrganismos; • Diferentes Ambientes onde os Microrganismos Podem ser Encontrados. UNIDADE Características dos Microrganismos Contextualização O mundo microbiano abrange as bactérias, fungos e vírus, além de protozoários e algumas algas. Você sabe diferenciar uma bactéria de um fungo? O fermento biológico, usado para fazer o pão, é uma levedura, você sabe o que é isso? Podemos retirar o pedacinho mofado do pão e comer o restante sem problemas? Pois bem, é importante conhecer os microrganismos, suas características e modo de vida, pois isso será a base para compreender como ocorrem os processos de crescimento, contaminação, patologias e como esses podem ser controlados. O foco principal desse estudo é o grupo das bactérias, fungos e vírus. O que são, onde vivem e as possíveis fontes de contaminação. Fiquem atentos às principais diferenças! 8 9 Características dos Microrganismos Os microrganismos (também chamados de micróbios ou germes) são seres vivos que, em geral, não podem ser vistos a olho nu, fazendo-se necessário o uso de micros- cópios para melhor visualização desses. Com o desenvolvimento do microscópio, um mundo microscópico, invisível, pode ser estudado (saiba mais no Material Complementar). O comerciante holandês e cientista amador Anton van Leeuwenhoef foi, provavelmente, o primeiro a observar microrganismos vivos. Ele escreveu sobre os “animáculos” que observou em água da chuva, fezes e material raspado de dentes – os quais, posteriormente, foram identificados como protozoários e bactérias. A partir daí, a comunidade científica interessou-se pelas origens desses seres até então invisíveis. Até a segunda metade do século XIX, muitos cientistas acreditavam na geração espontânea, hipótese que considerava que algumas formas de vida poderiam surgir espontaneamente da matéria morta. Em 1858, Rudolf Virchow levantou a hipótese da biogênese, que considerada que células vivas surgiam apenas de células vivas pre- existentes, contrapondo-se à hipótese da geração espontânea. Como ele não provou cientificamente sua hipótese, muitos cientistas ainda não acreditavam que pudesse existir vida em matérias não vivas. Contudo, em 1861, o cientista francês Louis Pasteur demonstrou que os microrganismos estavam presentes na matéria não viva, como no ar, em líquidos e sólidos, e que eram os responsáveis pela deterioração dos alimentos. Seus experimentos forneceram a base para técnicas de controle de micró- bios (técnicas assépticas) que são utilizadas até hoje como a pasteurização (saiba mais no Material Complementar), que previnem a contaminação por microrganismos. Características Morfológicas e Fisiológicas de Bactérias Bactérias são organismos procariontes (derivado do termo grego que significa pré-núcleo) que não possuem núcleo definido e onde o material genético (nucleoide) encontra-se disperso no citoplasma. Seus representantes são unicelulares e podem ser encontrados em diferentes ambientes. A maioria das bactérias varia de 0,2 a 2 ɥm de diâmetro e de 2 a 8 ɥm de comprimento. ɥm, micrômetro é a unidade de medida que equivale a 10-6 m, isso é, 0,000001 m, sendo, portanto, visualizado apenas por microscópio. A célula bacteriana (Figura 1) apresenta componentes essenciais para sua sobrevi- vência como membrana plasmática, citoplasma, nucleioide (material genético), ribosso- mos (estrutura responsável pela síntese de proteínas) e parede celular. Sendo essencial à vida da bactéria, essas estruturas são locais de atuação de muitos agentes antimicro- bianos, como os antibióticos. 9 UNIDADE Características dos Microrganismos Fímbrias Cápsula Parede Celular Membrana Plasmática Ribossomos Plasmídeo (DNA Extra Cromossomal) Citoplasma Flagelo Cromossomo DNA (Nucleoide) Figura 1 – Estrutura de uma Célula Bacteriana Fonte: Adaptado de Getty Images Importante! A grande maioria das bactérias possui parede celular, exceto em um pequeno grupo de bactérias chamado micoplasma. Podemos destacar as principais características dessas estruturas: • Membrana plasmática: composta por bicamada de lipídeos (fosfolipídeos) e proteínas. Funciona como uma barreira seletivamente permeável que controla o que entra e sai da célula. Limita o meio intracelular do meio extracelular. A membrana também é importante para digestão de nutrientes e na produção de energia para as células procarióticas; • Nucleoide: material genético, normalmente, constituído de uma única molécula circular de DNA (ácido desoxirribonucleico), que forma o cromossomo bacteriano contendo a informação genética da bactéria; • Citoplasma: substância localizada no interior da membrana plasmática, contendo água, proteínas, íons, lipídeos, carboidratos e outros compostos. É o local onde ocorrem diversas reações metabólicas da célula; • Ribossomos: formado por RNA (Ácido Ribonucleico) ribossomal e proteínas, são responsáveis pela síntese de proteínas; • Parede celular: composta por peptideoglicano e outros componentes. O pep- tideoglicano consiste em dissacarídeos (açúcares) ligados por polipeptídeos para formar uma rede que circunda e protege a célula. Confere proteção e forma à célula. A parede celular bacteriana pode apresentar variações na sua composição química e é possível agrupar as bactérias de acordo com suas paredes. Assim, têm- -se as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Esse nome de GRAM refere-se ao pesquisador que determinou a sequência de corantes utilizada para distinguir essas paredes bacteriana, conhecida como Coloração de GRAM (veja videoaula 1). A parede das bactérias Gram-positivas apresenta uma espessa camada de pepti- deoglicano, com ácidos teicoicos associados, que pode ser observada na Figura 2. 10 11 Os ácidos teicoicos consistem em um álcool (como glicerol) e fosfato. Existem dois tipos: o ácido lipoteicoico, que atravessa a camada de peptideoglicano, e o ácido teicoico da parede, que está ligado ao peptideoglicano. Eles têm um importante papel no cres- cimento celular. Ácido Lipoteicoico Ácido Teicoico Peptideoglicano Membrana Citoplasmática Citoplasma Proteínas da Membrana Plasmática Figura 2 – Parede da Bactéria Gram-Positiva Fonte: Adaptado de Getty Images A parede celular da bactéria Gram-negativa apresenta uma fina camada de pepti- deoglicano e uma membrana externa, como pode ser observado na Figura 3. Essa membrana externa é composta por lipídeos, proteínas (porinas) e carboidratos. Podem-se destacar os lipopolissacarídeos (LPS), que contêm lipídeos e carboidratos; as lipoproteínas (lipídeos e proteínas) e os fosfolipídeos. A membrana externa permite que a bactéria escape do sistema de defesa do corpo humano. Além disso, fornece uma bar- reira contra ação de detergentes, alguns antibióticos e determinadas enzimas digestórias. Membrana Externa Lipoproteínas Peptideoglicano Membrana Citoplasmática Lipopolissacarídeos Porina Proteínas da Membrana Plasmática Figura 3 – Bacteria GRAM-NEGATIVA Fonte: Adaptado de Getty Images 11 UNIDADE Características dos Microrganismos Importante! Não confundam membrana plasmática com membrana externa. A membrana externa faz parte da parede celular das bactérias Gram-negativas. Na imagem da Figura 4, observa-se, em microscópio (aumento de 1000x), as bactérias coradas pela coloração de GRAM, onde as células rosadas referem-se às bactérias GRAM-NEGATVIAS e as células roxas são as GRAM-POSITIVAS Figura4 Fonte: Getty Images A Figura 5 evidencia as diferenças da parede celular das bactérias. Gram-negativaGram-positiva Membrana Externa Lipoproteínas Peptideoglicano Espaço Periplásmico (Periplasma) Membrana Citoplasmática Lipopolissacarídeos Porina Proteínas Figura 5 Fonte: Adaptado de Getty Images Além dos componentes citados, outras estruturas podem estar presentes em alguns representantes bacterianos, como flagelo, fímbrias, pili sexual, cápsula, plasmídeo, endós poros e inclusões. Vale ressaltar que essas estruturas são importantes, mas que não são essenciais para a vida da bactéria. • Cápsula: substância viscosa e gelatinosa situada externamente à parede celular composta por polissacarídeos (açúcares), também chamada de glicocálice. Forma uma camada limosa. Protegem a bactéria contra as defesas do corpo, além de permitir adesão às superfícies lisas, podendo formar biofilmes (microrganismos aglomerados na substância gelatinosa); 12 13 • Flagelo: longos filamentos que promovem o deslocamento da bactéria. Esses fla- gelos são utilizados no processo de invasão dos tecidos humanos, podendo levar a lesões; • Fímbrias: pequenos filamentos que podem circundar toda a célula, que permi- tem forte adesão entre as células e as superfícies, incluindo os tecidos; • Pili sexual (no singular é pilus sexual): filamentos mais longos que as fím- brias, semelhantes a pelos, que permitem pequenos deslocamentos e transfe- rência de material genético para outra bactéria (Figura 6). Figura 6 Fonte: Getty Imagens A Figura 6 mostra a transferência de plasmídeo (DNA extracromossomal) para outra bactéria. • Endósporo: forma resistente das bactérias quando estão em condições desfavo- ráveis para sua sobrevivência. É uma célula dormente. É formado nas bactérias Gram-positivas e podem resistir no ambiente por muitos anos; • Plasmídeo: pequenas moléculas de DNA extracromossomal que contêm infor- mações genéticas adicionais ao funcionamento da bactéria, como genes de resis- tência aos fármacos; • Inclusões: depósitos de reserva dentro do citoplasma como grânulos de polis- sacarídeos, inclusões lipídicas, grânulos de enxofre, magnetossomos (óxido de ferro), carboxissomos. Importante! Alguns microbiologistas usam os termos fímbria e pili sexual como se fossem a mesma estrutura. No entanto, autores como Tortora (2012) e Madigan et al. (2016) distinguem as funções. As células bacterianas podem ter o formato de bacilos (semelhante a bastões), cocos (forma esférica ou ovoide) e espirais (curvado ou espiralado), conforme observado na Figura 7. 13 UNIDADE Características dos Microrganismos Bactérias Esféricas (cocos) coco único diplococos esta�lococos tétrade sarcina estreptococos Bastão ou Bacilos bacilo único cocobacilo paliçada (lado a lado) diplobacilo formadores de esporos (endósporos) estreptobacilos Bactéria Espiral (Curvas) vibrião espirilo espiroquetas Figura 7 Fonte: Adaptado de Getty Images Quando os cocos se dividem, as células podem permanecer ligadas umas às outras. Assim, é possível classificar as bactérias de acordo com o arranjo que formam: diploco- cos (cocos em pares); estreptococos (forma de cadeia, fileira); estafilococos (formam agrupamentos em formato de cacho de uva), tétrades (grupo de quatro células) e sarci- nas (formam um cubo com oito células). Em relação aos bacilos, esses podem se apresentar em pares (diplobacilos), em cadeias (estreptobacilos), lado a lado (paliçada), podendo ainda ser pequenos e ovais (cocobacilos). Bacilos também podem formar esporos (endósporos). As bactérias espirais apresentam curvas e podem ser do tipo vibrião (que são bastões curvos), espirilo (forma helicoidal como um saca-rolha) e espiroqueta (forma helicoidal e flexível). Importante! Toda vez que você ler o termo “bacilo”, quer dizer que é uma bactéria. Não precisa escrever “a bactéria bacilo”; e isso se aplica às outras formas também. Sabendo-se como é a parede celular e a forma celular que apresentam, é possível agrupar diferentes espécies de bactérias. As principais bactérias de interesse na área de alimentos são conhecidas e agru- padas em Bacilos Gram-positivos produtores de endósporos, Bacilos Gram-positivos não produtores de endósporos, Bacilos Gram-negativos e Cocos Gram-positivos. Esses microrganismos serão estudados em outra unidade. 14 15 Algumas bactérias podem fabricar seu próprio alimento por fotossíntese, mas a maio- ria precisa consumir os nutrientes necessários para seu metabolismo e crescimento. Metabolismo é a soma de todas as reações químicas que ocorrem no interior de um orga- nismo vivo. As reações químicas liberam energia e outras moléculas como CO2, água, etanol, lactato e outros; mas também requerem fontes nutricionais para obter energia. As bactérias possuem capacidade de sobrevivência e crescimento em diferentes condições, como ampla faixa de temperatura (0 a 90 Cº); pH próximo da neutra- lidade entre pH 6,5 a 7,5 (com poucas exceções); presença de água; variação de oxigênio no ambiente (ausência ou presença), fatores nutricionais como Carbono, Nitrogênio, Fósforo, Enxofre e outros elementos minerais. A multiplicação das bactérias ocorre por divisão binária, onde uma célula origina duas. Essas duas originarão quatro, e assim sucessivamente. As bactérias são responsáveis por alterações químicas indesejáveis no alimento, mas também por alterações benéficas, como na produção de iogurtes. No entanto, são responsáveis por causarem infeções alimentares, quando o microrganismo se instala, invade e se multiplica no ser humano e animais; e por intoxicações alimenta- res, quando liberam toxinas nos alimentos e esses são ingeridos. A legislação estabe- lece quais são as bactérias de interesse na fiscalização dos produtos comercializados. Esses temas serão assuntos das próximas unidades. Características Morfológicas e Fisiológicas de Fungos Fungos são diferentes das bactérias, pois são organismos eucariontes (isto é, suas células possuem núcleo e organelas). Os fungos apresentam parede celular contendo açúcares como glicanas e quitina (não possuem peptideoglicano). Podem ser formados por uma célula (unicelulares) e recebem o nome de levedura; ou formados por muitas células (multicelulares), que são os bolores, normalmente vistos no ambiente e em alimentos. Para sobrevivência e crescimento, absorvem diferentes nutrientes e crescem em am- bientes com pH próximo a 5, que é muito ácido para a maioria das bactérias; em baixa umidade; em elevadas concentrações de sal e açúcar; ampla faixa de temperatura. Os bolores possuem filamentos denominados hifas. Quando as condições am- bientais se tornam favoráveis, as hifas crescem e formam uma massa chamada mi- célio, visível a olho nu. 15 UNIDADE Características dos Microrganismos Figura 8 – Fungo Fonte: Adaptado de Getty Images Na representação das Figuras 9a e 9b, nota-se as hifas nucleadas e suas organelas. Figura 9 Fonte: Adaptado de Getty Images Nos alimentos, os bolores são facilmente visualizados. Na Figura 9a, é possível visualizar os filamentos (hifas) e estruturas na extremidade dessas hifas que liberam os esporos; na Figura 9b, temos uma imagem do fungo observado em microscópio. Esse fungo é o Penicillium spp. Os fungos filamentosos podem se reproduzir pelas hifas ou pela formação dos esporos. Esses esporos permitem a dispersão do fungo, pois são formados em grande quantidade e liberados, germinando outro novo fungo. Esporos Germinação dos Esporos MicélioEstágio Inicial Cogumelo Maduro Figura 10 – Ciclo de Vida de Fungo (Tipo Cogumelo) Fonte: Adaptado de Getty Images 16 17 Importante! Os esporos dos fungos são diferentes do endósporo das bactérias. Os endósporos permi- tem que as bactérias sobrevivam em condições adversas, eles não são formas de repro- dução das bactérias. Os fungos filamentosos precisam de oxigênio para sua sobrevivência, podem produzir toxinas (micotoxinas) e são responsáveis por processos de intoxicaçãoalimentar e reações alérgicas em pessoas com maior sensibilidade imunológica. Assim, se você encontrar um alimento embolorado, como o pão, saiba que, apesar de parecer localizado, as hifas e esporos estão entremeados e espalhado por todo alimento. Sendo assim: NÃO COMA! Observe na Figura 11 o fungo filamentoso crescendo no interior do pão. Figura 11 Fonte: Getty Imges Já as leveduras são fungos unicelulares, não filamentosos, esféricos ou ovais. A Figura 12 mostra os componentes da levedura. Mitocôndria Parede Celular Membrana Plasmática Grânulos de Lipídeos Aparelho de Golgi Núcleo Citoplasma Cicatriz do Broto Vacúolo Figura 12 – Célula de Levedura Fonte: Adaptado de Getty Images 17 UNIDADE Características dos Microrganismos A Figura 13 mostra as leveduras observadas em microscópio óptico. Nota-se a presença de estruturas internas na célula, característico de células eucarióticas. Figura 13 Fonte: Getty Images Esses fungos reproduzem-se por brotamento, onde a célula inicial forma um broto e esse se separa no final, deixando uma cicatriz do broto, conforme Figura 14, ou por divisão da célula (leveduras de fissão), em que uma célula origina duas novas iguais. Levedura Original Núcleo Broto Divisão do Núcleo por Mitose Separação do Broto da Célula Original Célula Filha Figura 14 Fonte: Adaptado de Getty Images A Figura 15 representa a reprodução por brotamento, em que há a formação do bro- to, divisão do núcleo e liberação do broto (célula filha), o qual se separa da célula original. Figura 15 – É possível ver o processo de brotamento das leveduras Fonte: Getty Images 18 19 Esses fungos são capazes de crescer na presença ou ausência de oxigênio, o que per- mite que eles sobrevivam em vários ambientes, inclusive em embalagens a vácuo. Alguns fungos (bolores e leveduras) podem ser patogênicos, causando doenças, mas também podem ser utilizados para consumo (cogumelos) e na produção de fármacos e alimentos. As leveduras são muito utilizadas na fabricação de cerveja, vinho e pães, como espécies de Saccharomyces, que são utilizadas como fermento biológico, comercial- mente disponível. Características Morfológicas e Fisiológicas de Vírus Vírus são acelulares (não é uma célula). São partículas formadas por uma estru- tura proteica (capsídeo) e material genético (DNA ou RNA, de fita simples ou fita dupla). Alguns vírus podem apresentar envelope, que é a membrana plasmática da célula hospedeira, assim como algumas enzimas. Os componentes virais podem ser observados na Figura 16. Glicoproteínas Envelope Viral Capsídeo Genoma (DNA ou RNA) Figura 16 – Estrutura de um Vírus Fonte: Adaptado de Getty Images Os vírus podem apresentar diferentes formas sendo poliédricos, helicoidais, esfé- ricos e complexos como os bacteriófagos (Figura 17). Poliédrico (Adenovírus) Esférico (In�uenza) Helicoidal (Vírus do Mosaico do Tabaco) Complexo (Bacteriofagos) Figura 17 – Forma dos Vírus Fonte: Adaptado de Getty Images 19 UNIDADE Características dos Microrganismos Eles são considerados parasitas intracelulares obrigatórios, pois não possuem me- tabolismo próprio. Na sua maioria, são muito pequenos se comparados às bactérias e células eucarióticas (ver material complementar). Para que ocorra o aumento do número de partículas virais, os vírus realizam um processo chamado de replicação viral. Esse processo compreende etapas de: adesão, penetração, biossíntese dos componentes virais, maturação e liberação (Figura 18). Figura 18 – Ciclo de Replicação Viral Fonte: Adaptado de Getty Images • Adesão: também chamada de adsorção, consiste na fixação do vírus em um receptor na membrana da célula hospedeira. Esse processo de adesão ocorre em receptores específicos das células. Se a célula não tiver o receptor específico, o vírus não conseguirá entrar. O vírus possui tropismo (afinidade) por determi- nados tipos de células; • Penetração: os vírus entram no citoplasma da célula hospedeira por meio de endocitose (invaginação da membrana plasmática) ou por fusão no qual o enve- lope viral se funde à membrana plasmática do hospedeiro e libera o capsídeo no citoplasma da célula; • Biossíntese dos componentes virais: nessa fase, são feitas várias cópias do material genético do vírus e muitas proteínas que compõem o capsídeo; • Maturação e liberação: com todos os elementos prontos, ocorre a montagem dos novos vírus e posterior liberação. Nos vírus com envelope (envelopados), no momento da liberação, parte da membrana plasmática é retirada pelo vírus. O estudo dos vírus é fundamental na área de alimentos, uma vez que são respon- sáveis por algumas doenças transmitidas por alimentos e água, causando gastroen- terites, hepatites e poliomielite. 20 21 Você sabia? O termo vírion pode ser utilizado para referir-se à partícula viral infecciosa completa, quando o vírus está totalmente desenvolvido. Diferentes Ambientes onde os Microrganismos Podem ser Encontrados Como já mencionado, os microrganismos apresentam um metabolismo variado, o que permite que sobrevivam em diferentes ambientes. Estão presentes em alimentos, água, superfícies, utensílios de cozinha, animais, plantas, chão etc. Além disso, estão presentes no nosso corpo, formando nossa microbiota natural da pele e de todo trato digestório, desde a boca até o final do intestino grosso (Figura 19). Figura 19 Fonte: Getty Images Você sabia? A microbiota natural do corpo tem funções importantes que garantem nossa sobrevi- vência. Ela é constituída por bactérias, fungos e vírus que nos ajudam no processo de digestão, síntese de substâncias que são absorvidas, evitam a instalação de agentes que causam doenças, modulam sistema imunológico (de defesa) do nosso corpo, entre outras. Essa microbiota se instala no corpo desde o nascimento e vai sendo constituída até os 2 anos de idade, sendo que o tipo de alimentação irá favorecendo, ou não, deter- minados tipos de microrganismos. Assim, manter uma alimentação saudável garante a sobrevivência dos microrganismos benéficos da microbiota, que favorecem o bom fun- cionamento do nosso organismo ( ver material complementar). 21 UNIDADE Características dos Microrganismos Assim sendo, é possível entender que a contaminação por microrganismos nos ali- mentos pode ocorrer pelo contanto de diversas fontes. Dentre essas, podemos destacar: • Solo e água: os microrganismos são responsáveis pela decomposição e ciclagem de nutrientes na natureza, e a presença de microrganismos nesses ambientes é constante. Dessa forma, o contato direto do alimento com o solo e a água, como alguns vegetais e verduras, faz com que esses tenham uma carga microbiana ini- cial elevada. É importante entender que esses alimentos devem ser higienizados adequadamente para reduzir essa carga microbiana inicial, fazendo com que os alimentos tenham maior durabilidade e que se diminua o risco à saúde humana; • Plantas: alguns microrganismos são capazes de aderirem e se multiplicarem na superfície das plantas; • Utensílios: a superfície de utensílios (tábuas de corte, facas, bandejas, moedores, espremedores de frutas, recipientes etc.) pode favorecer a retenção, sobrevivência e multiplicação dos microrganismos e a higienização inadequada desses resulta na transmissão de microrganismos de um alimento para outro (contaminação cruzada); • Microbiota do intestino de homens e animais: podem chegar ao alimento e provocar diversas doenças; • Manipuladores de alimentos: microbiota das mãos e roupas dos manipula- dores pode ter origem no solo, água, poeira e outros ambientes. Além disso, é importante destacar a presença de microrganismos nas fossas nasais, boca, pele e unhas. As condições higiênicas inadequadas desses manipuladores podem resultar em contaminação de microrganismos que causam doenças; • Pele de animais: importante fonte de contaminação, que necessita de adequada higienização em processos como ordenha; • Ar: diversos microrganismos são encontrados nesseambiente, em partículas de poeira, que podem depositar-se nos alimentos. Sem controle adequado, e em condições favoráveis, esses microrganismos podem se multiplicar. 22 23 Material Complementar Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade: Livros 10% Humano: como os micro-organismos são a chave para a saúde do corpo e da mente COLLEN, A. 10% Humano: como os micro-organismos são a chave para a saúde do corpo e da mente. Rio de Janeiro: Editora Sextante, 2016. Vídeos Microorganisms Size Comparison – 3D https://youtu.be/h0xTKxbIElU O que é microbiota? https://youtu.be/nXBNrD_epCU Ciência USP Responde: Quantas bactérias vivem em nosso corpo? https://youtu.be/PPwDUqsNTsQ Mas as bactérias não causam doenças? https://youtu.be/KEyLSnLv7es Flu Attack! How A Virus Invades Your Body | Krulwich Wonders | NPR https://youtu.be/Rpj0emEGShQ Leitura Microscopia: A história e evolução dos microscópios https://bit.ly/3ebfNad Pasteur: Ciência para ajudar A vida https://bit.ly/3hzhn7P Robert Hooke e a pesquisa microscópica dos seres vivos https://bit.ly/2AJkTMj Probióticos e prebióticos: o estado da arte https://bit.ly/2YHFVTF 23 UNIDADE Características dos Microrganismos Referências MADIGAN, M. T. et al. Microbiologia de Brock. 14. ed. Porto Alegre: Artmed, 2016. (e-book) TORTORA, G. J.; FUNKE, R.; CASE, C. L. Microbiologia. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. (e-book) 24