Extração de DNA e PCR

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BIOTECNOLOGIA
Profa. Ms. Geísa Paes
EXTRAÇÃO DE DNA, PCR E 
ELETROFORESE
Profa. Ms. Geísa Paes
1. Extração de DNA
2. Polymerase Chain Reaction (PCR)
3. Eletroforese
EXTRAÇÃO DE DNA
- Exposição do ácido nucléico por rompimento da 
membrana e da parede celular.
1) Coleta da amostra
2) Extração - mecânica; enzimática e química.
3) Purificação - fenol clorofórmio, coluna e beads.
4) Controle de qualidade - quantidade, pureza e 
integridade.
EXTRAÇÃO DE DNA
1) Coleta de amostras
- Tipo de PCR? 
- Armazenamento (resfriar, congelar 
ou nitrogênio liquido)
EXTRAÇÃO DE DNA
2) Extração: Exposição do ácido nucléico através do 
rompimento da membrana e parede celular
Mecânica
membranas celulares são 
rompidas por forca mecânica 
Enzimática
Enzimas são adicionadas para 
digerir proteínas e estruturas 
celulares
Química
Utiliza-se detergente para 
romper os lipídeos da 
membrana celular junto 
com sais caotrópicos
EXTRAÇÃO DE DNA
3) Purificação: Após extração o ácido nucléico é separado 
de tudo que não interessa (componentes celulares, 
proteínas, reagentes), concentrado e armazenado em 
água ou tampão.
Fenol/clorofórmio Coluna Beads
EXTRAÇÃO DE DNA
Fenol/clorofórmio
✓ Purificação – fenol/clorofórmio
EXTRAÇÃO DE DNA
✓Purificação - coluna 
Coluna
EXTRAÇÃO DE DNA
✓ Purificação - beads magnéticas
Beads
EXTRAÇÃO DE DNA
4) Controle de qualidade - 3 pontos
Qual foi o rendimento do 
processo de extração e 
purificação 
(fluorometria)
Quão eficiente foi 
o processo de 
purificação 
(espectrometria)
Quão integro está 
o seu DNA/RNA 
EXTRAÇÃO DE DNA
✓ Quantificação – Fluorometria
- Agente fluorescente – emite fluorescência baixa e quando junta a
molécula
de DNA/RNA emite fluorescência alta. O nível de fluorescência é
quantificado.
- Especifico para cada ácido nucleico – DNA dupla fita, molécula de RNA,
proteína.
Vantagens: rápido e fácil; equipamento barato; discrimina
DNA/RNA; pode quantificar a integridade do RNA.
Desvantagens: utiliza reagentes – custo; não mensura pureza;
técnica menos utilizada.
EXTRAÇÃO DE DNA
✓ Pureza (espectrometria)
- Um feixe de luz é emitido através da amostra . A quantidade de luz 
absorvida é quantificada.
EXTRAÇÃO DE DNA
✓ Pureza (espectrometria)
- Um feixe de luz é emitido através da amostra . A quantidade de luz 
absorvida é quantificada.
A luz tem diferentes comprimentos de onda! 
EXTRAÇÃO DE DNA
- DNA / RNA = 260 nm; Proteína = 280 nm; Contaminantes 
(fenol, sais, EDTA, carboidratos) = 230 nm
✓ Pureza (espectrometria)
EXTRAÇÃO DE DNA
✓Métrica de pureza
- Ácido nucleico em a relação a proteína: A260/280 nm
➢ DNA = 1,8 a 2,0
➢ RNA = 1,9 a 2,1
- Ácido nucleico em relação a outros contaminantes (fenol, 
sais, EDTA, carboidratos, ureia): A 260/230 nm
➢ Entre 1,5 e 1,8 
EXTRAÇÃO DE DNA
✓ Integridade
- Amostra integra – vários fragmentos do mesmo
tamanho
- Amostra degradada – enzimas cortam a amostra
fragmentos de diferentes tamanhos
Como visualizar ? Qual técnica separa fragmentos?
-Eletrofose
- Eletrofose capilar (fluorescência) – Bioanalyzer da
Agilent
EXTRAÇÃO DE DNA
1. Extração de DNA
2. Polymerase Chain Reaction (PCR)
3. Eletroforese
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
PCR = Cópias in vitro usando elementos básicos do 
processo de replicação de DNA
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
DNA molde
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Etapa 1 - Desnaturação
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Etapa 2 - Anelamento
Primers: pequenos 
fragmentos de DNA 
sintéticos 
complementares a 
minha sequencia 
alvo.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Etapa 3 – Extensão 
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Etapa 3 – Extensão 
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Etapa 3 – Extensão 
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
✓ O fragmento de DNA sintetizado em um dado 
ciclo, serve como molde para formação de novos 
fragmentos no ciclo seguinte.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
ELETROFORESE
✓ Utilizada para visualização dos produtos de amplificação 
da PCR
Profa. Ms. Geisa Paes _ geisapaes@gmail.com
UM FORTE ABRAÇO E ATÉ A PRÓXIMA AULA!!!