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Tema 4: Diagnóstico sorológico e controle de qualidade · Diagnóstico sorológico Os métodos sorológicos são desenvolvidos a partir do reconhecimento antígeno-anticorpo. Os antígenos são qualquer molécula estranha ao organismo, como fungos, bactérias, vírus e protozoários, que estimulam a produção de imunoglobulinas. ( anticorpos capazes de eliminar antígenos) A ligação do anticorpo ao antígeno é altamente específica e ocorre em um sítio denominado epítopo. Assim, os testes sorológicos utilizados para detectar a presença de um anticorpo (anti-X) são desenvolvidos apresentando em sua composição o epítopo do antígeno específico (X), isso garante que a reação ocorra apenas quando o soro testado apresentar o anticorpo (anti-X) em investigação. Além de verificar a presença ou a ausência de um determinado anticorpo, esses testes foram adaptados para detectar um antígeno, a presença de enzimas e os hormônios. - Classificação dos testes sorológicos O método qualitativo indica a presença ou ausência de uma resposta, ou seja, apenas classifica aquela análise como positiva ou negativa, reagente ou não reagente. Os anticorpos da classe IgM são os primeiros a serem produzidos durante uma infecção, e indicam que o paciente está com a infecção ativa, ou seja, com a doença. Alguns tipos de testes sorológicos qualitativos são muito utilizados no ambiente laboratorial, como os testes rápidos para HIV, coronavírus, sífilis, zika, H. pylori, rotavírus, dentre outros. É utilizado o método quantitativo quando desejamos que um resultado seja medido, ou seja, tenha um valor quantificado. Nesse tipo de método, a quantidade de antígenos, ou anticorpos, pode ser expressa das seguintes maneiras: · No formato de cruzes (positivo +/++++; ++/++++; +++/++++; ++++/++++, onde 4 “+” indicam o máximo de positividade do método) · Titulações (1:2, 1:4, 1:8; 1:16, dentre outros) · Densidades ópticas de reações colorimétricas · Unidades de medidas (UI/mL, % e mg/ mL) que apresentem o valor absoluto do analito As metodologias quantitativas para o diagnóstico sorológico também possibilitam a identificação da quantidade de antígenos presentes ou o título de anticorpos. Para a determinação da titulação de anticorpos, podemos citar o teste sorológico VDRL, amplamente utilizado nas rotinas laboratoriais para a detecção da sífilis, doença causada pela bactéria Treponema pallidum. - Processo de soroconversão A soroconversão é o termo dado para indicar que um organismo produziu anticorpos após o contato com um antígeno. Durante uma resposta imunológica, o contato com um antígeno geralmente induz a produção de anticorpos, mas a detecção destes pelos métodos sorológicos disponíveis pode demorar semanas ou até meses. O período entre a produção e a detecção dos anticorpos pelos métodos é chamado de janela imunológica, janela sorológica ou janela de soroconversão. Nesse intervalo, mesmo que um paciente esteja infectado, a pesquisa de anticorpos será negativa. Dizemos que houve um processo de soroconversão quando o resultado de um primeiro teste sorológico para a detecção de anticorpos contra um antígeno hipotético X for negativo e o de um segundo exame, feito algum tempo depois, for positivo. - Fase clínica Fase inicial (ainda não há doença, mas existe risco de adoecer) > fase pré-clínica (o paciente apresenta doença, mas sem sintomas; há alterações patológicas > fase clínica (a doença apresenta graus de acometimento avançados) > fase de incapacidade residual (doença progride para a morte ou as alterações se estabilizam) >>> IgM: INFECÇÃO IMEDIATA; INFECÇÃO AGUDA >>> IgG: INFECÇÃO TARDIA; INFECÇÃO CRÔNICA OU MEMÓRIA Ex.: Se um paciente apresenta um IgM positivo para o coronavírus com IgG negativo, então, encontra-se na fase aguda da doença, ou seja, a fase altamente transmissível, necessitando ficar em isolamento social. - Eficácia terapêutica Do ponto de vista imunológico, a eficácia terapêutica é a eficiência na produção de anticorpos protetores após uma infecção ou vacinação (imunização ativa, quando é oferecido ao organismo um vírus morto, ou atenuado, para estimular a produção de anticorpos do tipo IgG de memória) - Diagnóstico sorológico na seleção de doadores e receptores de sangue e órgãos Os antígenos responsáveis pela rejeição dos transplantes são denominados aloantígenos, que são conhecidos como antígenos de histocompatibilidade e se dividem em: Complexo de histocompatibilidade principal (MHC) · MHC I: encontrado em todas as células nucleadas · MHC II: constitui células apresentadores de antígeno como macrófagos, células dendríticas e linfócitos. >> Principais tipos de rejeição de enxertos Rejeição hiperaguda: Ocorre minutos ou dias após o transplante, é causada pela ação de anticorpos IgM contra antígenos do sistema ABO, HLA ou antígenos expressos no endotélio vascular. Rejeição aguda: Ocorre poucos dias ou semanas após o transplante, é mediada pelas células T e pelos anticorpos que respondem especialmente ao MHC. Rejeição crônica: Ocorre seis meses a um ano após o transplante através da imunidade celular e humoral adquirida, que cria respostas contra o enxerto. - Testes imunológicos para seleção de doadores e receptores de órgãos/sangue Tipagem sanguínea (ABO) Teste utilizado para identificar tipo sanguíneo e fator Rh Reatividade contra painel (PRA) Método utilizado para avaliar status imunológico do paciente, detecção de moléculas HLA reconhecida pelo paciente Prova cruzada Teste que verifica se o sangue do doador apresenta incompatibilidade com o receptor Tipagem de tecidos Detecta compatibilidade entre o HLA do doador e do receptor - Diagnóstico coletivo A avaliação coletiva é importante em grandes surtos, pois possibilita uma fotografia do panorama da infecção na população e auxilia no acompanhamento, desenvolvimento de medidas de saúde pública, políticas e socioeconômica de combate ao surto. Existem dois importantes termos relacionados ao diagnóstico coletivo: soroprevalência e soroepidemiologia. Soroprevalência: Refere-se ao número de pessoas que apresentam anticorpos detectáveis contra um agente infeccioso, ou seja, a reação de soropositividade desenvolvida a partir da soroconversão. Soroepidemiologia: Acompanha os pacientes, através dos exames de diagnóstico, que apresentaram marcadores sorológicos (anticorpos) contra algum microrganismo, associando esses dados aos fatores sociais, ambientais e econômicos; assim, é possível estudar as melhores estratégias para a saúde pública da população. - Bancos de soros ou sorotecas Esses bancos são importantes porque garantem a rastreabilidade dos resultados encontrados, ou seja, possibilitam que uma análise seja repetida para a confirmação do resultado encontrado. Normalmente, esses soros são separados pelo tipo de análise, ou seja, pelo tipo de agente infeccioso que se deseja investigar. Os tubos armazenados apresentam a identificação do paciente (nome completo ou iniciais e/ou o número do exame laboratorial), data da coleta da amostra e tipo de microrganismos investigados. Essas amostras então são acondicionadas em tubos por um período de 5 a 10 anos e mantidas em congelamento (-20 °C) até serem utilizadas e/ou descartadas futuramente. No caso de um laboratório de pesquisa, esses soros ficam separados de acordo com suas similaridades e podem ser importantes para estudos futuros, devendo ficar armazenados a uma temperatura de -80 °C. Segundo a Resolução da diretoria colegiada (RDC N°34/ 2014), os bancos de sangue devem armazenar a plasmateca, ou soroteca, dos doadores por pelo menos 6 meses na temperatura de -20 °C. - Avaliação dos métodos sorológicos A avaliação do desempenho dos testes sorológicos depende da ausência de desvios na análise (validade ou acurácia do método) e da precisão dos resultados. Desse modo, os métodos de diagnósticos têm que ser avaliados quanto à reprodutibilidade e à acurácia. · Reprodutibilidade: representa a capacidade dos métodos de produzir resultados iguais, mesmo em condições distintas de análises, sendo precisose confiáveis. Um teste sorológico é de alta reprodutibilidade quando, após análises repetidas em uma mesma amostra ou amostras provenientes de um mesmo paciente, são encontrados resultados similares. · Acurácia (validade ou exatidão): A acurácia de um método é a sua capacidade de fornecer resultados verdadeiros, ou seja, quanto aquele método é útil para predizer ou diagnosticar um evento que se propôs de maneira qualitativa ou quantitativa. Para determinar a acurácia de um método, devemos comparar o resultado do teste com os resultados de um padrão, que pode ser a clínica do paciente, exames disponíveis ou um ensaio que possa servir como referência (considerado padrão-ouro). · A precisão indica a reprodutibilidade de um método; já a exatidão aponta o quanto esse método apresenta resultados verdadeiros - Teste sorológico ideal para cada tipo de análise Os resultados possíveis encontrados durante uma validação de um novo teste são: Resultados verdadeiramente positivos: Quando não há dúvida da positividade do teste Resultados falso positivos: Quando o teste é positivo, mas o paciente não apresenta a infecção Resultados verdadeiramente negativo: Quando não há dúvida da negatividade do teste Resultados falso negativo: Quando, apesar de o teste ser negativo, o paciente apresenta infecção A partir dos resultados encontrados para a determinação da acurácia, podemos calcular alguns parâmetros para avaliar o desempenho do método. - eficiência do teste, sensibilidade e especificidade Eficiência do teste: Capacidade do teste detectar os pacientes que apresentam ou não a doença, ou seja, quantos indivíduos são verdadeiramente positivos e negativos dentro de uma população total. Mede quanto o teste apresenta resultados fidedignos. Sensibilidade: Indica quanto um teste consegue determinar em um grupo de indivíduos aqueles que realmente se encontram verdadeiramente positivos. Especificidade: Indica quanto o teste consegue determinar em um grupo de indivíduos aqueles que não estão doentes, os verdadeiramente negativos. · Técnica Western blot: Técnica que detecta proteínas em amostras após a eletroforese, transferência para uma membrana de nitrocelulose, e o reconhecimento do antígeno e do anticorpo. Um teste de diagnóstico ideal deve ter alta sensibilidade (evitar falso negativo) e alta especificidade (evitar resultados falso positivo). Os problemas encontrados durante a avaliação da sensibilidade ou especificidade de um teste estão relacionados a erros sistemáticos inerentes aos métodos. Os erros sistemáticos podem ser: Pré analíticos: Correspondem a toda fase anterior à análise e à chegada ao laboratório. Exemplos: problemas na coleta, no transporte, no armazenamento, na conservação e nas características da amostra (hemólise, lipídico, contaminado). Analíticos: Correspondem à análise em si, a erros de pipetagem, nos equipamentos (manutenção e calibração), nos reagentes disponíveis (validade, contaminação, diluição). Pós analíticos: Correspondem a erros na interpretação dos resultados. Exemplo: erros de cálculos, interpretação e transcrição. - Valores de predição Esse parâmetro é avaliado pelos valores de predição (VP), que indicam a probabilidade de um determinado paciente que apresentar diagnóstico positivo ou negativo esteja verdadeiramente doente ou sadio. O VP é dividido em valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Valor preditivo positivo (VPP): É a probabilidade de um paciente com uma testagem positiva ter efetivamente a doença. Esse parâmetro é baseado na prevalência da doença na amostra estudada e na especificidade do teste. Quantificará a proporção de positivos que efetivamente tem a doença. Valor preditivo negativo (VPN): Quantifica a probabilidade de um resultado “verdadeiro negativo”. Esse parâmetro é baseado na prevalência da doença na amostra estudada, verificando a quantidade de sadios com um teste negativo. · Quanto maior o valor do preditivo positivo, maior é a prevalência da doença em uma determinada população. - Razão de verossimilhança Esse parâmetro indica quantas vezes é possível a detecção de um teste positivo ou negativo e é muito utilizado nas análises de pré-testes, quando queremos estabelecer um novo método de diagnóstico. Essa medida pode ser positiva ou negativa. Quando os dados são avaliados em sensibilidade, essa medida pode ser calculada a partir desses dois parâmetros: Razão de verossimilhança positiva (RV +): Verifica quantas vezes é mais provável encontrar um resultado positivo em pessoas doentes quando comparadas com não doentes. Quanto maior a RV +, melhor é o teste. Calculado como: rv (+) = sensibilidade/especificidade Razão de verossimilhança negativa (RV -): Verifica quantas vezes é mais provável encontrar um resultado negativo em pessoas doentes, quando comparadas com não doentes. Calculado como: rv (-) = sensibilidade/especificidade Tema 6: Métodos laboratoriais