PRÁTICA 10 - COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES (FECAIS E. COLI) PELA TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) PRÁTICA 11 DETERMINAÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO: SACCHAROMYCES BOULARDII - LEVEDURA

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE TOLEDO
 CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS – CECE
 ENGENHARIA QUÍMICA
PRÁTICA 10 - COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES (FECAIS – E. COLI) PELA TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
PRÁTICA 11 – DETERMINAÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO: SACCHAROMYCES BOULARDII - LEVEDURA
Junho, 2019
Toledo - PR
GABRIEL CASTAMANN
JUAN LUCCA DE SIQUEIRA REIS
MATHEUS FELLIPE LABIGALINE SANTOS
VINICIUS DEKKERS CARNEIRO
PRÁTICA 10 - COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES (FECAIS – E. COLI) PELA TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
PRÁTICA 11 – DETERMINAÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO: SACCHAROMYCES BOULARDII - LEVEDURA
	
Relatório de aula prática apresentado à disciplina de Microbiologia Industrial, para obtenção de nota parcial do curso de graduação em Engenharia Química -Universidade Estadual do Oeste do Paraná - UNIOESTE, sob a supervisão da Professora Dra. Jacqueline FerandinHonorio.
Junho, 2019
Toledo – PR
SUMÁRIO 
1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A quantificação de microrganismos é realizada em diferentes situações e por diferentes motivos. Sendo assim, é de extrema atenção se julgar a multiplicação das culturas, principalmente aquelas patogenias aos seres humanos. Além disso, a quantificação é realizada em análises de alimentos e água,com o intuitode verificar a qualidade de tais produtos, em avaliações de eficiência de agentes de governo microbiano, extensamente utilizados em locais públicos, hospitais, laboratórios, entre outros, bem como em análises clínicas, nas quais a presença de determinados microrganismos representa a existência de infecções ou intoxicações.
A quantificação dos microrganismos pode ser realizada de configuração direta, na qual é realizada a contagem do número de células presentes na apresentação em estudo, durante tanto, são utilizadas técnicas de modo que a contagem de unidades formadoras de colônias em placas, contagem em microscópio ou eletrônica, filtração, bem enquanto utilizando-se a técnica do número mais provável, o qual será o objeto da análise destaprática.
 Entretanto, não se faz necessário completar a contagem a fim de se estimar o número de microrganismos em uma amostra. Em tal princípio se baseia a quantificação indireta. Esta consiste na análise de parâmetros como aglomerado completa seca da amostra, turbidez apresentada ou presença de determinadas substâncias relacionadas ao metabolismo dos micróbios (como redução de O2, produção de CO2 ou de algum ácido que resulta da atividade metabólica), que são proporcionais ao total de microrganismos ali presentes. Nestes casos, análises espectrofotométricas são requeridas.
Cada um dos métodos, durante obtenção direta ou estimativa da população de microrganismos, apresenta suas vantagens e desvantagens. Assim, a aplicação destes deveestar de acordo com as necessidades da análise, isso porque, na avaliação de alimentos conservados, por exemplo, é necessário que se conheça o número de células da amostra, paraverificar a coerência junto à legislação.
Naprática em questão foi estudado o método retilíneo do número mais provável (NMP), também conhecido método dos tubos múltiplos, o qual consiste em uma técnica estatística idealizada por McGrady (1915), que se baseia no fato de que“quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para sintetizar as colônias de bactérias até uma minudênciana qual mais nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada”. Nele, o número de microrganismos é determinado utilizando-se a densidade bacteriana, tendo os resultados obtidos a partir de tabelas de probabilidade. Estas permitem determinar o número de microrganismos que estatisticamente levaram ao resultado obtido, sendo o intervalo de confiança da análise de 95%. Ou seja, existem 95% de perspectiva de como a população bacteriana esteja na faixa determinada, sendo o MNP o número estatisticamente mais provável.
O método do número mais provável (NMP) pode ser utilizado na contagem de microrganismos, pois não crescem em meio sólido ou em casos de identificação de bactérias em meio líquido diferencial. Por exemplo, tem-se a identificação e quantificação de bactérias coliformes (totais ou termotolerantes) e E. coli em água. Esta técnica é conhecida por colimetria e é realizada em duas etapas: uma presuntiva e outra confirmativa. Uma terceira etapa, denominada teste completo, pode serrealizada na determinação de coliformes totais, a fim de isolá-los e identificá-los. Porém pode ser excessivamente trabalhosa, o qual acaba se tornando frequentemente não realizada.
Uma vez que o método do número mais provável é uma técnica tradicional que requer considerável período de tempo para obtenção de resultados, têm sido buscados métodos rápidos de realização conforme alternativas ao procedimento. O Petrifilm EC é um método proposto pelo Ministério da Agricultura para tal finalidade, apresentandovantagens superiores deconfiabilidade e reprodutibilidade dos resultados, facilidade de realização, armazenagem e descarte, bem como na facilidade de interpretação de resultados.
A quantificação celular é de grande importância para a supervisão do número de microrganismos em determinado processo, a quantificação poderá controlar totalmente no rendimento de um processo. São vários os métodos de quantificação de microrganismos em uma cultura ou suspensão, eles se dividem substancialmente em dois grandes grupos: quantificação da contagem direta e por contagem indireta. Porém, algumas dessas técnicas exigem algumas precauções, como a mendicidade de diluição para diminuição do número de microrganismos em um tipo com a viabilização da quantificação de uma população de microrganismos.
Alguns métodos de contagem direta, no modo em câmara, são utilizados com a finalidade de realizar a contagem do número total de microrganismos, ou seja, contagem do número de células vivas e mortas. Logo, essa técnica apesar de não ser muito precisa, tem um custo comparativamente metódico e um resultado rápido. Já outros métodos de contagem direta são utilizados para medir a biomassa microbiana e aplicar pesagem direta.
Outro método é tornar turbidimetria com espectrofotômetro, empregando-se um instrumento capaz de avaliar a quantidade de luz que é absorvida ou transmitida quando atravessa uma amostra, essa luz transmitida é inversamente igual a concentração de células. Além desse método existe também um teste rápido e fácil para a quantificação de um volume igual de biomassa, a técnica de volume de material celular após centrifugação consiste na centrifugação de uma suspensão relativa à célula em tubo de centrifuga graduado. O volume de células é obtido por leitura na escala existente no próprio tubo. 
A S. boulardii foi primeiramente isolada de frutas silvestres na Indochina nos anos 50 e desde então vem sendo empregada na qualidade de probiótico, adicionado à jejum alimentar, tendo porfinalidade sustentar flora intestinal e fins terapêuticos na discussão de diarreias.
2. METODOLOGIA 
Coliformes totais e termotolerantes pela técnica do número mais provável
A analise desse teste inicia-se pelo método do NMP (número mais provável) depende do número de tubos adotados, e esta quantidade, é determinada pelas características da amostra, na prática desenvolvida foi utilizada o sistema de três séries de três tubos, sendo esta realizada em duas etapas. A primeira consistiu no teste presuntivo e, posteriormente, um teste de confirmação.
Inicialmente, 25 g da espécie a ser analisada foram adicionados ao erlenmeyer contendo 225 mL da solução salina. A solução foi homogeneizada e representa a diluição 10-1. Todos os tubos foram devidamente identificados, a fim de se evitarem erros em relações às diluições.
Para o teste presuntivo, a cada um dos tubos contendo Caldo Lauril Sulfato de Sódio em concentração duplafoi adicionado 1 mL da amostra na diluição 10-1. Em seguida, foi realizada uma diluição decimal,(resultando na diluição 10-2), sendo como 1 mL desta última foi adicionado a todos um dos três tubos contendo Caldo Lauril Sulfato de Sódio em concentração simples. A cada um dos demais tubos de Caldo Lauril concentração simples adicionou-se 1 mLda amostra após a nova diluição (10-3). Os tubos foram homogeneizados com auxílio de agitador e incubados por 48 horas entre 35 e 37°C. Após o tempo de incubação, realizou-se a verificação de formação de gás dentro do tubo de Durhan de modo a analisar se esse gás representa-se 10% da do volume do tubo, ou se apresenta-se uma turgidez . Havendo a formação do gás, o teste presuntivo é considerado positivo e parte-se para a próxima etapa. Caso contrário, o teste é considerado negativo para coliformes.
A partir dos tubos positivos, o teste de confirmação consiste na análise de coliformes totais e fecais, com verificação de coliformes totais e termotolerantes, 1 mL da amostra presente em cada um dos tubos com formação de gás foi transferido para um tubo correspondente contendo Caldo Verde Brilhante 2% Lactose. Os tubos foram homogeneizados e incubados durante 24 horas em temperaturas entre 35 e 37°C. Para a análise de coliformes fecais, 1 mL da amostra presente em cada tubo positivo foi inoculada nos respectivos tubos contendo Caldo E. coli, os quais foram homogeneizados e incubados por 24 horas em banho Maria, no âmbito de 44,5 e 45 °C. Após incubação, verificou-se a formação de gás dentro dos tubos de Durhan. 
2.2 Determinação da curva de crescimento: Saccharomyces boulardii - levedura
Inicialmente realizou-se a ativação primaria do meio 01, com a transferência por meio do auxilio da alça do tubo inclinado que apresentava a Saccharomyces boulardii para o meio de ativação, ente realizou-se a incubação em uma temperatura de 30°C, durante um período de 24 horas em um meio com um pH de 6,5. Após isso, realizou-se o segundo procedimento de incubação, em que se realizou-se a transferência de 10 mL do meio 01 que já sofreu o processo de ativação primaria para um segundo meio 01.1, de modo a permanecer em incubação durante um período de 10 a 12 horas em uma temperatura de 30°C e um pH de 6,0.
Então fez-se o terceiro processo de incubação, em que se pegou o incubado anterior e transferiu-se 10 mL do mesmo para mais um processo de ativação, em que se permaneceu por mais um período de 16 a 18 horas novamente a 30°C em um pH de 6,0, que se denomina de meio 02. 
Em um meio 03 que apresenta, 1gL-1 de extrato de levedura, 2gL-1 de (NH4)2SO4, 5 gL-1 de KH2PO4, 0,4 gL-1 de MgSO3.7H2O e 15 gL-1 de glicose com um pH de 6, retirou-se 10 mL de modo asséptico para poder ser utilizado como o branco para a leitura do espectro. Ao realizar a retirada do branco, realizou-se a transferência de 50 mL do meio 02 para o meio 03, em que essa mistura seria deixada em uma estufa durante todo o experimento a uma temperatura de 30°C.
Ao realizar os passos de ativação dos meios e também a inoculação começou-se a realizar as analises do crescimento microbiano, com o auxilio de um espectrofotômetro, de modo a se realizar a coleta da amostra a ser analisada na área de segurança coletando-a partindo-se do meio 03. Esse processo de analise foi realizado em um período de 30 em 30 min durante o período de crescimento, após se atingir o período coletou-se os dados em um período de 2 em 2 horas, e o estagio de queda ou morte dos microrganismos realizou-se as analises de 1 em 1 hora. 
Em todos os dias realizou-se a troca do brando, para assim evitar a contaminação do mesmo, buscando não acarretar em anormalidades na leitura.