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AULA PRÁTICA DE CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA: Agentes reveladores em extratos vegetais 1. Introdução Os procedimentos de extração utilizados no isolamento de compostos a partir de plantas (raízes, flores, folhas, sementes e até caules), são métodos utilizados que requerem tempo de extração elevados. Nos procedimentos realizados, os métodos de extração foram por ultrassom e por Soxhlet, a partir do produto natural marcela, como é conhecida popularmente. A extração por ultrassom é um exemplo de tecnologia limpa (CHEMAT et al., 2011). A extração por ultrassom é um método considerado eficaz na extração dos compostos químicos baseando-se em produtos vegetais. Pode ser realizado em tempos menores quando comparado a outros métodos de extração (DONG et al., 2010). O ultrassom é um processo que usa a energia de ondas ultrassônicas que são transmitidas em frequência superior ao que o ser humano pode ouvir, ou seja, acima de 20,0kHz. As ondas do ultrassom se propagam na matéria, surgindo no meio em que ocorre a propagação ciclos de expansão e compressão no meio. No líquido, estas ondas geram um ciclo de expansão e uma pressão negativa, gerando bolhas ou cavitação (LUQUE-GARCÍA e DE CASTRO, 2003). Para Miguel et al., (1989), outro método utilizado é a extração por Soxhlet é um método contínuo, sendo considerada lixiviação. O método apresenta restrições em relação ao tempo utilizado nas amostras para extração. Neste processo, o solvente extrai o material orgânico presente na amostra, o material orgânico permanece em temperatura próxima ao do ambiente, já o solvente tem sua temperatura aumentada em função das ondas sonoras produzidas, em alguns casos este processo pode sofrer transformações químicas nos compostos extraídos. A temperatura de extração e a natureza do solvente é que vão determinar o poder de dissolução (VALE, 1997). A espécie vegetal utilizada para retirada dos extratos foi a Achyrocline satureoides, popularmente conhecida como marcela. A marcela pertence ao clado das angiospermas, eudicotiledônias, ordem das Asterales e da família Asteraceae. É um arbusto perene com floração característica no mês de março. Apresenta flores amareladas e verdes acinzentadas destacando-se do restante da vegetação (MENGUE, 2001). O uso popular da marcela é como anti-inflamatório, analgésico, calmante, antidiarreico, bactericida, antimicótico, digestivo, relaxante muscular. No óleo essencial são encontrados compostos como o cineol, isognafalina, galangina, alfa-pineno, cimeno, cariofileno, além de flavonóides como a quercetina, luteolina, galangina, saponinas terpênicas, taninos, pigmentos amarelos, resinas, princípios amargos (MENGUE, 2001). 2. Objetivos - Identificar qual o melhor método extrativo para a marcela; - Calcular rendimento de extratos; - Preparar cromatoplacas; - Identificar metabólicos secundários presentes no extrato de marcela. 3. Materiais Amostras vegetais de marcela e boldo do chile Ultrassom Extrator continuo tipo Soxhlet Erlemeyer Becker Cuba cromatográfica Cromatoplacas de sílica gel G 60 UV 254 nm Chapa de aquecimento Tubo Capilar Evaporador rotatório Câmara de Luz Ultravioleta 4. Reagentes CHCl2 Metanol Hexano Acetona Anisaldeído sulfúrico FeCl3 Dragendorff Anisaldeído sulfúrico Etanol Padrões de Cafeína e estigmasterol 5. Métodos A extração ocorreu por dois métodos extrativos. O primeiro foi por banho de ultrassom, onde pesou-se 1,48 gramas do vegetal e adicionou-se 80 mL de etanol 100% em um erlemeyer e então levou-se para o banho de ultrassom onde permaneceu por 4 horas. Após este período, pesou-se um frasco limpo e anotou-se o valor. Filtrou-se a solução para eliminação do vegetal restante e colocou-se no frasco limpo pesado para posterior rotaevaporação em evaporador rotatório. A rotaevaporação é necessária para que ocorra a eliminação do solvente presente na solução. Após a rotaevaporação pesou-se novamente o frasco para realizar o cálculo de rendimento do extrato. O segundo método de extração foi extrator continuo tipo Soxhlet, onde primeiramente foi realizada a montagem do equipamento e adicionou-se 3,4795 gramas do vegetal em um cartucho com 250 mL de etanol 100%. Ligou-se o aquecimento e a extração ocorreu também em um período de 4 horas. Após este período, pesou-se um frasco limpo e anotou-se o valor, onde passou-se a solução para este frasco para posterior rotaevaporação em evaporador rotatório. A rotaevaporação é necessária para eliminação do solvente presente na solução. Após a rotaevaporação pesou-se novamente o frasco para realizar o cálculo de rendimento do extrato. A partir deste momento a metodologia utilizada foi a mesma. Utilizando cromatoplacas recortadas no tamanho de 4 cm de largura e 8 cm de comprimento, descontando 1 cm da parte inferior e superior. Aplicou-se uma alíquota do extrato, com auxílio de um tubo capilar, de marcela por extração de banho de ultrassom (denominado M1) e do extrato de marcela por Soxhlet (denominado M2), além dos padrões estigmasterol e cafeína. A distância de cada ponto foi de 2 cm. Utilizou-se dois sistemas de diluentes diferentes CHCl2:metanol 90:10 e Hexano:acetona 70:30. Colocou-se a cromatoplaca dentro da cuba com o diluente e ao atingir a marca desejada retirou-se da cuba e deixou-se secar em temperatura ambiente. Primeiramente realizou a observação e marcou-se as bandas em câmara UV e após utilizou-se 4 compostos reveladores, sendo eles: Anisaldeído sulfúrico com aquecimento (revelador de esteroides), FeCl3 (revelador de flavonoides), Dragendorff (revelador de alcaloides) e Anisaldeído sulfúrico (revelador de terpenos). 6. Resultados e Discussão Para realizar o cálculo de rendimento dos extratos pelos dois métodos de extração, fez-se necessário pesar o becker vazio e após o processo de rotaevaporação. Os rendimentos dos extratos em gramas para os dois métodos de extração utilizados podem ser observados na tabela 1, onde P1 é o peso do becker vazio e P2 é o peso do becker com o extrato após a rotaevaporação. A diferença é a subtração do P2 pelo P1 e através desta diferença é possível realizar o cálculo do rendimento através da seguinte fórmula: M1 – Extração por Ultrassom M2 – Extração por Soxhlet P1 131,85g 107,56 P2 132,06g 107,84 Diferença 0,21g 0,28g Rendimento 14,19% 8,04% Tabela 1: Rendimentos de extratos em gramas obtidos por dois métodos de extração. Fonte: Autores (2017). Analisando a tabela podemos dizer que o rendimento de extração por ultrassom obteve 14,19% de rendimento de extrato enquanto que a extração por soxhlet obteve um rendimento de 8,04%, mesmo utilizando uma quantidade maior de vegetal. Os compostos presentes na extração da marcela foram flavonoides, alcaloides, além de esteroides. Para a indicação de quais compostos estavam presentes nas amostras foi adicionado diferentes reveladores. Após a etapa de UV e a identificação dos halos a cromatoplaca foi colocada juntamente com FeCl3 aonde foi possível observar através das bandas escuras a presença de flavonoides de ambos os métodos de extração. Já para a identificação dos compostos acaloides a cromatoplaca foi mergulhada em solução de dragendorff aonde foi possível verificar as bandas escuras indicando assim a presença de constituintes alcaloides. Para a presença de compostos esteroides foi utilizado solução de anisaldeido sulfúrico. Podemos observar de um modo mais limpo seguindo a tabela 2. Revelador Resultado M1 Resultado M2 Câmara de UV Negativo para ambos os padrões Negativo para ambos os padrões Anisaldeido sulfúrico com aquecimento Positivo Positivo FeCl3 Positivo Positivo Dragendorffs Positivo Positivo Anisaldeido sulfúrico Negativo Negativo Tabela 2: Compostos secundários identificados na extração da Marcela. Fonte: Autores (2017). Na figura 1 podemos comparar os resultados obtidos pela observação das cromatoplacas para diferentes reveladores. Figura 1: Cromatoplacascom os extratos de marcela e os diferentes padrões nos três reveladores diferentes. 7. Conclusão Pelos resultados obtidos o banho de ultrassom se mostrou mais eficiente para extrair composto alcaloides, isso pode ser explicado pela alta temperatura que o extrator Soxhlet atingiu (78°C) que pode ter danificado esses compostos, diferente do banho de ultrassom que a água se manteve em temperatura ambiente, porém o solvente que esteve em contato com amostra atingiu uma temperatura maior em função das ondas sonoras emitidas pelo ultrassom. Para a extração dos flavonoides, o extrator Soxhlet se mostrou mais eficiente, com extrações em maiores quantidades. Segundo Banjoo e Nelson (2005), a extração por ultrassom apresenta várias vantagens que o tornam um método ideal para a análise de um grande número de amostras, que incluem alta eficiência de extração, redução de custos de equipamentos, facilidade de operação e capacidade de trabalhar com várias amostras simultaneamente. Os solventes utilizados também apresentaram diferença nos resultados, com o Hexano: cetona (70:30) os compostos correram menos tendo um valor de Rf menores, já no solvente CHCl2:metanol 90:10 os compostos correram mais. O valor de Rf foi menor para o eluente hexano:cetona (70:30) devido este ser um solvente mais apolar enquanto que os compostos presentes nos extratos são polares. Os compostos encontrados na planta foram flavonoides, alcaloides e esteroides, esses dados obtidos estão em conformidade com análises de Tietbohl et al., (2010) que demonstraram que a atividade farmacológica do extrato da marcela pode estar relacionada ao teor predominante de compostos fenólicos, notadamente os flavonóides. Dentre as diversas classes de produtos naturais bioativos, os flavonoides - grupo de substâncias polifenólicas - estão em destaque. São notáveis por suas diversificadas ações biológicas, dentre elas a capacidade de agir sobre a inflamação e sobre o sistema imunológico o que lhes confere um enorme potencial farmacológico (COUTINHO, MUZITANO e COSTA, 2009).