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Citogenética Clínica Quando se fala em citogenética humana, se fala sobre as alterações referentes aos cromossomos, são alterações que envolvem estruturas ou quantidades desses cromossomos. A importância de estudar as anormalidades cromossômicas é para ter conhecimento das importantes categorias das doenças genéticas, como perdas gestacionais, deficiências intelectual, malformações congênitas, além de ter importância na patogênese do câncer. Essas anormalidades estão presentes em 1% dos nativivos, 2% de todas as gestações em mulheres acima de 35 anos e metade de todos abortos espontâneos do 1º trimestre. Indicações clínicas para Análise cromossômica • Problemas de crescimento e desenvolvimento precoce: falha no crescimento; malformação múltiplas; deficiência intelectual; Fácies dismófica - baixa estatura;genitália ambígua. • Natimortos e morte neonatal: Incidência de ~10% natimortos e 0,7% nativivos; Incidência de ~10% em crianças que falecem no período neonatal. • Problemas de infertilidade: Mulheres que apresentam amenorreia; Casais com história de infertilidade ou abortos recorrentes (3% a 6%). • Neoplasias: Praticamente todos os cânceres - associados a uma ou mais anomalias • Gestação em mulher de idade avançada: Risco aumentado de anomalias nos fetos de mães com idade > 35 anos Obtendo células para Análise Cromossômica Qualquer núcleo pode ser utilizado para fazer cariótipo, como cultura de sangue periférico, biópsia de pele, linfócitos e medula óssea. Além disso de células obtidas antes do nascimento (células fetais), como aminiócitos (amniocentese) e células das vilosidade coriônicas, sem a necessidade de cultura. Amniocentese é o método de amostragem do fluido amniótico que se insere uma agulha por via transabdominal na cavidade amniótica. Punção das vilosidades coriônicas é o método de amostragem de células coriônicas fetais (tecido fetal que faz parte da placenta) inserindo um cateter através da vagina (transcervical) ou parede abdominal no útero (transabdominal). Cariótipo É a quantidade e o aspectos dos cromossomos eucariotos, ou seja, conjunto completo de cromossomos em uma espécie ou em um organismo individual. Analisa-se o comprimento, posição dos centrómeros, padrão de bandas e qualquer diferença entre os cromossomos. Para realizar a análise: 1- Colheita de 5 ml de sangue e separação 2. Montagem da cultura: - meio de cultura (antibióticos) e soro fetal bovino - Adicionar fito-hemaglutinina (feijão Phaseolus vulgaris), Cultivo em estufa a 37° C, por 72 horas. 3. Bloqueio da divisão celular: - colquicina: impede a formação do fuso mitótico —> acúmulo de metáfases 4. Colheita da cultura: - hipotonização e centrifugação (KCl 0,075M): entumecimento dos linfócitos, eliminação eritrócitos e separação das cromátides. 5. Fixação: metanol: ácido acético (3:1) 6. Coloração: Bandeamento G, C, Q, R 7. Análise microscópica. Identificação Cromossômica A medida que os cromossomos se condensam e tornam-se visíveis durante a divisão celular, certos aspectos estruturais podem ser reconhecidos. Lembrando que só consegue fazer a análise de identificação cromossômica se eles estiverem altamente compactados, isto é, cromossomos metafásicos. O que são reconhecido: - Cromossomos replicados - cromátide irmãs; - Centrômero (constrição primaria). Região a qual as fibras dos microtúbulo se ligam durante a divisão celular - cinetocóro. O mais importante no centrômero são aquelas proteínas (cinetocóro) que darão arcabouço para as fibras de fuso na hora da separação dessas cromátide. - Braço curto: p; Braço longo: q; - Constrição secundária (RON) que sao as regiões organizadoras de nucléolos. - Cromossomos Sexuais e Cromossomos Autossômicos. Como esses cromossomos podem ser organizados: I. Telocêntrico: centrômero na extremidade terminal II. Acrocêntrco: centrômero próximo a extremidade. Exemplos desse tipo: 13, 14, 15, 21, 22 e o Y. III. Submetacêntrico: Braços q e p são desiguais. Exemplos: 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18 e o X. IV. Metacêntrico: Braços q e p aparentemente do mesmo tamanho. Exemplos: 1, 3, 16, 19 e 20. Cariótipo - Bandeamento Diferentes corantes - padrões de bandas especificas para cada Cromossomos. Bandeamento G, C, R, Q. É feito tratamento com tripeira e coloração com Giemsa. As Bandas claras e escuras são intercaladas. Bandas G+ escuras são ricas em Adenina e Timina (são pobres em genes) - heterocromatina. As Bandas G- claras são ricas em Glanina e C. A interpretação e comparação das bandas é muito importante, pois se ao comprar um par, um cromossomo estiver faltando uma banda, é indicativo de graves consequências no fenótipo, porque perde todos os genes que estariam naquela parte da banda. Interpretação de bandas e sub-bandas Exemplo: 12q24.2 (cr 12 braço curto, região 2, banda 4, sub banda 2) Contém 5 genes, ex: NOS1. No exemplo acima indica que no cromossomo 12, braço longo q... termos técnicos 24.2, contem 5 genes, do qual um deles produz óxido nítrico. Assim, se houver deleção dessa parte, não haverá produção dessa substancia. Não existe na eepeéuhumana ngm Bandeamento Q Coloração pela quinacrine mostarda e examinado por microscopia fluorescente. São Bandas brilhantes ou turvas com diferente intensidade de fluorescência. Bandas brilhantes ricas em AT e Bandas opacas ricas em GC. Importância: detecção de deleções, inversões e duplicações em humanos. Bandeamento C Lâminas tratadas por várias lavagens de hidróxido de bário e corados com Giemsa. Coloração de DNA altamente repetitivo (centrômero, heterocromatina constitutiva, telômeros, DNA satélite). * Banda heterocromática aumentada: pode acarretar problemas no pareamento e não disjunção dos cromossomos ou influenciar na expressão de alguns genes, resultando em prole anormal, abortos ou mortes neonatal Bandeamento R Cromossomos aquecidos, antes da coloração, apresentam bandas reversas. Alta temperatura, desnatura proteínas e do DNA de constituição AT-rica, mantendo o DNA GC-rico com a configuração original. Pode ocorrer a utilização tanto de corantes fluorocromos (acridina laranja) como de convencional (Giemsa) - Usado para detector deleções ou translocações que involve regiões dos telômeros, ou cromossomos de difícil coloração em G ou Q. Fluorescent In Situ Hybridization - FISH Técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência, isto é, na prática, nem precisa que esses cromossomos estejam em metáfase. Material (núcleo interfásico ou cromossomos metafásicos): tecidos preservados, tecidos fixados em formol, preparações para citogenética convencional, amostras de sangue periférico, medula óssea e as amostras pré-natais como vilosidade coriônica, líquido aminiótico, sangue fetal e material de abortamento. Sondas centroméricas Sondas de cromossomos inteiro × X × dele.cat deleção NAO:-O Alterações cromossômicas - Cromossomos autossômicos e sexuais Numéricas: • Poliploidias: (adição de lote haploide n) - Triploidia 3n (69 XXX) - Tetraploidia 4n (92, XXXX) • Aneuploidia: (perda ou adição de cromossomos) - Monossomia (2n - 1) - Síndrome de Turner (45,X) - Trissomia (2n + 1) - Down (47 XX ou XY +21), S. Edwards (47XX ou XY +18), S. Klinefelter (47 XXY). Estruturais: • Deleções; • Duplicações; •Translocações (recíprocas ou Robertsonianas); • Inversões; • Inserções. Alterações cromossômicas numéricas Euploidia: - Composição cromossômica normal de um indivíduo - (eu = verdadeiro ou normal; ploide = múltiplo), ou seja, 23 cromossomos. - Gametas haploides e células somáticas diploide são euploides. - Quando ocorre a adição de lote haploide é chamado de Poliploidia ou heteroploidia - (ex: triploidia (3n) e tetraploidia (4n)). - São considerados anormais porque os cromossomos adicionais expressam produtos gênicos extra que provocam anomalias. Triploidia: -Número cromossômico três vezeso número haploide de todos os autossomos e sexuais - 1:10.000 nascidos vivos - Encontrado em 15-18% de todas as alterações cromossômicas - Os recém-nascidos triploides têm múltiplas anormalidades: macrocefalia, dedos doe pés e das mãos fundidos, malformações na boca, olhos e genitais - Não sobrevivem por muito tempo Tetraploidia (4n) – 92,XXXX ou 92,XXYY - Número cromossômico 4 vezes o número haploide: 4 cópias de todos autossomos e sexuais. - Encontrado em 5% de todos os abortos espontâneos. - Incompatível a vida. - Erro mitótico no embrião inicial (todos cromossomos duplicados migram para uma das células filhas) e fusão de dois zigotos diploides. Todas as no cromossomashaplaides a mais . Origem das Euploidias Triploidia: • Dispermia: dupla contribuição paterna na fertilização; fertilização simultânea de dois espermatozoides; Fertilização de um espermatozoide 2n. • Anomalia meiótica: não ocorre disjunção meiótica (erro na meiose I e II); Resultado em um óvulo espermatozoide. Origem das aneuploidias Não disjunção Meiótica - Meiose I Não disjunção Meiótica - Meiose II Cromossomos autossômicos - Síndrome de Down (47, XX, +21 ou 47, XY, +21) - Síndrome de Edwards (47, XX, +18 ou 47, XY, +18) - Síndrome de Patau (47, XX, +13 ou 47, XY, +13) Cromossomos sexuais - Síndrome de Turner (45, X) - Síndrome de Klinefelter (47, XXY) - Síndrome da Trissomia do X (47, XXX) - Síndrome XYY (47, XYY) gametas," mamata gametas faltando eram . erra faltando . . CromossomasMonologas or aquseparados esperaria Síndrome de Down - Única trissomia autossômica que permite a sobrevivência na idade adulta - apesar de poucos chegarem tenham 50 anos. - Incidência: 1/ 800 – dados EUA. - Características: hipotonia, braquicefalia com occipital plano, aspectos faciais dismórficos, pescoço curto, ponte nasal baixa, orelhas de baixa implantação e com aparência dobrada, boca aberta com a língua protrusa, mãos curtas, manchas na íris, 40% tem defeitos cardíacos congênitos - Fatores que podem causar a S. Down: - Predisposição genética; Exposição a radiação; Infecção viral; Níveis anormais de hormonios. A idade materna é o principal fator de risco. < 30 anos 1:1.000; 35 anos 1:400, 40 anos 1:100, > 45 1:25 - 94% das não-disjunções ocorrem na mãe. Por que a idade materna é um fator de risco? 1- Meiose não é completa até a ovulação -Ovócitos I são formados no desenvolvimento embrionário e a meiose I é concluída somente na ovulação, durante este tempo, eventos intracelulares ou agentes ambientais podem aumentar o risco de não disjunção. 2- Seleção materna - embriões cromossômicos anormais normalmente resulta em abortos espontâneos - Esse mecanismo torna-se menos efetivo quando aumenta-se a idade. Causa principal —> Trissomia simples - 95% - não disjunção meiótica materna meiose I =~ 75%. meiose II =~ 25% - meiose paterna II =~ 5% - Translocação robertsoniana rob(14;21) - 4% - ocorre a translocação do 21q - 46, XY + 45,XXrob(14;21) - prole normal - indivíduos com S. Down - prole inviável - Translocação 21q21q – 1,6% - cromossomo composto de dois braços q 95% 4% atirando. ① cooptou normal Oajamdaégevdocoma translocação eram o cromossomo 21 . Síndrome de Edwards (+18) Incidência: 1/6.000 nascimentos. - Sobrevida: 2 a 4 meses. - 95% são abortados espontaneamente. - Características: hipertonia, deformação da mandíbula inferior, pequenos ao nascer, crescem lentamente, punhos cerrados, malformações cardíacas, esterno curto, “pé de cadeira de balanço” - 47,XXouXY,+18~95%dos casos - Trissomias completas ou translocação envolvendo todo ou quase todo o cromossomo 18. Síndrome de Patau (+13) - (47, XY ou XX +13): Incidência: 1/10.000 nascimentos. - 50% dos indivíduos afetados morrem no 1o mês. - Malformações faciais, defeitos oculares, dedos ou dedos extra, malformações do SNC, defeitos cardíacos congênitos, fendas labial e palatina. - Pais de crianças com S. Patau são mais velhos (média de 32 anos) do que os pais que têm filhos normais. - 80% 47, XX ou XY, +13. Síndromes que envolvem cromossomos sexuais Síndrome de Turner (45, X) - Monossomia: Incidência: 1/2.500 sexo feminino. - Resulta em esterilidade feminina. - Características: baixa estatura, peito largo, ovários rudimentares, inchaço das mãos e pés, pode apresentar constrição da aorta, sem retardo mental, pescoço alado. - Cariótipo: - 45, X : 40-60% - mosaicos 45,X/46,XX: 15% - 46,X,i(Xq): 10% - mosaicos 45,X/46,X,i(Xq): 8% - deleções 46,XXq- ou 46,XXp- 6% - outros mosaicos 45,X/? 8% Síndrome de Klinefelter (47, XXY) Incidência: 1/1.000 sexo masculino. - Comprometimento intelectual. - Características: altos e magros, pênis e testículos pequenos, ginecomastia, infertilidade, dificuldade de aprendizagem. - 50% dos casos, cr. X é derivado da mãe Erro meiose I paterna (50%) mosaicismo (15%) = 46,XY/47,XXY Formas variantes: fenótipos + graves 48, XXYY 48, XXXY 49, XXXXY Alterações cromossômicas estruturais Rearranjos estruturais resultam da ruptura dos cromossomos seguida pela reconstituição em uma combinação anormal. São menos frequentes do que aneuploidias. • Balanceados (conjunto cromossômico possui o complemento normal do material cromossômico – normalmente não apresentam efeito fenotípico) - Inversões: Cromossomo sofre duas fraturas é reconstituído - invertido. Não provoca fenótipo anormal (maioria). Apresenta risco de gerar novos gametas. Além disso tem as paracêntricas, que não inclui o centrômero e as rupturas é de um braço do cromossomo). As pericêntricas inclui o centrômero e a ruptura em cada braço. - Translocações (Robertsonianas ou Recíprocas): Envolve a troca de segmentos de dois cromossomos, geralmente não homólogos. Há também translocacoes recíprocas, que sao rupturas de cromossomos não homólogos com a troca recíproca dos segmentos. Geralmente só 2 cromossomos envolvidos - numero total normal. Alto risco de gametas desbalanceado. Balanceadas — Translocações robertsonianas - Ruptura de dois cromossomos acrocêntricos (13, 14, 15, 21 e 22) que se fundem próximo a região do centrômero – consequência = perda dos braços curtos. - Cariótipo 45 cromossomos, sendo 1 cromossomo com os brações longos - Perda dos braços curtos não é deletéria – devido a presença de genes RNA - Inserções • Não-Balanceado (material cromossômico ausente ou adicional) - Deleções: perde segmento resultando em desequilíbrio cromossômico. - Duplicações - Marcadores e cromossomos em anel - Isocromossomos - Cromossomos discêntricos Síndrome do Cri Du Chat (5p-) 46,XX ou XY,del(5p). - 1/50.000 nascidos vivos - Caracterizada por deficiência intelectual (QI médio ~35), microcefalia, hipertelorismo (aumento da distância entre as órbitas), baixa implantação da orelha. Taxas de mortalidade elevada. Choro infantil que se assemelha a do miado do gato. Não - Balanceados Duplicações - Repetição de um segmento cromossômico, causando um aumento do número de genes ou outras sequências . - maioria resultante de crossing over desigual entre cromátides homólogas durante a meiose, produzindo segmentos adjacentes duplicados ou deletados