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Estudo DirigidoEstudo Dirigido Microbiologia Veterinária IIMicrobiologia Veterinária II Universidade Federal do Mato Grosso do Sul Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Gabriela Garcia de Souza RGA: 2018.1201.036-2 Medicina Veterinária "O desenvolvimento de vacinas veterinárias: uma revisão dos métodos tradicionais e abordagens modernas de biotecnologia.” Questão 1Questão 1 Descreva os principais métodos de produção de vacinas de uso veterinário Atualmente, vários tipos de vacina se encontram disponíveis para uso veterinário. De maneira geral, podemos categoriza-las como: vacinas com patógenos vivos, com virulência reduzida por processamento laboratorial, e vacinas recombinantes vetorizadas por um vírus ativo. Ambas simulam uma infecção pelo agente selvagem, sem causar doença. As vacinas inativadas são aquelas em que o agente é previamente inativado, ou pode ser feita com subunidade do patógeno. Cada tipo de vacinas possui vantagens e desvantagens. Considerando as principais doenças virais de cães e gatos, são as vacinas atenuadas que conferem uma resposta imune melhor e mais duradoura, similar à infecção natural, e segundo pesquisas, atualmente há uma tendência à produção e escolha dessas vacinas pelos clínicos veterinários. Vacinas inativadas não necessariamente são mais seguras, porque precisam de adjuvantes para estimular uma resposta imune mais potente, o que pode levar a maior incidência de reações vacinais, em especial o sarcoma associado à injeção. Porém, são interessantes em populações livres da doença, ou em espécies selvagens, pela ausência da possibilidade de reversão da virulência (Richards et al., 2006;Paul etal., 2007). Uma das vacinas mais populares de uso veterinário é a vacina da anti- rábica. Para a produção desta, são utilizados métodos meticulosos que devem atender à legislação vigente presente na PORTARIA N° 228, DE 25 DE OUTUBRO DE 1988, do MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. E vamos utiliza-la como base para descrever os principais métodos de produção. Primeiramente, é necessário que os produtores atendam as exigências citadas na Portaria acima para o controle da produção e comercialização tanto da vacina quanto do soro anti-rábico. As exigências são: Biotério e Infectório: Os laboratórios devem dispor de infectório e dbiotério capaz de supri-los dos animais necessários ao controle de qualidade dos produtos que elaborarem. Contrato de responsável técnico: Os laboratórios que fabricarem vacinas ou soro contra a raiva dos animais estão obrigados a manter, permanentemente um médico veterinário especializado como Responsável/Técnico da preparação e controle destes produtos, devendo o mesmo apresentar documentos que permitam julgar sua habilitação, na forma do Art. 11 do Decreto n° 64.499 de 14 de maio de 1969. Orientação técnica: A Secretaria de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura, quando solicitada e sempre que possível, proporcionará orientação aos responsáveis técnicos dos laboratórios fabricantes de vacinas e soro anti-rábicos, tendo em vista o cumprimento das normas estabelecidas nestas Instruções. Que as instalações/laboratórios que fabricam vacina ou soro contra a raiva de uso veterinário devem, primeiramente, atender o disposto na legislação específica vigente contendo: Quanto à produção das vacinas, é necessária a separação de acordo com os tipos de vacinas, onde são admitidas a fabricação de vacinas anti-rábicas com vírus inativado e com o vírus modificado. Esterilidade - Verificada em meios aeróbios e anaeróbios, com leitura após permanência em estufa a 37°C, durante 7 dias, no primeiro caso e a 20° a 25°C, durante 14 dias, no segundo, bem como semeadura em meio para fungos (Sabouraud Iíquído) a temperatura ambiente durante 14 dias, não devendo haver crescimento de germes de contaminação ou de fungos. Vírus residual - Testada em camundongos adultos e Iactentes: Inocuidade - Testada com a inoculação de 0,5 m1 de vacina em dois grupos de 10 camundongos de 14 a 16 gr., por via intra-peritoneal, bem como, em 05 cobaios de 300 a 400 gr. por via subcutânea e. observar os camundongos durante 14 dias e as cobaios durante 21. dias, os quais deverão permanecer normais. Eficiência - Deve ser comprovada por um dos seguintes testes: Vacina com vírus inativado a) Inoculação de 0,01 ml na diluição de 10-1 em 16 camudongos de (dois grupos de 8) de 4 e 6 dias de idade, por via intra-cerebral. Os camundongos devem permanecer normais, pelo período de 21 dias de observação. b) lnocuIação de 0,03 m1 da vacina pura, bem como na diluição de 10-1 em 20 camundongos (dois grupos de 10) de 11 a 14gr, por via intra-cerebral. Os camundongos devem permanecer normais, pelo período de 21 dias de observação. a) Teste de Habel. - As vacinas preparadas em tecido cerebral devem ser diluídas a 0,5% e as vacinas preparadas em cultura celular a 10.000 antes de vacinar os camundongos. A vacina será considerada eficiente se conferir proteção à inoculação de 10.000 DL50 do vírus "padrão" de prova; b) Método NIH - O poder imunizante da vacina deve ser 0,3 ou mais em relação a vacina de referência, conforme os métodos gravimétrico e volumétrico. Controle de ph - O pH das vacinas inativadas deve estar entre 6.8 e 8.5. Controle de Vácuo - As vacinas anti-rábicas liofilizadas, devem estar sob vácuo total, quando assim forem envasadas. Controle do tempo de reconstituição - Quando adicionado o diluente na vacina anti-rábica liofilizada, o tempo de reconstituição não deve ultrapassar de 60 segundos. Umidade - Nesta vacina quando liofilizada, o teor da umidade não deve ultrapassar de 3%. Validade - A vacina inativada deve ser conservada em temperatura de 2 a 8°C, podendo ser utilizada, ate 12 meses após a data de sua fabricação, quando se tratar de vacina em estado líquido e até 2 anos quando liofilizada. O laboratório produtor estimando que sua vacina possa alcançar validade mais prolongada, deverá demonstrá-la em provas oficiais. Paralelamente o Ministério da Agricultura realizará testes para registro em 3 partidas. Caso as 3 partidas comprovem ser eficientes, serão mantidos os registros. As vacinas que não tiverem resultado satisfatório comprovado, terão seus registros provisórios cancelados após 12 meses. O prazo de validade deve ser contado a partir da data de fabricação do produto. Imunidade - Serão observadas as recomendações do Grupo de Especialistas em Raiva da Organização MundiaI da Saúde, na fixação do período de proteção conferido pelos diferentes tipos de vacina anti-rábicas. c) Teste de proteção em cobaios - Este teste deve ser realizado para as vacinas tipo Formidogel de acordo com o seguinte roteiro: 1- serão escolhidas 20 cobaios do mesmo sexo, de peso entre 300 e 400; 2- 10 cobaios do lote serão inoculadas pela via subcutânea com 1 ml da vacina; 3- os 10 cobaios restantes serão reservados como testemunhas; 4- os 1.0 e os vacinados serão reinoculados com a mesma dose, também por via subcutânea, 7 dias após a primeira vacinação; 5- 14 dias após a segunda vacinação, os 10 cobaios vacinados e os 10 cobaios e testemunhos serão inoculados na coxa, pela via intra-muscular, com uma suspensão de vírus rábico capaz de matar 80% dos cobaios não vacinados; 6- os animais serão observados durante 21 dias após a inoculação, esperando-se que 70% dos vacinados tenham resistido a inoculação do vírus de prova e 80% dos testemunhos tenham morrido com sintomatologia rábica. Esterilidade - A vacina não deverá conter germes de contaminação, quando se tratar de vacina avianizada e antes da adição de antibióticos, deverá ser feito o teste bacteriológico para verificar a presença de Salmonella, bem como semeadura em meios para fungos (Sabouraud líquido) a temperatura ambiente durante 14 dias, não devendo haver crescimento de fungos. Inocuidade - Inocular a vacina reconstituída na dose de 0,5 mI pela via subcutânea ou in1rnperitoneal em 8 camundongos adultos de 11 a 14 gr. Pelo menos 7 dos 8 camundongosdevem sobreviver após 7 dias de observação. Eficiência - Será verificada através do teste de Koprowsky conforme roteiro a seguir: Vacina com vírus modificado (atenuada) A vacina com o vírus modificado não deve conter germes de contaminação, deve ser inócua para a espécie a que se destina e deve ser eficiente. Para fins de comercialização a vacina com vírus modificado deve ser liofilizada. Quanto a vacina Flury, destinada a imunização de cães, poderá ser elaborada com vírus de alta passagem (HEP), mas deverá, também obrigatoriamente, ser elaborada com vírus de baixa passagem (LEP) e comercializada, não só em doses múltiplas como em doses individuais e acompanhadas de diluente. Provas a que deve ser submetida:· a) Serão escolhidos 20 cobaios do mesmo sexo de peso variando entre 300 e 400 gr; b) Toma-se dois frascos da vacina de prova reconstitui-se com água destilada estéril que contenha 2% de soro normal de eqüino (2 mI do diluente em cada dose de vacina), misturam-se os dois frascos da vacina reconstituída, toma-se uma dose e acrescenta-se 18 mI de água destilada com soro normal de eqüino a 2%. Esta diluição será utilizada para vacinar os cobaios; c) 10 cobaios do lote serão inocuIados com 0,25 ml da vacina diluída. pela via intramuscular (no membro posterior direito); d) Os 10 cobaios restantes do lote serão mantidos sem vacinação e separados do grupo vacinado. Controle do pH - O pH das vacinas vivas deve estar entre 6,8 e 7,6. Controle de vácuo - Devem estar sob vácuo total, quando assim forem envasadas. Controle do tempo de reconstituição - O tempo de reconstituição não deve ultrapassar de 60 segundos. Umidade - O teor da umidade não deve ultrapassar de 3%. Antigenicidade (Titulação): Tratando-se de vacina Flury, de baixa passagem (LEP), a sua potência vírica será verificada em camundongos de 3 semanas de idade peIa inoculação de 0,03mI via intracraniana. Será aceita a vacina que atingir pelo menos 103,3 DL50/0,03mI O tempo de observação deve ser de 21. dias. Identificação de vírus - Este teste deve ser usado para a vacina Flury, para verificação de vírus de alta passagem (HEP) ou baixa passagem (LEP) contido na mesma. e) 21 dias após a vacinação, os 10 cobaios vacinados, e os 10 testemunhos serão desafiados pela via intramuscular no membro posterior esquerdo, com uma suspensão de vírus titulado, capaz de matar pelo menos 80% dos cobaios testemunhos; f) Os cobaios serão observados durante 21 dias após a inoculação do vírus de prova; g) Será considerada eficaz a vacina que protege 70% ou mais dos cobaios vacinados contra o vírus que matou pelo menos 80% dos testemunhos. Tratando-se de vacina Flury, de alta passagem (HEP), a sua potência vírica será verificada em camundongos de 4 a 6 dias de idade, pela inoculação de 0,01 mI via intracraniana Para este tipo de vacina o mínimo exigido é de 103,3 DL50/0,01 mI. O tempo de observação deve ser de 21 dias. Tratando-se de vacina de cultivo celular (ERA) não será admitido título inferior a 103,3 DL50/0,03 ml em camundongos de 3 semanas de idade pela inoculação de 0,03 ml via intracraniana O tempo de observação deve ser de 21 dias. A vacina FIury deve ser inoculada em 08 camundongos adultos e 8 lactentes, por via intra-cerebral nas doses de 0,03 mI e 0,01 mI, respectivamente, observando-se durante 14 dias. A vacina contendo amostras Flury HEP, somente mata os camundongos latentes e a Flury LEP, mata ambos camundongos, lactentes e adultos. Validade - As vacinas tipo FIury devem ser conservados em temperatura situada entre 2 a 8ºC, com validade de um ano. Tratando-se de vacina anti-rábica amostra ERA, o prazo de validade será de 18 meses. O prazo de validade, deve ser contado a partir da data de fabricação do produto. O laboratório produtor estimando que sua vacina possa alcançar validade mais prolongada, deverá demonstrá-Ia em provas oficiais correspondentes. Paralelamente o Ministério da Agricultura, realizará testes para registro em 3 partidas. Caso as 3 partidas comprovem ser eficientes, serão mantidos os registros. As vacinas que não tiverem resultado satisfatório comprovado terão seus registros provisórios cancelados após 12 meses. O prazo de validade deve ser contado a partir da data de fabricação do produto. lmunidade - Serão observadas as recomendações do Grupo de Especialistas em Raiva da Organização MundiaI da Saúde, na fixação do período de proteção conferido pelos diferentes tipos de vacina anti- rábicas, das vacinas com vírus inativado. Registros de dados - De cada partida de vacina ou soro fabricado, devem ser registrados os seguintes dados: CONTROLE DA PRODUÇÃO DE VACINAS/SOROS O controle qualitativo e quantitativo das vacinas e soro contra raiva dos animais de fabricação no País deve ser registrado em forma de protocolo, padronizado durante todas as fases de elaboração e os testes de cada partida produzida. Uma via do protocolo deve ser remetida ao Serviço de Defesa Sanitária Animal através da Delegacia Federal de Agricultura da Jurisdição. a. nome do produto; b. número da partida; c. material usado da fabricação; d data do início e fim da fabricação; e. número de doses produzidas e liberadas; f. resultado das provas empregadas, e; g. data da liberação para embalagem; h. quanto ao nome do produto, as vacinas devem ser indicadas pelo nome oficial (Vacina anti-rábica ou contra raiva), seguido pelo nome comercial, quando assim for desejado e nunca o contrário. Lotes mínimos de produção: - Vacinas com dose individual - O lote mínimo de produção de cada partida ser de 5.000 doses. - Vacina com dose múltipla - O lote mínimo de produção de cada partida deve ser de 50.000 doses. Fiscalização da produção - Os laboratórios produtores devem proporcionar todas as facilidades para acesso imediato aos setores de produção e controle da vacina e do soro, aos técnicos oficiais designados para fiscalizar as atividades dos mesmos. Caso ocorra impedimento ao exercício da ação fiscalizadora do representante do Governo, provocado pelo laboratório, será suspensa ou cancelada a atividade do estabelecimento, independente da aplicação de outras sanções previstas na legislação vigente. Coleta e remessa de amostras - De acordo com as diretrizes especificadas nas instruções para coleta e remessa de amostras de produtos para controle de qualidade oficial. Fornecimento dos Animais - Os laboratórios produtores estão obrigados a fornecer os animais necessários aos testes de inocuidade e eficiência do produto quando programados pelo órgão oficial de fiscalização, cabendo-lhes, inclusive, fornecer os meios para manutenção dos animais durante as provas. Realização dos testes: Pelo laboratório produtor - O laboratório produtor deve realizar todos os testes com as vacinas anti-rábicas e remeter os correspondentes resultados à Unidade de Controle Oficial, mediante protocolo em modelo padronizado.- Pela unidade de controle oficial - Toda partida de vacina anti-rábica produzida pelos laboratórios particulares ou oficiais deve ser submetida aos testes pela Unidade de Controle Oficial. Do resultado dos testes: De acordo com as diretrizes especificadas nas instruções para coleta e remessa de produtos para controle de qualidade oficial.· Produtos importados: A firma importadora deve comunicar ao órgão competente do Ministério da Agricultura na Jurisdição, o dia e a hora da chegada da vacina anti- rábica ou do produto bruto importado, com antecedência de 10 (dez) dias. Controle da produção - O controle das diversas fases de elaboração de cada partida de vacina e/ou soro, deve ser realizado pelo laboratório produtor, sob a supervisão do Órgão Oficial de Fiscalização. O laboratório será obrigado a comunicar à Delegacia Federal de Agricultura, o dia e a hora do início de cada partida com antecedência de 48 horas Nos impressos das vacinas com vírus modificado, devem constar obrigatoriamente, que não podem ser utilizadas em animais silvestres. Questão 2Questão 2 Quais são as abordagensbaseadas em técnicas modernas de biotecnologia? As vacinas de primeira geração: Representam aquelas que empregam na sua composição o agente patogênico na sua constituição completa, mas submetido a tratamentos que levam à inativação ou à atenuação dos micro-organismos. Nessa categoria, também deve ser destacada a estratégia em que micro-organismos não patogênicos derivados de outros hospedeiros são utilizados como antígenos para vacinas voltadas para o controle de doenças causadas por patógenos assemelhados. Essa abordagem é bem exemplificada pelas vacinas da varíola, baseada em vírus vaccínia isolados de bovinos, e da vacina contra a tuberculose que também emprega uma bactéria originalmente obtida em bovinos, o Mycobacterium bovis (BCG). Nesse grupo, destacam-se também as vacinas voltadas para a prevenção da coqueluche ou pertússis (vacinal celular), as vacinas contra varíola, poliomielite, sarampo, rubéola, adenovírus, entre outras, As vacinas da segunda geração: Surgiram com a noção de que, em alguns patógenos, a proteção vacinal pode ser obtida após a indução de anticorpos voltados para um único alvo, como uma toxina, responsável pelos sintomas da doença, ou açúcares de superfície que permitem ao sistema imune do hospedeiro neutralizar e eliminar bactérias que de outra forma se propagariam rapidamente antes de serem notadas por nossas principais linhas de defesa imunológica. Nesse grupo, destacam- se vacinas acelulares que empregam toxoides (toxinas purificadas e inativadas por tratamento químico), proteínas e polissacarídeos purificados, como as antitetânica, antidiftérica, hepatite B e as vacinas voltadas para o controle da meningite meningocócica e da pneumonia. A história das vacinas e sua aplicação na prevenção de doenças infecciosas acumulam mais de 200 anos de dedicação e muito trabalho. Tendo sua história iniciada pela genialidade de médicos e pesquisadores, como Edward Jenner e Louis Pasteur, observa-se nessa área um belo exemplo do reducionismo aplicado à prática médica. Desde as primeiras vacinas baseadas em patógenos, sejam eles bactérias ou vírus, atenuados ou inativados, muito reativos e, em alguns casos, pouco eficientes, a pesquisa vacinal moveu-se na direção de empregar frações cada vez menores desses patógenos na busca de aumentar a segurança sem comprometimento da eficácia. Dessa forma, é comum classificarmos as vacinas em três grandes grupos (ou gerações) em razão das estratégias ou dos conceitos utilizados na preparação do princípio ativo, os antígenos vacinais As vacinas da terceira e mais recente geração: Partem de um conceito inovador que as diferenciam de uma forma radical das outras gerações vacinais. Nessas vacinais, emprega-se a informação genética do patógeno responsável pela codificação de proteínas que representem antígenos relevantes para a proteção. Em geral chamadas de vacinas de DNA ou gênicas, as vacinas de terceira geração foram descobertas de forma empírica no começo da década de 1990 em testes inicialmente voltados para a pesquisa de terapias genéticas em que se introduzem no hospedeiro genes que substituirão a informação genética defeituosa originalmente presente no indivíduo. As vacinas de DNA surgiram como resultado dos avanços biotecnológicos em DNA recombinante. A informação genética, responsável pela codificação de antígenos com aplicação vacinal, é clonada e propagada em linhagens deEscherichia coli, um habitante inofensivo de nossa microbiota intestinal. O procedimento de produção é relativamente simples e menos oneroso do que aquele envolvido na obtenção de proteínas recombinantes. Além disso, algumas características de modulação de resposta imune das vacinas de DNA tornaram-nas um instrumento valioso para o desenvolvimento de vacinas com características terapêuticas. Sem dúvida, mais do que uma vacina específica, as vacinas DNA representam uma forma alternativa de desenvolver imunoterapias viabilizadas graças à introdução das técnicas de DNA recombinante à pesquisa vacinal. O advento da biotecnologia moderna, em particular a disseminação das técnicas de manipulação genética, alterou de diferentes maneiras a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas, sejam elas de primeira, segunda ou terceira geração. Por meio de estratégias de clonagem gênica e mutagênese, podemos gerar micro-organismos atenuados (vírus e bactérias) de forma precisa e com mais segurança. Patógenos atenuados empregados nas vacinas de primeira geração podem reverter ao estado nativo virulento. Como, em muitos casos, não se conhece a natureza da alteração genética sofrida pelo microrganismo durante a atenuação, a possibilidade de reversão à virulência, embora pouco provável, é uma realidade. As técnicas atualmente disponíveis para manipulação genética permitem obter, com relativa facilidade,mutantes atenuados nos quais genes envolvidos com a patogenicidade ou metabolismo primário são inativados de forma a não comprometerem a viabilidade do organismo, mas torná- los incapazes de causar doença. No entanto, os custos elevados envolvidos nos testes clínicos e o uso consagrado de determinadas formulações, como os vírus da poliomielite, sarampo, febre amarela, a bactéria Mycobacterium tuberculosis, entre outros, diminuem o interesse de indústrias e laboratórios em investir nessas novas formulações vacinais; Com o aprimoramento das técnicas de produção de proteínas recombinantes por meio de sistemas de expressão heteróloga, bactérias, leveduras, células de mamíferos e insetos são usados como fonte para os antígenos a serem incorporados nas formulações vacinais. De fato, a fronteira da vacinologia que hoje recebe mais investimentos e desperta interesses tanto pela segurança de uso como no retorno financeiro está calcada na geração de vacinas de subunidades que utilizam antígenos recombinantes.. Questão 3Questão 3 Exemplifique vacinas em uso que utilizam métodos de biologia molecular. Contra o vírus do Nilo Ocidental (WNV) em cavalos, desenvolvida pelo Center for Disease Control and Prevention and Fort Dodge Laboratories, licenciada em 2005 nos Estados Unidos, visando a proteção contra a doença. Vírus da necrose hematopoética infecciosa em salmão, desenvolvida pela Novartis, licenciada em 2005 no Canadá, visando a melhorar o bem-estar animal e aumento da quantidade e qualidade dos alimentos. Tratamento do melanoma em cães (neoplasia maligna), desenvolvida pela Merial, com licença condicional nos Estados Unidos desde 2007, visando o tratamento de formas agressivas de câncer de boca, leito ungueal, coxins plantares ou de outras áreas como uma alternativa à radiação e cirurgia. Terapia relacionada à liberação hormonal do fator de crescimento em suínos, desenvolvida pela VGX Animal Health, licenciada em 2007 na Austrália, visando o aumento do número de leitões desmamados, diminuindo significativamente mortalidade e morbidade perinatal. Até 2015, foram licenciadas quatro vacinas de DNA, que utilizam métodos de biologia molecular, para uso veterinário. São elas: Questão 4Questão 4 Explore as vantagens e desvantagens ( potenciais efeitos adversos) de vacinas baseadas em mRNA. Vacina para Toxoplasma gondii - A imunização de camundongos com os No caso de vacinas que utilizam mRNA, o RNA mensageiro (mRNA) que codifica proteínas virais de interesse é produzido in vitro e incorporado em lipossomos ou em micropartículas. A inoculação dessas partículas ou lipossomos no animal resulta em transporte do mRNA para o interior das células, onde ocorre a tradução e produção da proteína. Esta proteína é, então, apresentada ao sistema imunológico, resultando em estimulação de resposta humoral e celular. As vantagens são que vacina poderá ser aplicada para prevenir qualquer doença infecciosa seja ela virótica, bacteriana e parasitária, sem a menor possibilidade de reversão. Além disso, é uma vacina que poderá ser usada em qualquer país do mundo porque é estável em temperatura ambiente, o que facilita a sua distribuição em Estados e países de difícilacesso, os quais são os locais onde há alta incidência de doenças infecciosas. Uma das principais desvantagens inicialmente observadas é a baixa imunogenicidade frequentemente observada em antígenos recombinantes seria uma desvantagem a ser explorada, e ocorre devido à falta de componentes ativadores imunes exógenos. Outra desvantagem seriam os desafios na captação e expressão celular adequadas, a persistência de longo prazo do imunógeno, o risco de integração no genoma do hospedeiro não completamente excluído e a produção instável e bastante cara. Outra dificuldade para as vacinas de mRNA foi a instabilidade inerente das moléculas, resolvida através de modificações químicas nas bases de mRNA. Os potenciais efeitos adversos puderam ser observados em vacinas que ainda se encontram em estudo/desenvolvimento, tais como: plasmídeos contendo os genes que codificam as proteínas GRA1, GRA7 e ROP2 de Toxoplasma gondii induziu imunidade protetora parcial contra desafios letais. Na linhagem de camundongos C3H a razão Ig2a/IgG1 foi maior quando comparada às linhagens BALB/c e C57BL/6 de camundongos. Coincidentemente, a porcentagem de proteção contra desafios letais com cistos de T. gondii foi maior em camundongos da linhagem C3H. (VERCAMMEN et al.,2000). Vacina para Taenia solium- A vacina para Taenia solium a imunização com DNA plasmidial contendo o gene do antígeno B de Cisticercus cellulosae conferiu 92,6% de proteção quando os suínos foram desafiados com ovos de Taenia solium. Quatro de cinco animais imunizados com 1000 mg de plasmídeo recombinante e desafiados não apresentaram cistos viáveis de cisticercose. Entretanto, a imunização com 200 mg de plasmídio recombinante não foi capaz de impedir a formação de cistos viáveis. (GUO et al., 2007). Vacina de Anaplasmose - A vacina de DNA contra a anaplasmose bovina tem sido investigada com diferentes proteínas de superfície (MSPs). O gene (msp1a) que codifica MSP1a do Anaplasma marginale foi inserido no plasmídeo pVCL, vetor de células de mamíferos. A soroconversão, após a inoculação de camundongos e de bovinos com o DNA plasmidial contendo o gene msp1a, foi demonstrada após 21 dias e seis a oito semanas, respectivamente. Em bovinos a produção de imunoglobulina foi restrita ao isotipo IgG1, embora a estimulação de linfócito T auxiliar também foi verificada com a produção de IFN-g. (ARULKANTHAN et al., 1999). A imunização de bovinos utilizando apenas o gene que codifica a MSP1b em plasmídeo de expressão para células de mamíferos, não estimulou satisfatoriamente a produção de anticorpos no período de vacinação, mostrando a necessidade de mais estudos para o desenvolvimento de uma vacina. https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS- 9C5J4G/1/monografia_completa_em_pdf.pdf https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103- 40142010000300003 http://sistemasweb.agricultura.gov.br/sislegis/action/detalhaAto.d o?method=visualizarAtoPortalMapa&chave=58090151 http://www.diaadiaeducacao.pr.gov.br/portals/cadernospde/pdeb usca/producoes_pde/2016/2016_artigo_bio_unioeste_mariaapare cidacostadeoliveiracaldeira.pdf http://www.celeres.com.br/contexto-historico-e-inovacoes-em- biotecnologia-agricola/ https://cic.unifio.edu.br/anaisCIC/anais2016/pdf/10_04.pdf https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452072117300 667 BibliografiaBibliografia