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3 1 INTRODUÇÃO Estima-se que uma pessoa adulta possua 10 trilhões de células que são originadas de uma única célula, o zigoto (junção do óvulo com o espermatozoide). Células são “geradas” de outra célula viva por meio de uma sequência de alterações denominadas de divisão celular. Na primeira sequência de alterações, o material genético é duplicado e, em seguida, dividido em partes iguais para cada célula-filha. Esse processo nos eucariontes é rigidamente monitorado a cada etapa da divisão para garantir que duas células idênticas sejam formadas (uma vez que o surgimento destas auxilia no crescimento, desenvolvimento e manutenção do organismo) (MAILLET 1982). O ciclo de divisão celular pode ser, basicamente, dividido em dois: a interfase e a mitose. A interfase está subdividida em três estágios: a G1, S e G2; já a mitose é dividida em seis estágios: prófase, pró-metáfase, metáfase, anáfase, telófase e citocinese (MAILLET 1982). A interfase é o período mais demorado da divisão celular em comparação ao período mitótico. Quando a célula recebe um sinal para a divisão celular, ela começa a sintetizar e dobrar a quantidade de todos os seus componentes, a fim de proporcionar às duas células-filhas que surgiram um tamanho e composição aproximadamente iguais (CARVALHO et al, 2013). A G1 tem um período de tempo muito variável, de normalmente 3 a 4 horas, mas pode chegar a meses ou anos. Em algum momento da G1 a célula recebe estimulo para se dividir; esses estímulos promoverão diversas reações em cascata, levando à todos os componentes necessários para os eventos da divisão celular. Na hora que a G1 está “passando” para a fase S, ocorre a duplicação do centrossomo (uma espécie de “cetro organizador” de microtúbulos e está localizado próximo no núcleo); duplicando, garantirá que ambas células- filhas possuirão um centrossomo (CARVALHO et al, 2013). Na fase S acontecerá a duplicação do DNA, fazendo com que as células- filhas possuam o mesmo material da célula-mãe. Por exemplo, um indivíduo humano (diploide), possuí 23 pares homólogos, neste momento, possuíra o dobro (ou seja, 46 pares homólogos) para, posteriormente, realizar a divisão de maneira igual (CARVALHO et al, 2013). 4 A subfase G2 realiza a verificação do DNA e do volume celular - para averiguar se todo o processo de duplicação ocorreu corretamente. Essa fase tem duração média de 2 a 5 horas (CARVALHO et al, 2013). O início da condensação da cromatina caracteriza a prófase; a fragmentação do nucléolo, sua dispersão para lados opostos da célula e a formação de alguns filamentos também é observada nessa fase (CARVALHO et al, 2013). Na pró-metáfase encontramos a cromatina mais condensada e os filamentos com uma espessura mais grossa, porém o não é mais possível visualizar o nucléolo. Ainda na pró-metáfase algumas organelas e o envoltório que envolve o núcleo são fragmentados em pequenas vesículas (CARVALHO et al, 2013). A fase em que a cromatina, mas se condensa é a metáfase. Os filamentos exercem uma grande tensão que leva os cromossomos a assumirem uma posição de “equilíbrio” espacial dentro da célula. Essa força de atração só é desfeita na passagem da metáfase para a anáfase; nesta etapa um complexo proteico chamado APC (complexo promotor da anáfase) que realiza a promoção da adição peptídeo de ubiquitina em uma proteína denominada securina. A securina é responsável por manter inativa uma enzima chamada separasse – realizadora da separação das cromátides-irmãs (CARVALHO et al, 2013). Assim que as cromátides-irmãs se separam começa a anáfase. Nesta fase é garantido que as duas células que posteriormente serão geradas tenham o mesmo número de pares de cromossomos (CARVALHO et al, 2013). Na telófase é feita a reestruturação do envoltório do núcleo e de materiais que estão dispersos pelo citosol. Essa reestruturação só acontece depois da desfosforilação das lâminas. As vesículas constituintes do envoltório nuclear irão se fundir ao redor dos cromossomos, fazendo com que a lâmina nuclear se reorganize e reconstrua o núcleo. As organelas membranosas serão reconstruídas e distribuídas no citosol também nessa fase (CARVALHO et al, 2013). Em estágio de citocinese ocorre a divisão citoplasmática de modo igualitário, garantindo que as duas células contenham um núcleo e materiais celulares em quantidades suficientes (CARVALHO et al, 2013). 5 2 OBJETIVO 2.1 Objetivo geral Preparar uma lâmina histológica de meristema de raiz de cebola para a observação e identificação de células em interfase e das fases da mitose. 2.2 Objetivo específico Identificação das células em interfase e fases da mitose através da observação em microscópio óptico de raiz de cebola. 6 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 MATERIAIS • Água destilada • Álcool acético • Béquer com água • Estante • Garra de madeira • Gilete • Lâminas • Lamínulas • Lamparina • Microscópio óptico • Orceína acética • Palito de dente • Papel absorvente • Pedaços de papel filtro • Pincel • Placas de petri • Pontas de raiz de cebola • Solução álcool-éter • Tubo de ensaio 3.2 MÉTODOS Utilizando uma gilete, a raiz da cebola foi retirada, e em seguida, mergulhou-se as raízes retiradas em placa de petri que continha a solução de álcool acético e permaneceu-se nessa solução por aproximadamente dez minutos. Com cuidado, foram retiradas as raízes com o auxílio de um pincel e lavou-se o mesmo com água destilada. Após essa etapa as raízes deveriam ser colocadas em um tubo de ensaio junto a uma solução de orceína acética 1% que 7 tem como função manter a integridade das estruturas celulares e corar os cromossomos. Em seguida, utilizando a chama de lamparina, o tubo de ensaio foi passado algumas vezes sobre a chama, sem deixar muito tempo em contato com o fogo evitando desta forma causar danos na estrutura celular. Utilizando um pincel, a raiz da cebola foi colocada numa lâmina e com a gilete foi seccionada a extremidade onde localiza-se o meristema (três milímetros) o qual foi utilizado na análise, o restante da raiz foi descartado. Colocou-se o meristema sob a lâmina, logo após pingou-se uma gota de orceína acética sobre o meristema seccionado e com muito cuidado, cobriu-se o material com a lamínula e com a ajuda do papel filtro cobriu-se a lamínula e suavemente pressionou-se com o polegar o material, e através do microscópio óptico foi observado as fases da mitose. 8 Interfase Anáfase 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO As fases mitóticas interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase puderam ser observadas com a utilização do microscópio óptico pela lente azul, conforme podem ser observadas abaixo na figura 1. Com base nas fases identificadas, pôde-se ser feito uma estimativa de frequência de células em interfase e em divisão no tecido meristemático, que apresentaram interfase 30 células, prófase 20 células, metáfase 1 célula, anáfase 1 célula e telófase 1 célula. Figura 1 – Fases da mitose observadas Fonte: Acervo dos autores Prófase Metáfase Telófase 9 Após a análise feita pelo o microscópio e a identificação de cada fase da mitose, foi feito uma estimativa de frequência de cada fase da divisão nas células em divisão, contado 20 células e dentre essas 20 células apresentaram 10 interfases, 6 prófases, 1 metáfase, 1 anáfase, e nenhuma telófase. Esses dados, podem ser observados abaixo no gráfico 1. Gráfico1 – Estimativa de frequência de cada fase da divisão nas células em divisão. Legenda: Eixo Y: Quantidade de células contadas / Eixo X: Fases da Mitose – Interfase 10 células, Anáfase 1 célula, Prófase 6 células, Metáfase 1 célula e Telófase 0 célula. Por ser a maior etapa e corresponder a 95% da divisão celular foram encontradas em maior quantidade células em interfase e prófase, pois são as fases mais demoradas da divisão celular, conforme o gráfico 1. Na fase da metáfase os cromossomos permanecem parados por um longo tempo, enquanto isso, no citoplasma, verifica-se intensa movimentação de partículas e organelas, que se dirigem equitativamente para polos opostos da célula, onde foram encontradas somente uma célula e na anáfase que é uma etapa muito breve, começa bruscamente com a separação simultânea de todos os cromatídeos pelos centrômeros, cada cromatídeo toma agora para si a designação de cromossoma, foram encontrados também somente uma célula, devido ao seu tempo. Já a fase telófase é a última fase da divisão e foi observado em menor 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Interfase Prófase Metáfase Anáfase Telófase C él u la s Fases da Mitose 10 quantidade, porém ela se trata da fase onde há formação do fragmoplasto e as membranas das vesículas do complexo de Golgi se fundem e originam as membranas plasmáticas das futuras células (SNUTAD, 2008). Como foi visto, a mitose é um processo de grande importância para os vegetais, é um processo contínuo pois faz parte do ciclo celular que começa e acaba em G1. Sucede á interfase incluindo as etapas de prófase, metáfase, anáfase e telófase e é sucedida pela citocinese onde ocorre a divisão citoplasmática de modo igualitário, garantindo que as duas células contenham um núcleo e materiais celulares em quantidades suficientes (RAVEN et al, 1996). A mitose ocorre também em células animais, porém, com algumas diferenças como, por exemplo: nas células vegetais ela ocorre sem os centríolos e são nos centrossomos que são irradiadas as fibras de fuso, e, outra grande diferença notada é na citocinese da célula vegetal não ocorre o estrangulamento já que as mesmas têm parede celular e o que acaba ocorrendo é uma aglomeração de vesículas que se unem e formam uma parede onde são separadas as células filhas (SADAVA, 2009). Foram observadas células presentes no meristema que é um tecido vegetal responsável pelo crescimento da planta e pela formação de outros tipos de tecidos vegetais, ele se trata de células que contém poucos vacúolos, e tem parede celular delgada, ou seja, mais fina que as outras, além também de possuir citoplasma denso, organelas dispersas e um núcleo proeminente. Tais características são de células com intensa divisão celular, o meristema tem a função de desenvolvimento e crescimento, e, por isso é o tecido mais indicado para observação mitótica. Todos os tipos de células que compõem uma planta tiveram origem a partir de tecidos meristemáticos, essas células passam por muitas divisões como as já citadas, e dessa forma, multiplicam-se promovendo o crescimento do vegetal. Em comparação, nas células animais de seres adultos, a observação mitótica é feita em maior frequência em tecidos epiteliais, onde ocorre maior divisão celular, já as células animais mais especificas como as nervosas e as musculares não se dividem, portanto, não há observação mitótica (RAVEN et al, 1996). Para a observação ocorrer a célula precisa ser mergulhada na solução de orceína acética que têm como função manter a integridade das estruturas celulares e corar os cromossomos, quando aquecida apressa a coloração e, 11 principalmente, distende os cromossomos facilitando tal visualização, sem essa solução não seria possível a observação das fases da mitose, nem tão pouco obter tais resultados (RAVEN, 1996). Portanto, pôde-se conhecer e observar todas as fases da mitose em divisão celular nas células vegetais da cebola, porém, a mitose ocorre em células animais e vegetais e são responsáveis pelo crescimento, todas as fases foram reconhecidas e notou-se, comparando com demais resultados discutidos que as células em interfase e prófase estão sempre em maior número, e como já dito são as fases mais complexas e demoradas. Toda a observação foi feita em microscópios ópticos encontrados nos laboratórios da UMC, com a utilização dos demais materiais, através do que foi observado e com a ajuda da literatura criou- se resultados, imagens, gráficos e conhecimentos referentes ao assunto que foram expressos neste relatório. 12 5 CONCLUSÃO Conclui-se que a mitose do meristema da cebola é ativa com a função de dar origem a novas células e é responsável pelo crescimento e desenvolvimento do vegetal. Foi possível identificar na lâmina através do microscópio todas as fases do ciclo de divisão celular, algumas em maiores quantidades e outras em menores quantidades como foi demonstrado nos resultados obtidos, este procedimento enfatizou a grande importância do processo de mitose nas células vegetais e consecutivamente nas células animais também. 13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CARVALHO, Hernandes F.; RECCO-PIMENTEL, Shirlei Maria. A Célula. 3ª ed. Barueri, São Paulo: Manole, 2013. p. 422. Fundamentos da Genética / D. Peter Snustad, Michael J. Simmons. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. Biologia / José Mariano Amabis, Gilberto Rodrigues Martho. São Paulo: Moderna, 2004 MAILLET, Marc. Manual de Biologia Celular. São Paulo: Masson, 1982. Raven, P.H., Evert, R.F. e Eichhorn, S.E. Biologia Vegetal, 5a ed. Guanabara Koogan, 1996. REECE, Jane B.; WASSERMAN, Steven A.; URRY, Lisa A.; CAIN, Michael L.; MINORSKY, Peter V.; JACKSON, Robert B. Biologia de Campbell. 10 ed. Porto Alegre: Artmed, 2015. SADAVA, David; HELLER, Craig; ORIANS, Gordon H.; PURVES, William K.; HILLIS, David M. Vida: A Ciência da Biologia, volume 1 - Célula e Hereditariedade. 8 ed. Porto Alegre: Artmed, 2009.