Relatório aula prática Microbiologia

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FACULDADE REBOUÇAS DE CAMPINA GRANDE
CURSO DE FARMÁCIA
Andreza de Souza Brito
Maeli Priscila Alves Gama
Verônica Kely da Silva
Willma Gerlanny Alves da Silva
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA 
MICROSCOPIA E TÉCNICAS DE COLORAÇÃO, BACTERIOSCOPIA, COLORAÇÃO DE GRAM E PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO, TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO E PROVAS BIOQUÍMICAS (INDICADOR DE BACTÉRIAS FERMENTADORAS DE LACTOSE) E CATALASE POSITIVAS.
 
Trabalho da disciplina de Microbiologia do curso de Farmácia da Faculdade Rebouças para complementar a nota, sob orientação da professora Valeska Silva Lucena.
1. INTRODUÇÃO
A visualização de um microrganismo só pode ser feita através de um microscópio, já que são formas de vidas minúsculas, estão presentes em diversos locais e passam despercebidos. A microscopia tem a finalidade de detectar e identificar preliminar ou definitivamente os microrganismos.
Os métodos utilizados para microscopia são:
Microscopia de campo claro, é utilizada uma fonte de luz, que ilumina o material analisado; um condensador, que concentra a luminosidade sobre o material; e um conjunto de lentes, lente objetiva e lente ocular, que amplia a imagem das estruturas.
Microscopia de campo escuro, o condensador impede que a luz ilumine diretamente o local. Apenas uma luz oblíqua e dispersa atinge o material a ser visualizado, passando pelo sistema de lentes, fazendo com que o material fique iluminado contra um fundo preto.
Microscopia de Contraste de Fase, permite uma melhor visualização das estruturas internas do microrganismo, na medida em que os feixes paralelos de luz são desviados ao passar através de objetos com diferentes densidades.
Microscopia de Fluorescência, alguns compostos denominados “fluoróforos” são capazes de absorver luminosidade de baixo comprimento de onda, e então emitir energia em um comprimento de onda superior visível. Esse processo envolve uso de corantes fluorescentes nos microrganismos e posterior visualização destes em um microscópio fluorescente especialmente projetado.
Microscopia Eletrônica, são utilizadas espirais magnéticas no lugar de lentes. A ampliação e resolução são drasticamente melhores na microscopia eletrônica, chegando a visualizar inclusive partículas virais – sendo a única microscopia capaz de visualizar esses patógenos. As amostras são geralmente coradas ou revestidas com íons metálicos para criar contraste.
Os meios de cultura podem ser divididos em: meios enriquecidos não seletivos, meios seletivos, meios diferenciais e meios especializados.
Os meios seletivos e diferenciais são utilizados para isolar organismos específicos, os meios são suplementados com substâncias que inibem o crescimento de microrganismos indesejados, já os meios enriquecidos não seletivos são projetados para permitir o crescimento da maioria dos microrganismos que não precisam de nutrição adicional para crescer.
1.2. Microscopia
O microscópio óptico é dividido em duas partes, mecânicas e ópticas. A parte óptica é composta por: Lente ocular, que ampliam a imagem formada pelas objetivas, ajustando possíveis deficiências ópticas. Sua capacidade de aumento gira em torno de 10x a 15x; Objetiva, que é um conjunto de lentes que se sobrepõem, ampliando a imagem do objeto observado, geralmente, um microscópio tem três ou quatro lentes objetivas, proporcionando poderes de aumento que variam de 4x, 10x, 40x e 100x; Condensador com diafragma que são responsáveis pela uniformidade da iluminação e redução ou ampliação da região a ser iluminada; Lâmpada embutida que é a fonte de luz do sistema. Enquanto a parte mecânica é composta pelo: Pé ou base que trata-se do apoio e do ponto de fixação do microscópio; Braço ou coluna está fixado à base e serve de estruturação para o restante do aparelho de microscopia; Platina ou mesa serve como apoio para o material a ser observado, possui uma passagem de vidro por onde os raios de luz atravessam e também é dotada de parafusos dentados permitindo o deslocamento do material pela mesma; Tubo serve de suporte para as lentes oculares. Parafuso macrométrico por sua vez é responsável pelos movimentos verticais e sutis da mesa, permitindo aperfeiçoar a focagem; revolver utensílio giratório que tem como função portar as lentes objetivas. Objetivas são um sistema de lentes com diferentes aumentos e seu número varia de acordo com o microscópio. Charriot é responsável pela movimentação lateral da lâmina em observação, sendo possível analisá-la de forma totalitária, é o dispositivo que permite movimentar a lâmina nos dois eixos, pois possui dois controladores dispostos um sobre o outro, lateralmente à platina promovendo a movimentação da peça. O controlador de diâmetro menor (“x”) permite o deslizamento da lâmina para esquerda e direita e o controlador de diâmetro maior (“y”) permite o deslizamento para frente e para trás. Platina, é o suporte onde será colocada a lâmina. A platina pode ser levantada ou baixada para regular o foco, utilizando-se os parafusos macro e micrométrico. No microscópio a lente objetiva fica instalada bem próxima ao objeto que se observa. Já a lente ocular fica bem próxima do olho do observador. Corantes básicos, do tipo catiônicos, cromóforo com carga positiva, são os mais usados pois as superfícies celulares apresentam em geral cargas negativas. Alguns exemplos de corante são: Azul de metileno, Cristal de violeta, Safranina, Verde malaquita, Fuscina básica.
2. Prática – Bacterioscopia
 2.1. OBJETIVO
Fazer esfregaços a partir de diferentes materiais;
Fixar os esfregaços de forma adequada;
Identificar os esfregaços de forma adequada;
Diferenciar uma bacterioscopia proveniente de cultura mista de uma cultura pura.
2.2. MATERIAIS
· Bactérias em cultura líquida (tubos)
· Bactérias em cultura sólida (placas)
· Lâminas
· Alça de platina
· Bico de Bunsen
· Tela de amianto
· Tripé
· Swab
· Lápis de retroprojetor preto ou azul
· Lápis grafite
· Algodão
· Gase
· Tesoura
· Cordão
2.3. MÉTODOS
 Em uma placa de petri estava cultivada as bactérias, ligamos o bico de Bunsen e em seguida abrimos a placa de petri com uma distância de 10 cm do bico de Bunsen e com auxílio de uma alça de platina pegamos as colônias puras de bactérias esfregamos na lâmina com movimentos circulares de dentro pra fora. Para fixar secamos a lâmina a passando três vezes na chama do bico de Bunsen. 
2.4. RESULTADOS
 O resultado está descrito na prática III. Nessa prática conseguimos fixar a bactéria na lâmina como mostra a figura 1, para iniciarmos a coloração de gram. 
Figura 1. Fixação da bactéria passando a lâmina na chama do bico de Bunsen
3. Prática - Coloração de Gram
3.1. OBJETIVO
Diferenciar bactérias Gram + e – e identificar sua morfologia
3.2. MATERIAIS
· Lâminas
· Swabs estéril ou alça de platina
· Colônias puras em meios de cultura
· Bico de Bunsen
· Tripé
· Tela de amianto
· Óleo de imersão
· Pisseta com água
3.3. MÉTODOS
Colocamos corante violeta genciana sobre o esfregaço e deixamos em repouso por um minuto para adicionar o lugol (iodo), aguardamos 1 minuto para lavar a lâmina com álcool absoluto e após 45 segundos adicionamos a fucsina e lavamos a lâmina com água destilada e secamos com papel filtro. Para visualização das bactérias utilizamos o óleo de imersão na lâmina e posicionamos no microscópio na objetiva 40x. 
3.4. RESULTADOS
A coloração de gram caracteriza e classifica inicialmente as bactérias, sendo dividida em 3 principais técnicas: Coloração com violeta de cristal (um corante solúvel em água, roxo); A descoloração (utilizando etanol / acetona); A contra-coloração (utilizando corante Safranina, vermelho). 
Os corantes possuem a finalidade de colorir o microrganismo para sua visualização no microscópio. O primeiro corante utilizado foi o cristal violeta, ele cora o citoplasma de púrpura/azul, já o lugol age como um fixador, irá criar afinidade entre o primeiro corante com a célula. Com o violeta de cristal colora-se tanto as bactérias gram-negativa, como a gram-positiva, o diferencial entre os corantes ocorre com adição do álcool, ele descolore apenasas bactérias gram-negativa.
Fizemos o esfregaço com a finalidade de observar as bactérias para identificar se são gram positivas ou negativas. Utilizamos dos métodos citado acima para diferenciar a bactéria presente na lâmina, podemos observar as diferentes organizações das bactérias, e a forma quanto ao arranjo. A parede celular das bactérias gram-positiva são compostas por uma camada mais grossa de peptídioglicano e retêm permanentemente o primeiro corante. Já a gram-negativo é composta por uma camada de peptidioglicano e três outros componentes que a envolvem externamente; lipoproteína, membrana externa e lipopolissacarídeo.
A bactéria visualizada foi cultivada na placa de petri, e identificamos que elas tinham a cor rosada caracterizando-a como gram-negativa e de formato bastonete. 
Figura 2. Visualização da bactéria no microscópio, mostra bastonetes gram-negativo
Figura 3. Iniciando a coloração com Violeta de Genciana para visualização das bacterias
4. Prática - Preparação do meio de cultivo, técnicas de inoculação e provas bioquímicas (Indicador de bactérias fermentadoras de Lactose) e catalase positivas.
 4.1. OBJETIVO
Preparar meios de cultura para crescimento de microrganismos inespecíficos.
4.2. MATERIAIS
· Meio MacConkey (MC)
· Vidrarias (Placas de Petri estéril, Erlenmyer, tubos de vidro com tampa,
· vidro de relógio, provetas)
· Espátula
· Papel alumínio
· Swab
· Alça de platina
· Algodão
· Gase
· Tesoura
· Cordão
· Lápis para retroprojetor preto ou azul
· Lápis grafite
· Bico de Bunsen
· Tela de amianto
· Tripé
· Lâminas
· Pipeta de Pasteur
· Peróxido de hidrogênio
· Pipeta de vidro
· Pera ou pipetador
4.3. MÉTODOS
Utilizou-se dos materiais acima para preparação do meio de cultivo MacConkey. Foi necessário fazer a regra de três para medir a quantidade correta do MacConkey, o cálculo resultou na quantidade de 11,01g do produto para 100 ml de água destilada. Após pesar o volume correto utilizando o vidro relógio e a balança de precisão adicionamos o pó em um Becker e dissolvermos com a água destilada, passamos a solução para um Erlenmeyer e fechamos a boca com algodão e gazes para colocarmos na autoclave por 20 minutos, o liquido foi esterilizado e colocado em uma placa de petri. 
4.4. RESULTADOS
O grupo ficou responsável pela preparação do meio de cultivo com Ágar MacConkey, esse experimento serve tanto para isolamento quanto para contagem de microrganismos, nessa prática realizou apenas o prepara e a inoculação da amostra. O Ágar MacConkey é considerado um dos primeiros meios de cultivo para bactérias gram-negativas indicando a fermentação por lactose. O MacConkey apresenta combinação de sais biliares e o cristal violeta, que inibem os microrganismos gram-positivo. Esse meio é utilizado para crescimento da família Enterobacteriaceae e Pseudomonas. É feito a separação do microrganismo em fermentadores de lactose ou não por mudança de cor do meio. Após seguir todos os passos do método citado acima deixamos a placa de petri descansando para fermentar a lactose no meio MacConkey.
Figura 4. A imagem mostra o MacConkey utilizado
Figura 5. MacConkey dissolvido em água destilada
5. CONCLUSÃO 
Os processos para uma a visualização da bactéria deve ser bem executados, já que são fundamentais para uma bom resultado, podendo ter um falso-positivo ou falso-negativo, se não incluir a metodologia correta como esfregaço bem fixado, tempo exato da coloração e enxague correto. O método de coloração de Gram deve ser um método avaliativo em casos clínicos. O resultado da nossa amostra foi bem claro, uma bactéria gram-negativa, bastonete. 
A técnica de isolamento pelo método de diluição em placa se mostrou um experimento muito importante, sendo um procedimento primário para qualquer experimento/estudo, possibilitando o isolamento e a contagem de microrganismos. O sucesso para essa técnica necessita também de todos os cuidados e pesagem correta do produto. 
CAMPINA GRANDE
2021