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Imunofluorescência e Imunocitoquímica: 
 
• Direta: o anticorpo que se liga ao antígeno possui fluorescência. 
• Indireta: o anticorpo que se liga ao antígeno não é fluorescente, logo você 
necessita usar um anticorpo secundário que seja fluorescente. 
 
Vantagens da imunofluorescência indireta: 
 
• Baixo custo (só há a necessidade da compra de um tipo de anticorpo 
fluorescente) 
• Maior número de moléculas fluorescentes por antígeno (melhor visualização 
devido a amplificação da fluorescência) 
 
 Os anticorpos secundários de uma reação indireta podem ainda possuir 
biotina em sua molécula, ao invés de imunofluorescência. Esses resíduos de biotina 
seriam detectados por avidina modificada para apresentar fluorescência, 
amplificando ainda mais a imunofluorescência. 
 Também podemos utilizar anticorpos fluorescentes para detectar anticorpos 
contra determinados antígenos no soro do paciente (ex: diagnóstico para sífilis). 
 A imunofluorescência tem a desvantagem de o anticorpo perder sua 
fluorescência após a exposição à luz UV ou após certo tempo. 
 A imunocitoquímica, diferente da imunofluorescência, pois não utiliza a 
fluorescência como marcador. Esta técnica lança mão de outros processos, como: 
uso de proteínas como barreira aos elétrons na microscopia eletrônica, a 
incorporação da peroxidase ao anticorpo (que ao reagir com seu substrato provoca 
o aparecimento de um precipitado), etc.  
Anticorpos monoclonais: 
 
Anticorpos monoclonais são anticorpos produzidos por células provenientes 
de um mesmo clone. Das células provenientes desse mesmo clone, uma parte será 
efetora e outra estará ligada a memória imunitária. 
 O soro é uma fonte de células policlonais, pois possui células provenientes 
de diferentes clones, que foram ativados por diferentes antígenos. 
 
 Anticorpos Policlonais X Anticorpos Monoclonais 
 
− O indivíduo, ao receber um soro de cavalo, por exemplo, será 
sensibilizado pelas proteínas do cavalo também; 
− O anticorpo contra um determinado antígeno fica diluído em soro 
contendo anticorpos policlonais; 
− O policlonal reage com diferentes epítopos de um mesmo antígeno. 
 
Obtenção de anticorpo monoclonal: 
 
Em 1975 foi desenvolvida uma técnica capaz de separar um único clone de 
linfócito B, que produz um único anticorpo. 
Faz-se uma fusão de células do baço de um animal imunizado e células de 
mieloma em PEG (polietilenoglicol), que é um agente que promove a fusão de 
membranas celulares, gerando um hibridoma. 
Este hibridoma é mantido em meio HAT (hipoxantina, aminopterina e 
timidina) para selecionar os hibridomas (a aminopterina impede a “via de novo” de 
síntese de DNA, e a timidina e a hipoxantina são usados na “via de salvação” para 
síntese de DNA). Assim, as células híbridas sobrevivem, apesar do mieloma não ter 
as enzimas da “via de salvação”, porque o linfócito tem tais enzimas. 
Após esta etapa, faz-se uma diluição do hibridoma estabelecida por cálculos 
matemáticos para que tenha 99% de probabilidade de que caia apenas uma célula 
por poço da placa. 
Em seguida faz-se testes dos sobrenadantes para os anticorpos específicos, 
pega-se as células do poço que PROVAVELMENTE é monoclonal e dilui novamente 
para que cerca de meia célula seja plaqueada novamente por poço. 
Repetem-se os testes dos sobrenadantes e faz-se a expansão dos clones 
positivos ou em cultura ou em camundongo (provocando uma ascite neste). O 
resultado em ambos os casos é a obtenção de anticorpos monoclonais. 
 
Atualmente utiliza-se a engenharia genética para obtermos anticorpos 
monoclonais, podendo obter-se: anticorpo monoclonal de camundongo com regiões 
V e C e CDRs do camundongo, anticorpo monoclonal quimérico com regiões V e 
CDRs de camundongo e região C humana, e anticorpo monoclonal humanizado com 
CDRs de camundongo e regiões V e C humanas.  
ELISA (enzyme linked imunosorbent assay): 
 
1) Adere-se o antígeno ao fundo da placa de Petri (SENSIBILIZAÇÃO DA 
PLACA COM O ANTÍGENO) 
2) Lavagem (para retirar o excesso de material) 
3) Adiciona-se o anticorpo que se quer testar e incuba-se para que ocorra a 
ligancão antígeno-anticorpo. 
4) Lavagem 
5) Adiciona-se um ligante (um anticorpo secundário conjugado a uma 
enzima, que pode ser uma peroxidase ou fosfatase alcalina. Exemplo: α-
IgGµ , que quer dizer anti IgG humana) 
6) Lavagem 
7) Adiciona-se o substrato específico para a enzima conjugada, de maneira 
que o produto da reação seja colorido. 
8) Revela-se a placa 
 
Na placa nós adicionamos o soro do paciente em diferentes diluições. Além 
disso, nós temos um controle positivo (onde sabe-se que o anticorpo primário vai 
reagir com o antígeno) e um negativo (onde não adiciona-se o anticorpo primário, 
para verificar se o anticorpo secundário não estaria interferindo na reação). 
As várias diluições visam eliminar a possibilidade de reação com outro 
anticorpo que não seja o que você está procurando. Exemplo: diagnóstico de 
Chagas: testa-se pessoas de região endêmica, pessoas com Leshimania ou com 
tuberculose (ligação cruzada), etc. Assim, determina-se até que ponto a pessoa não 
estaria com Chagas e a partir de qual ela estaria (ponto de cut-off). 
 
Western Blot: 
 
 Método usado para detectar proteínas virais ou bacterianas, por exemplo, 
separado-as de acordo com a carga. 
Utiliza-se o SDS e o mercaptoetanol (que quebra pontes de sulfeto) para 
desnaturar as proteínas à sua forma primária e com carga negativa (aquece-se um 
pouco para favorecer a desnaturação). 
Assim, coloca-se essas proteínas desnaturadas para correr num gel de 
poliacrilamina ou SDS-page (preparado entre duas superfícies com um pente do 
lado do catodo para fazer dentes que evitam que os diferentes substratos se 
misturem) do polo onde se localiza o catodo para outro onde se localiza o anodo, de 
forma qe as menores proteínas vão correr mais que as maiores (as proteínas 
migram do catodo para o anodo devido a suas cargas negativas e de acordo com 
seu tamanho molecular). 
Então esse gel é colocado em contato com uma membrana de nitrocelulose, 
e as proteínas do gel são transferidas para a membrana por capilaridade (blotting) 
ou por diferença de potencial. Essas proteínas são então identificadas incubando-se 
a membrana com anticorpos radioativos, conjugados a enzimas, etc, específicos 
para o antígeno de interesse. Finalmente, expõem-se a membrana ao raio X para 
vermos o resultado. 
A desvantagem desse método é que o anticorpo que reconhece antígeno 
conformacional não reagirá.  
ESTUDO DIRIGIDO 
 
ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay → Utiliza-se uma enzima 
para ver se houve reação antígeno-anticorpo. Adere-se o anticorpo 
(molécula ou célula) ao fundo da placa de 96 pocinhos (etapa de 
sensibilização). Em seguida, lava-se para retirar os antígenos não 
aderidos. Acrescenta-se o soro, para ver se há determinada doença, ou o 
anticorpo puro. Incuba-se. Lava-se para a retirada do anticorpo que não se 
ligou. Até agora, não dá para ver se houve ligação do anticorpo ao 
antígeno. Utiliza-se então um anticorpo anti-anticorpo primário (ex.: anti-
IgG humano - αIgGh) ligado a uma enzima. A vantagem é a mesma da 
técnica de imunofluorescência indireta. A enzima geralmente é a 
peroxidase ou a fosfatase alcalina (assim como na imunocitoquímica). 
Lava-se. Adiciona-se o substrato para a enzima (cromógeno), que quando 
quebrado passa a ter cor. O resultado é obtido por leitura no 
espectrofotômetro. Na placa há um controle positivo (antígeno; anticorpo 
para o antígeno; anticorpo secundário; substrato) e um negativo (antígeno; 
anticorpo secundário; substrato) – não se coloca o anticorpo primário para 
ver se o anticorpo secundário não está fazendo ligação cruzada com o 
antígeno. São feitas várias diluições do soro, sendo que a positividade é 
determinada pela reação em um certo número de diluições,