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Imunofluorescência e Imunocitoquímica: 
 
• Direta: o anticorpo que se liga ao antígeno possui fluorescência. 
• Indireta: o anticorpo que se liga ao antígeno não é fluorescente, logo você 
necessita usar um anticorpo secundário que seja fluorescente. 
 
Vantagens da imunofluorescência indireta: 
 
• Baixo custo (só há a necessidade da compra de um tipo de anticorpo 
fluorescente) 
• Maior número de moléculas fluorescentes por antígeno (melhor visualização 
devido a amplificação da fluorescência) 
 
 Os anticorpos secundários de uma reação indireta podem ainda possuir 
biotina em sua molécula, ao invés de imunofluorescência. Esses resíduos de biotina 
seriam detectados por avidina modificada para apresentar fluorescência, 
amplificando ainda mais a imunofluorescência. 
 Também podemos utilizar anticorpos fluorescentes para detectar anticorpos 
contra determinados antígenos no soro do paciente (ex: diagnóstico para sífilis). 
 A imunofluorescência tem a desvantagem de o anticorpo perder sua 
fluorescência após a exposição à luz UV ou após certo tempo. 
 A imunocitoquímica, diferente da imunofluorescência, pois não utiliza a 
fluorescência como marcador. Esta técnica lança mão de outros processos, como: 
uso de proteínas como barreira aos elétrons na microscopia eletrônica, a 
incorporação da peroxidase ao anticorpo (que ao reagir com seu substrato provoca 
o aparecimento de um precipitado), etc.  
Anticorpos monoclonais: 
 
Anticorpos monoclonais são anticorpos produzidos por células provenientes 
de um mesmo clone. Das células provenientes desse mesmo clone, uma parte será 
efetora e outra estará ligada a memória imunitária. 
 O soro é uma fonte de células policlonais, pois possui células provenientes 
de diferentes clones, que foram ativados por diferentes antígenos. 
 
 Anticorpos Policlonais X Anticorpos Monoclonais 
 
− O indivíduo, ao receber um soro de cavalo, por exemplo, será 
sensibilizado pelas proteínas do cavalo também; 
− O anticorpo contra um determinado antígeno fica diluído em soro 
contendo anticorpos policlonais; 
− O policlonal reage com diferentes epítopos de um mesmo antígeno. 
 
Obtenção de anticorpo monoclonal: 
 
Em 1975 foi desenvolvida uma técnica capaz de separar um único clone de 
linfócito B, que produz um único anticorpo. 
Faz-se uma fusão de células do baço de um animal imunizado e células de 
mieloma em PEG (polietilenoglicol), que é um agente que promove a fusão de 
membranas celulares, gerando um hibridoma. 
Este hibridoma é mantido em meio HAT (hipoxantina, aminopterina e 
timidina) para selecionar os hibridomas (a aminopterina impede a “via de novo” de 
síntese de DNA, e a timidina e a hipoxantina são usados na “via de salvação” para 
síntese de DNA). Assim, as células híbridas sobrevivem, apesar do mieloma não ter 
as enzimas da “via de salvação”, porque o linfócito tem tais enzimas. 
Após esta etapa, faz-se uma diluição do hibridoma estabelecida por cálculos 
matemáticos para que tenha 99% de probabilidade de que caia apenas uma célula 
por poço da placa. 
Em seguida faz-se testes dos sobrenadantes para os anticorpos específicos, 
pega-se as células do poço que PROVAVELMENTE é monoclonal e dilui novamente 
para que cerca de meia célula seja plaqueada novamente por poço. 
Repetem-se os testes dos sobrenadantes e faz-se a expansão dos clones 
positivos ou em cultura ou em camundongo (provocando uma ascite neste). O 
resultado em ambos os casos é a obtenção de anticorpos monoclonais. 
 
Atualmente utiliza-se a engenharia genética para obtermos anticorpos 
monoclonais, podendo obter-se: anticorpo monoclonal de camundongo com regiões 
V e C e CDRs do camundongo, anticorpo monoclonal quimérico com regiões V e 
CDRs de camundongo e região C humana, e anticorpo monoclonal humanizado com 
CDRs de camundongo e regiões V e C humanas.  
ELISA (enzyme linked imunosorbent assay): 
 
1) Adere-se o antígeno ao fundo da placa de Petri (SENSIBILIZAÇÃO DA 
PLACA COM O ANTÍGENO) 
2) Lavagem (para retirar o excesso de material) 
3) Adiciona-se o anticorpo que se quer testar e incuba-se para que ocorra a 
ligancão antígeno-anticorpo. 
4) Lavagem 
5) Adiciona-se um ligante (um anticorpo secundário conjugado a uma 
enzima, que pode ser uma peroxidase ou fosfatase alcalina. Exemplo: α-
IgGµ , que quer dizer anti IgG humana) 
6) Lavagem 
7) Adiciona-se o substrato específico para a enzima conjugada, de maneira 
que o produto da reação seja colorido. 
8) Revela-se a placa 
 
Na placa nós adicionamos o soro do paciente em diferentes diluições. Além 
disso, nós temos um controle positivo (onde sabe-se que o anticorpo primário vai 
reagir com o antígeno) e um negativo (onde não adiciona-se o anticorpo primário, 
para verificar se o anticorpo secundário não estaria interferindo na reação). 
As várias diluições visam eliminar a possibilidade de reação com outro 
anticorpo que não seja o que você está procurando. Exemplo: diagnóstico de 
Chagas: testa-se pessoas de região endêmica, pessoas com Leshimania ou com 
tuberculose (ligação cruzada), etc. Assim, determina-se até que ponto a pessoa não 
estaria com Chagas e a partir de qual ela estaria (ponto de cut-off). 
 
Western Blot: 
 
 Método usado para detectar proteínas virais ou bacterianas, por exemplo, 
separado-as de acordo com a carga. 
Utiliza-se o SDS e o mercaptoetanol (que quebra pontes de sulfeto) para 
desnaturar as proteínas à sua forma primária e com carga negativa (aquece-se um 
pouco para favorecer a desnaturação). 
Assim, coloca-se essas proteínas desnaturadas para correr num gel de 
poliacrilamina ou SDS-page (preparado entre duas superfícies com um pente do 
lado do catodo para fazer dentes que evitam que os diferentes substratos se 
misturem) do polo onde se localiza o catodo para outro onde se localiza o anodo, de 
forma qe as menores proteínas vão correr mais que as maiores (as proteínas 
migram do catodo para o anodo devido a suas cargas negativas e de acordo com 
seu tamanho molecular). 
Então esse gel é colocado em contato com uma membrana de nitrocelulose, 
e as proteínas do gel são transferidas para a membrana por capilaridade (blotting) 
ou por diferença de potencial. Essas proteínas são então identificadas incubando-se 
a membrana com anticorpos radioativos, conjugados a enzimas, etc, específicos 
para o antígeno de interesse. Finalmente, expõem-se a membrana ao raio X para 
vermos o resultado. 
A desvantagem desse método é que o anticorpo que reconhece antígeno 
conformacional não reagirá.  
ESTUDO DIRIGIDO 
 
ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay → Utiliza-se uma enzima 
para ver se houve reação antígeno-anticorpo. Adere-se o anticorpo 
(molécula ou célula) ao fundo da placa de 96 pocinhos (etapa de 
sensibilização). Em seguida, lava-se para retirar os antígenos não 
aderidos. Acrescenta-se o soro, para ver se há determinada doença, ou o 
anticorpo puro. Incuba-se. Lava-se para a retirada do anticorpo que não se 
ligou. Até agora, não dá para ver se houve ligação do anticorpo ao 
antígeno. Utiliza-se então um anticorpo anti-anticorpo primário (ex.: anti-
IgG humano - αIgGh) ligado a uma enzima. A vantagem é a mesma da 
técnica de imunofluorescência indireta. A enzima geralmente é a 
peroxidase ou a fosfatase alcalina (assim como na imunocitoquímica). 
Lava-se. Adiciona-se o substrato para a enzima (cromógeno), que quando 
quebrado passa a ter cor. O resultado é obtido por leitura no 
espectrofotômetro. Na placa há um controle positivo (antígeno; anticorpo 
para o antígeno; anticorpo secundário; substrato) e um negativo (antígeno; 
anticorpo secundário; substrato) – não se coloca o anticorpo primário para 
ver se o anticorpo secundário não está fazendo ligação cruzada com o 
antígeno. São feitas várias diluições do soro, sendo que a positividade é 
determinada pela reação em um certo número de diluições,específicos 
para cada doença (cria-se um parâmetro testando-se soro de indivíduos 
com a doença, normais, normais em área endêmica, com outras doenças, 
etc.). 
 
WESTERN BLOT – Detecta proteínas que são separadas de acordo com 
a carga. Utiliza-se o detergente SDS, que faz com que a proteína perca as 
estruturas quaternária, terciária e secundária, ficando apenas a primária e 
a carga negativa dada pelo SDS. Mercaptoetanol quebra as pontes 
dissulfeto. Aquece-se para facilitar a desnaturação. Coloca-se gel de 
poliacrilamida entre duas placas de vidro. Faz-se com um pente, “dentes” 
na parte superior do gel, para se colocar soluções de diferentes proteínas 
em cada um. Coloca-se numa placa de eletroforese, onde as proteínas 
migram do catodo para o anodo (pois o SDS é negativo) de acordo com o 
tamanho molecular, de forma que as maiores migram menos, pois têm que 
passar pelos poros da acrilamida. Essa técnica é chamada SDS-PAGE 
(eletroforese em gel de poliacrilamida). Coloca-se o gel com as proteínas 
em contato com um papel filtro e aplica-se uma diferença de potencial para 
que as proteínas migrem para o filtro de nitrocelulose com a mesma 
disposição do gel. Esse papel pode ser incubado com anticorpos, que 
reagem com as proteínas de uma banda (anticorpos secundários 
radioativos, com enzimas, etc.). Os anticorpos que se ligam a epítopos 
conformacionais não se ligam.  
FACS ou citometria de fluxo: 
 
 Há uma fonte de raio laser e um recipiente onde é colocada a solução de 
células, que “pinga” através do raio laser. Esse, ao passar pela célula, sofre um 
“espalhamento” (refração), que serve para determinar o tamanho, granulosidade e 
fluorescência (se tiver marcador) da célula. 
 A suspensão deve ser de células isoladas, com uma diluição que tenha uma 
maior probabilidade de que cada gota contenha apenas uma célula. O aparelho faz 
vibração e pressão para que o líquido passe como gotículas. 
 Pode-se quantificar as células e separá-las em sub-populações, sem precisar 
fixá-las, por meio de placas de diferença de potencial, que desviam as células para 
compartimentos diferentes. A desvantagem principal é o pequeno número de células 
separado, embora a amostra seja bem purificada. 
 Nem sempre granulosidade e tamanho são suficientes para fazer um 
diagnóstico, sendo necessário fazer marcações (ex: de κ, de λ, CD19, etc). Os 
aparelhos de hoje podem detectar até cinco marcadores fluorescentes na mesma 
célula através de um sistema de filtros. 
 Esse mesmo tipo de análise é usado para dosar CD4 e CD8 em pacientes 
HIV-positivos, embora essa possa ser feita em microscópio ótico de fluorescência, 
que tem a desvantagem de sofrer influência da subjetividade do contador e ser um 
método mais lento. 
 
Aplicação: 
 
a) Tipagem de leucócitos  diagnóstico de imunodeficiências congênitas, 
avaliação e prognóstico de HIV-positivos, monitoramento da reconstituição de 
transplante de medula óssea, monitoramento de imunoterapia ou quimioterapia 
em imunodeficiências. 
b) Fenotipagem de tumores  diagnóstico e classificação de linfomas e leucemias, 
diferenciação de células tumorais hematopoiéticas e não hematopoiéticas, 
avaliação de prognóstico de cancêr, determinação da clonalidade de linfomas e 
leucemias B. 
c) Análise de DNA  determinação da fase do ciclo celular.  
ED – FACS ou Citometria de fluxo 
 
 Há uma fonte de raio laser e um recipiente em que é colocada a 
solução de células, que “pinga” através do raio laser. Esse, ao passar pela 
célula, sofre um espalhamento, que serve para determinar o tamanho, 
granulosidade e fluorescência (se estiver marcada) da célula. 
 A suspensão deve ser de células isoladas; com uma diluição tal que 
haja uma maior probabilidade de cada gota conter apenas uma célula. O 
aparelho faz vibração e pressão para que o líquido passe como gotículas. 
 Pode-se quantificar as células, separá-las em subpopulações, sem 
precisar fixá-las, por meio de placas de diferença de potencial, que desviam 
as células para compartimentos diferentes. A desvantagem principal é o 
pequeno número de células separado, embora a amostra seja bem 
purificada. Os aparelhos de hoje podem detectar vários marcadores 
fluorescentes na mesma célula, através de um sistema de vários filtros. 
 
 
 
 Nem sempre granulosidade e tamanho são suficientes para fazer um 
diagnóstico, sendo necessário fazer marcação (ex.: de kappa, de lambda, 
CD5, CD19). 
 Esse mesmo tipo de análise é usado para dosar CD4 e CD8 em 
pacientes HIV-positivos, embora essa possa ser feita em MO de 
fluorescência, que tem a desvantagem de sofrer influência da subjetividade 
do computador e ser mais lento. 
 
Aplicação: 
I) Tipagem de leucócitos: Diagnóstico de imunodeficiências 
congênitas; avaliação e prognóstico de HIV+; monitoramento de 
reconstituição de transplante de medula óssea; monitoramento de 
imunoterapia ou quimioterapia em imunodeficientes. 
II) Fenotipagem de tumores: Diagnóstico e classificação de linfomas e 
leucemias; diferenciação de células tumorais hematopoiéticas e 
não hematopoiéticas; avaliação do prognóstico do câncer; 
determinação de clonalidade de linfomas e leucemias B. 
III) Análise de DNA: Determinação do ciclo celular. 
 
  
 Rejeição de Transplantes  A  rejeição  pode  ser  aguda  ou  crônica.  A  rejeição  aguda  é mais  intensa  e mais violenta,  e  termina  com a  rejeição do órgão.  Já  a  rejeição  crônica dura um período de tempo maior. A rejeição não está ligada à quantidade de alelos de HLA diferentes entre doador e receptor.  
Papel da imunossupressão:  
   Diminuir  a  resposta  imune  a  uma  rejeição  crônica.  Antigamente  a imunossupressão  só  era  conseguida  com  altas  doses  de  drogas  e  efeitos  colaterais. Atualmente,  as  doses  são  bem mais  baixas  e  os  efeitos  colaterais  são menores.  Essas drogas  (exemplos:  ciclosporina  A,  FK506,  e  rapamicina)  atuam  principalmente  em linfócitos T. Em princípio, este é um tratamento crônico e que deve ser constantemente acompanhado.  
Tipagem HLA:    Antes do transplante, procura‐se tipar o HLA de órgãos do doador e do receptor, para evitar‐se a rejeição aguda ou pelo menos minimizar a rejeição crônica. O objetivo desta  tipagem é,  portanto,  obter  a melhor  compatibilidade de MHC  classe  I  e  classe  II entre doador e receptor.   São  as  células  do  transplante  que  apresentam MHC  classe  II  na  sua  superfície dão  início  a  rejeição. Porém,  tanto  classe  I  quanto  classe  II  dão  contribuições,  embora diferentes, a rejeição.   A tipagem de HLA é feita por centros especializados, através de uma combinação de técnicas, tais como: sorológicas, imunoquímicas, e de biologia celular e genética.  
 Reação leucocitária mista  quando o soro de dois indivíduos, ao serem 
colocados juntos, desencadeam uma reação violenta. A ausência desta 
reação indica que há compatibilidade de classe II. 
 
No transplante de medula óssea, o hospedeiro pode rejeitar a medula ou a 
medula pode rejeitar o hospedeiro. É a chamada reação do enxerto contra o 
hospedeiro. 
 
 Reação do enxerto contra o hospedeiro  é quando células contidas no 
transplante (30% das células da medula são células T) rejeitam o hospedeiro, 
pois as moléculas de HLA são diferentes. Estas células T agridem o 
hospedeiro, principalmente pele, sistema imune, retina, e cordas vocais. 
 
Para evitar a reação do enxerto contra o hospedeiro, se utiliza anticorpos 
contra proteínas de linfócitos T (ex: anti CD4 e CD8), para matar as células T do 
enxerto. O problema é que os linfócitos T produzem citocinas que fazem a medula 
funcionar, e sem eles a medula não funciona. 
 
 Enxerto contra leucemia  o transplante teria um efeito anti-cancêr, se as 
células T não fossem completamente eliminadas.   
APLICAÇÃO DE CONCEITOS IMUNOLÓGICOS À MEDICINA 
(GRUPOS SANGUÍNEOS)  
 GruposSanguíneos: 
 ‐ Sistemas de aloantígenos presentes em hemácias ‐ Dinamicamente importantes: ABO e Rh  Aplicar conceitos de:   Antígeno – Epítopo – Hapteno – Carreador – Reação Cruzada – Anticorpo – Classe – Resposta primária e secundária – Timo independente – mudança de classe – Tolerância – Especificidade – Aglutinação – Relação entre estrutura e função das classes de Ig – Pareamento entre doador e receptor – Resposta timo dependente – Transferência placentária de imunidade (imunização passiva) – hipersensibilidade – Produção de Igs – Secreção de Ig – Anticorpo “natural”   
Sistema ABO de grupos Sanguíneos:  
Aloantígeno: “coisa” presente em um indivíduo e ausente em outro da mesma espécie servindo para este como um antígeno. Ex: Ag de histocompatibilidade; substâncias presentes na superfície das hemácias.  Chamamos de A e B açúcares diferentes que fazem parte da glicoproteinas ou glicolipídeos presentes na superfície das hemácias.   Devemos entender o sistema ABO no sentido de Ags – epítopos – haptenos: ‐ Os grupos A e B são gerados a partir das diferentes enzimas glicosil‐transferases       que transferem especificamente o açúcar de um lugar para o outro. ‐ A e B possuem estruturas bioquímicas diferentes; são antígenos diferentes e assim são reconhecidos por Ac diferentes!!! (distintos imunoquimmicamente) ‐ A e B são moléculas muito pequenas e sozinhas não são imunogênicas e só se tornam imunogênicas quando incorporadas a estruturas maiores (lipídeos ou proteínas na superfície celular).    O “antígeno” A e B são geradas dentro das hemácias e depois incorporadas á membrana por enzimas glicosil‐transferase específicas para A ou B. Assim, se um indivíduo só tiver enzima que transfere A, só terá antígeno A na hemácia, sendo tipo A.    O ponto de inserção de A ou B na membrana é único e é em uma molécula aceptora (uma proteína ou um lipídeo).  Esta não recebe A e B ao mesmo tempo, ou é A ou B, mas em uma célula que possui as duas enzimas glicosil‐transferase, produzindo A e B, esses são transferidos para a superfície celular de uma mesma hemácia mas em aceptores diferentes, caracterizando o tipo AB.  Condição para ser hemácia (indivíduo) do tipo...  
A : ‐ expressar gene que codifica enzima glicosil‐transferase para A       ‐ possuir aceptores de A na membrana  
B : ‐ expressar gene que codifica enzima glicosil‐transferase para B       ‐ possuir aceptores de B na membrana  
AB : ­ 2 enzimas transferases          ‐ Possuir os dois aceptores. Em uma mesma hemácias temos Ag A e B em diferentes sítios.  
Ag A e B são haptenos, pois são moléculas pequenas e são colocadas em estruturas maiores na superfície para se tornarem reativos/imunogênicos.  
Transfusão, Tolerância e Resposta Imune: 
 As respostas a transfusão é imediata! Isso ocorre pois no sangue já existem anticorpos anti‐B em indivíduos A e anti‐A em indivíduos B ou até ambos os Acs em indivíduos O. Esses anticorpos já existem no sangue do indivíduo antes mesmo de qualquer transfusão que o indivíduo sofra. E o mais curioso é que em um individuo A não há anticorpos anti‐A e nos B não há anti‐B! Toda resposta imune é criada a partir de uma sensibilização inicial e no caso da existência de anticorpos anti A e anti B antes msm de tranfussão.O que se explica é que bactérias de nossa flora intestinal possuem tanto antígenos A qto B em sua superfície ( não são Ag exclusivos do sangue ) e são elas que sensibilizam o nosso sistema imune que então produz Ac antiA e anti B O que um individuo A passa a não apresentar Ac anti A é o fenomeno de tolerância e o msm vale pra individuos B em relação aos Ac anti B. Como provar que as bactérias de flora tem Ag A ? Pega sangue de individuo tipo B (que contém Ac anti A ) e joga nele a bacteria.Se ele tiver Ag A irá se grudar aos AC. Daí se dps colocarmos soro A com hemácias A positivo veremos que não irá mais aglutinar. OBS: Em individuo A, as bactérias A de flora não são conhecidas como estranhas devido À tolerância.Para que nós não reconheçamos nossas céls. Ac “natural”  Ac anti A e anti B são encontrados naturalmente no soro sanguíneo de indivíduos nunca transfudidos.As bactérias de flora intestinal “imunizam” ATENÇÃO  essas bactérias de flora são portanto muito úteis para o sistema imune e ele “ cuida com carinho”.O trato gastrointestinal é um componente altamente especializado no sistema imune, que é capaz de distinguir o que é um estimulo patogênico realmente do não patogênico. O sistema reconhece as bactérias da flora mas não as ataca.A penas qdo eles vão para outros sítios é que o sistema entra em alerta tentando contê‐los.O TG1 funciona predominantemente para gerar tolerância a com organismos.Portanto a administração de Ags por via oral acaba aumentando a chance de fazer tolerância e diminuindo a de resposta imune.A quebra de tolerância nos predispõe a doenças graves. Reação cruzada: Ag A e B de hemácias são iguais aos Ag A e B das bactérias da flora e é por isso que Ac produzido contra bactérias agem contra hemácias do doador em uma reação cruzada. Ac anti A e anti B:São Acs “naturais” sendo timo dependentes. Todos os Acs timo independentes são do tipo Ig M E NÃO PRECISAM DE CÉLS t HELPER PARA SEREM PRODUZIDOS.São fabricados contra açúcar de superfície bacteriana. Só há produção de Ig M e não de Ig G pq as bactérias estimulam uma resposta timo independente que então não conta com linfócito t helper, não havendo mudança de classe. Os haptenos A e B são presos a carreadores ( glicoptns e glicolipidios ) de superfície das hemácias e geram uma resposta imune em indivíduos que possuem Ig M anti A e anti B.  Propriedades dos Ig M anti A e anti B: ‐ capacidade de aglutinar hemácias ‐ capacidade de ativar destruição de hemácias pelo sist complemento.  
ATENÇÃO: A maior parte das bactérias gera uma resposta humoral pois é por meio de Acs que o sistema imune consegue se livrar mais facilmente das bactérias.A produção de IgM contra as bactérias da flora intestinal é local apenas na mucosa intestimal NÃO SENDO SUFICIENTE PARA ATIVAR LINF T. Até pq as bactérias não são patogênicas. Voltando Às propriedades... 
As IgM são bons para aglutinar hemácias pois são MULTIVALENTES GRANDES tendo portanto uma estrutura propícia para aglutinar coisas distantes de si. Além disso, estão distribuídos em todas as direções. No caso de aglutinação de hemácias é mt importante o tamanho de IgM  pois as hemácias nunca se aproximam bem visto que há repulsão eletrostática entre as superfícies das hemácias.”Portanto, somente em patologia é que vemos hemácias unidas em “pilha de moedas” no verso.Para aglutinar hemácias então, é necessário um instrumento aglutinador grande. IgM ativa o sistema complemento com alta eficiência pois na molécula de IgM ocorre a justaposição de região Fc varias vezes.  
Pareamento doador­receptor de sangue:  Antes de ocorrer a transfusão de um individuo para o outro deve‐se testar se ocorre ou não reação qdo une os sangues. Em geral o pareamento é feito pegando‐se hemácias de um deles e unindo em soro antiA e anti B e vendo se aglutina ou não. Hemácias B + soro anti B – aglutina Hemácias A + soro anti A – aglutina Por outro lado, no soro contendo hemácias que será transfudido não há apenas hemácias. Numa transfusão de sangue total é tb importante saber se no soro há Acs conta os antígenos presentes nas hemácias do receptor. Portanto:Não existe doador universal de sangue. Msm o sangue de indivíduos tipo O, podem não conter Ags mas possui no plasma vários Ac anti A e B . Ai os Acs do doador podem destruir as hemácias do receptor.  Prova cruzada: Testa tanto Ag qto Ac. ‐ Evitar destruição das hemácias doadas: verificar se as hemácias do doador têm ou não Ags reconhecidos por Acs do receptor ‐ Evitar a destruição de hemácias do receptor:verificar no plasma que será transferido se há Acs que hajam contra Ags das hemácias do receptor Portanto a transfusão de sangue deve ser sempre entre indivíduos compatível = do msm grupo ABO.  Conseqüências da tranfusão imcompatível:  A longo prazo ocorreo desenvolvimento de uma resposta timo‐dependente. Isso ocorre qdo a bactéria da flora está lá isolada na mucosa, a resposta imediata gerada é IgM, mas qdo as hemácias no sangue sofrem hemólise devido À reação humoral (mais sistema complemento mais macrófagos ) isso é uma evidencia para o sistema imune de que não está tudo bem e ai linfócito T helper passam a interferir e linfócito B produzem IgG. ( típico de resposta imune secundária ). A partir daí nunca mais a resposta será PRIMÁRIA PROVAVELMENTE. ( IRREVERSÍVEL ) 
ATENÇÃO: resposta primária bactérias timo independentes  IgM / R secundária  transfusão timo dependente IgG A resposta secundária tb pode ser provocada em mulheres grávidas qdo as hemácias de feto encontram com sangue materno, se estas continuarem Ags para os quais o soro materno tem Acs, ai pode ocorrer hemólise e provocar resposta secundária e produção de Acs IgG. Qual o perigo disso? IgGs são capazes de passar pela placenta (e IgM não) provocando imunização passiva e ai? Ex: se o feto for B e a mãe for O, os Acs IgG anti A e/ou anti B passam pela placenta para o feto e anti B provoca hemólise das céls (hemácias) do feto  doença hemolítica do recém nascido= eritroblastose fetal. 
IgG NÃO AGLUTINA MAS  OPSONIZA!!     A doença hemolítica de recém nascido ocorre por incompatibilidade do sistema Rh e/ou do sistema ABO, mas...  Incompatibilidade ABO – mais comum e menos agressiva  Incompatibilidade Rh – menos comum e mais agressiva  Obs.: OPSONIZAÇÃO. Facilitação de fagocitose mediada pela interação entre opsonina (ex: Ig G) e receptor de superfície do fagócito. No caso de Ig G é a porção Fc de Ig G.   
SISTEMA Rh (Dd) 
 
 Proteína timo dependente 
                  � 
               Ig G     �  transferência placentária                                                    �                                                                               Opsonização                                                                                                           �                                                           Degradação de hemoglobina                                                    �                                        Bilirrubina não conjugada     A bioquímica e genética do sistema Rh é muito complexa. Costuma‐se dizer que os humanos se dividem em Rh + e Rh ‐. A fita alélica do Rh+ é D_ e a do Rh – é dd. A grande maioria das pessoas são Rh+. Poucos são Rh‐. Por alguma razão desconhecida, só existe possibilidade de reação imune em um sentido (unidirecional): os dd (Rh‐) quando entram em contato com o sangue Rh+ reagem fazendo anticorpo anti‐Rh. Já os Rh+ não reconhecem Rh‐ como estranho, não reagindo. Após o contato com Rh+ a produção de anticorpos anti‐Rh demora mais ou menos uma semana. Esses anticorpos não são do tipo Ig M, pois Rh é uma proteína que provoca resposta timo‐dependente e muito intensa: uma única exposição imunizante é suficiente para fazer muita Ig G que dura muito tempo e esse Ig G pode causar danos caso seja transferido pela placenta para o feto. Ele opsoniza as hemácias do feto facilitando a hemólise desta por fagocitose. Portanto a destruição das hemácias não é feita pelo complemento, visto que este ainda nem amadureceu no feto, mas sim por células fagocíticas. Com a hemólise, ocorre anemia (menor capacidade de transporte de oxigênio) e o desenvolvimento fetal é prejudicado sendo a principal causa de morte fetal�  incompatibilidade de grupos sanguíneos é uma das causas de aborto. A hemólise também leva a degradação de hemoglobina que contribui pra anemia e gera bilirrubina não conjugada que é tóxica, insolúvel e não eliminável pela urina. Durante a vida fetal 
esse excesso de bilirrubina é transferido para o sangue materno e aí o fígado da mãe conjuga e os rins eliminam � reduz a toxicidade de bilirrubina.  O problema é quando ocorre o nascimento e o fígado do neo‐nato não consegue conjuga‐la. Aí a bilirrubina em excesso é muito tóxica e gravemente perigosa se associando ao SNC (gânglios da base por ex.) causando lesões� KERNICTERUS  Incompatibilidade na doença hemolítica do recém nato... A doença hemolítica se deve ao fenômeno de imunização passiva do feto pela transferência de Ig Gs pela placenta. Essas Ig Gs podem ser anti‐Rh ou anti‐A ou anti‐B. Portanto tanto incompatibilidade ABO quanto incompatibilidade Rh levam a eritroblastose fetal.  Durante a gestação o sangue fetal pode entrar em contato com o sangue materno procurando sensibilização e geração de anticorpos antiRh (mãe‐ e feto Rh +) ou antiA e/ou  AntiB. Para causar a eritroblastose, basta que no sangue materno exista Ig G antiA/B/Rh e para um deles estar presente ao menos, basta que antígenos do feto tenham entrado em contato com sangue materno. Na primeira gestação isso pode ocorrer e o feto pode receber as IgGs produzidas, sofrendo de eritroblastose fetal.  Porém isso é pouco provável. A sensibilização é bem maior na hora do parto. Nesse momento há mistura dos sangues materno e fetal. Assim, o risco de doença aumenta a cada gestação de filho Rh+ por mãe Rh‐. A sensibilização do sistema imune e então a imunização ocorre em vários contextos, por ex: 1‐ Infecções 2‐gravidez (grávida é imunizada por antígenos fetais) as respostas imunes geradas podem ser ruins para o feto (ex. sistema ABO e Rh) mas a grande maioria das respostas imunes são benéficas pro feto, assegurando condições favoráveis ao seu desenvolvimento. Portanto, assim como no caso da flora intestinal, é uma resposta benéfica. Ex: resposta da mãe ao complexo de histocompatibilidade (HLA) do feto (função protetora, preservar “o corpo estranho” dentro do organismo materno).  
ATENÇÃO­DIAGNÓSTICO   O que causa a eritroblastose são anticorpos Ig G contra antígenos presentes no feto. Como eu posso testar se a criança tem essa doença? Procurando anticorpos maternos no sangue do feto. Esses anticorpos devem estar presos a hemácias e isso pode ser visto em técnicas de imunohistoquímica (uso de anticorpo marcado pra reconhecer o anticorpo materno grudado na hemácia fetal). O anticorpo marcado é produzido por outras espécies que não o ser humano já que não poderíamos ter anticorpo contra nossos próprios anticorpos. Esse anticorpo deve reconhecer a cadeia pesada gama se não ele reconheceria outros anticorpos. Esse método quase não é usado.  Teste de Coombs     É o mais usado (método de aglutinação) Consiste em tirar proveito da diferença na capacidade de aglutinação de diferentes Igs. IgG não aglutina! IgM aglutina! Depois de colocar um Ig anti IgG humana deve‐se ver se as hemácias aglutinaram ou não. Utiliza‐se pra isso um anticorpo antiIgG humana ( de outra espécie) que não precisa estar marcado! Quando a hemácia fetal estiver coberta de IgG materno, o Anticorpo antiIgG irá se ligar a duas IgGs diferentes pois é bivalente e aí aglutina hemácias. É um teste de aglutinação. Teste+ ‐ aglutina‐doença Teste negativo‐ não aglutina‐ não tem doença.  
IDÉIAS: O sangue não aglutina normalmente                O teste só funciona se em mais de uma hemácia existirem Ig Gs maternos cobrindo a superfície.   O teste de Coombs pode ser direto ou indireto: 
1­ Direto (uma etapa apenas): basta colocar anticorpos IgG e anti IgG materna 
2­ Indireto: feito pra saber se a mãe tem imunidade contra antígenos fetais e se pode, portanto causar eritroblastose fetal.       Procurar se a mãe tem Ig G antiA/antiB ou antiRh. Como? 1°‐utiliza‐se hemácias Rh+ e coloca‐se o soro materno nelas. Não dá pra ver nada a princípio. 2° lava‐se as hemácias cobertas ou não de anticorpos e coloca‐se outros anticorpos que reconhecem IgGs maternos. Se elas estiverem cobertas por IgGs maternos irão aglutinar( aí é +‐ mãe imunizada‐ próxima gestação tem risco‐ aconselhamento genético).  
MAIS ATENÇÃO: se no soro da mãe existir IgM antiA e/ou antiB o que acorreria é que iria aglutinar antes da 2° etapa.    
IMUNO­PROFILAXIA  Aplicação intravenosa de Ac anti A/B ou Rh no sangue de mãe durante o período da gravidez!!! Isso evita que ele produzaseus próprios Ac, evitando assim a criação de memória!! (dificulta a imunização!) Só serve se for a primeira gravidez e/ou se a mulher ainda não tiver sido imunizada. Se utiliza de IgM pois ele não ultrapassa a placenta!! Mas é capaz de eliminar as eventuais hemácias que passaram p/ mãe! Na prática médica esse soro com IgM é administrado apenas logo antes do parto pois é o evento c/ maior risco de mistura de sangue materno‐fetal!! Evita que a mãe desenvolva resposta imune anti‐hemácias fetais!! Esse evento mostra que pode haver DESTRUIÇÃO sem haver IMUNIZAÇÃO (evento REGULADOR DA IMUNIDADE). Atenção: Não é vacina!! É soro!! (imunização passiva)  Noção muito importante: Dar soro e vacina ao mesmo tempo é burrice!! O soro irá evitar a imunização já que contém Acs que irão reagir com os Ags atenuados ou “mortos” da vacina impedindo a formação da imunidade!! Imunização passiva regula a imunidade!!   
ANTICORPOS MONOCLONAIS E CITOMETRIA DE FLUXO  O desenvolvimento de tecnologia de Ac monoclonais possibilitou avanços na medicina, pp nos meios diagnósticos!! Ac monoclonais => derivados de 1 clone de células B específico. Linfócitos B são produzidos na medula óssea, sofrem rearranjo e se maturam nos linfonodos!! Cada 1 possui 1 Ig especifico!! Se essa cel B proliferar, todos os seus “filhos” irão ter a mesma especificidade. Mas os linfócitos B não vivem para sempre!! E nem o Ig!! É por isso que é necessária a revacinação!  Hibridoma=> Híbrido de célula tumoral + cel B produtora de Ig  Em 1975, 2 pesquisadores (George Kahler e Cesar Miltew) produziram um hibridoma!! A idéia deles era juntar 2 características muito boas: a capacidade de 
produção de Ac das células B e a capacidade de sobreviver para sempre das linhagens tumorais!! (imortalidade) *Célula tumoral: Linhagem eterna. Algumas linhagens vivem para sempre in vitro desde que haja o mínimo para sobreviver!!  Imortalidade tumoral + Produção de Ac de células B => TÉCNICA ATÉ HOJE USADA PARA PRODUZIR AC. MONOCLONAIS!  *Descrição da técnica: Produção de Ac monoclonal:  
1)Injeta no camundongo o Ag escolhido!! (ex. Albumina) O Ag deve ser grande, estar em solução aquosa e com ADJUVANTE. O adjuvante serve para chamar atenção do Sistema Imune de que existe algo estranho no organismo!! Ele provoca uma resposta inflamatória!! (ex. adjuvante de micobactéria). 
2) Retirar o baço do animal para procurar o clone B específico produtor do 
Ig contra o Ag inoculado. 
3) Separa­se as células de baço em frascos contendo também células 
tumorais. Adiciona‐se POLIETILENOCLICOL AOS FRANSCOS que então leva a desestabilização das membranas celulares levando a fusão aleatória entre células nos frascos. Mas, e aí? Como saber se fusiona célula tumoral + célula B? Tem que saber que: as células tumorais colocadas nos frascos têm defeito na “via de novo” de produção de Acído Nucléicos e para produzi‐los usa a “via de salvação”, uma alternativa. Porém, o meio existente nos francos é um meio de seleção que INIBE A VIA DE SALVAÇÃO (meio HAT: hipoxantina + aminobterina + rimidina). Assim, após fusão vemos que: TUMORAL + TUMORAL => Morre sem poder fazer Ácido nucléico LINF B + LINF B => Morre de senescência  TUMORAL + LINF => VIVE 
4) Agora o problema é saber qual linfócito fusionou!! Até porque no baço tem linfócito B linfócito T e que dos vários linfócitos B apenas 1 clone é de interesse. Os linfócitos B produzem Acs e daí devemos identificá‐los para saber em que frasco (poço) está o linfócito B desejado!! A célula B só produz Ac quando ativada (vira plasmócito e deixa de ter Ac na membrana, secretando apenas!!). Para buscar o Ac exato faz‐se um ELISA=> em uma placa se gruda o Ag específico (ex: albumina) e se adiciona a solução sobrenadante de 1 dos francos de cada vez ( é nele que tem Ac). Se tiver o anticorpo específico irá grudar!! Aí se lava a placa e coloca‐se Ac secundário para o Ac primário. Esse Ac secundário está marcado e revela o primário!! (marcador = enzima fosfatase, por exemplo). 5) Após o Elisa descobrimos então que pelo menos 1 dos poços continha Ac anti‐albumina no sobrenadante!! Aí podemos atingir um ideal de + ou – 1 célula por poço. E aí faz Elisa de novo com o sobrenadante de cada poço. Dando + sabemos então que neste poço existe o clone que procuramos!! => É um método muito demorado, de tentativa e erro e precisa de muita capacidade do técnico!! Problemas na técnica: * Não ocorrer fusão *Pureza do AG *Imunização Incorreta *Não diluir o suficiente  Obs: Para evitar falsos negativos no Elisa há sempre lavagem entre os processos!! (evita que Ac secundário se ligue a um Ac primário não grudado ao Ag). 
 Ac policlonal = Resposta policlonal => vários Acs diferentes de vários clones diferentes específicos para diferentes epítopos de um mesmo Ag!! Toda resposta fisiológica é policlonal! Vantagem do Ac monoclonal: * Saber onde ele se liga exatamente e ter para sempre!!  
 
 
Avanços e usos dos Ac monoclonais  Imunohistoquímica: * Uso de Ac monoclonal marcado em um tec. revelado por reação química. Ex: saber se existe linfócito T helper em diferentes tecidos (marca Ac contra CD4).  * Tec. por Fluorescência ou reações enzimáticas.  ‐ Forma direta: Ac monoclonal primário é marcado. ‐ Forma indireta: Ac monoclonal primário não é marcado e o secundário é marcado. Técnica mais barata!  Marcação de células em suspensão: *Ac monoclonal para revelar a presença de substância na superfície celular. Pode ser revelado por:  CITOMETRIA DE FLUXO: células permanecem vivas; uso de citômetro. CITOCENTRIFUGAÇÃO: centrifuga e faz microscopia!! Aí é o técnico que conta as células marcadas pelo Ac. As células são mortas; não é muito sensível e dá muito trabalho contar células => não é muito usado!  Vantagens do citômetro: mais rápido, maior sensibilidade e não mata células.  Citometria de fluxo: Laser => usado em microscópios de fluorescência Propriedades: Feixe de fótons; mono cromático; coerente e colimado. A cor mais usada para o laser é o AZUL que ao atingir moléculas as excita e quando elas voltam ao normal liberam luz de diferentes cores!! Utiliza‐se fluorocromos que imitam cores com espectros diferentes e assim em uma mesma suspensão de células pode‐se ver diferentes cores significando diferentes Acs para diferentes Ags!!  Radioisótopos: Ac conjugados a substâncias que emitem radiação. (ex: CD4). É feito p/ tratamento direcionado por radioterapia. Aí ao invés de se emitir radiação por fora (que pode lesar pele e outros órgãos sendo bem menos direcionado) se coloca radionucleotídeos acoplados à Ac específico p/o órgão alvo!!  4) Conjugação c/pró‐droga: Conjuga Ac c/pró‐droga que só deve se ativar no órgão alvo (sítio de atuação) que é o sítio em que o Ac reconhece o epítopo.  5) Ac bioespecíficos: Cada valência do Ac se liga a um Ag diferente. Ex.: ligação em célula tumoral e célula citotóxica aproximando‐as e permitindo maior interação e morte de célula tumoral. 
 6) Bloqueio de fatores: Ex.: “joga” Ac anti‐citocina para diminuir a reação provocada por esta citocina no organismo!!  
CITOMETRIA DE FLUXO  Obs: céls sobrevivem no ágar c/meio de cultura e ainda ficam imóveis.  uso experimental – bem mais comum!! Uso diagnóstico  Citômetros (a evolução permite ver mais coisas em cada cel): EpicsAltra, Facscalibur (mais comum em lab diagn), Moflow (alta performance. 1 milhão de céls/hora. Vê 13 coisas simultâneas)  CD25 – receptor p/IL2 (estimula crescimento celular)  Céls naïve – CD45Ra (cél “ingênuas”/não entraram em contato c/Ag) Céls de memória – CD45Ro (céls de memória já!!)  
PORÇÕES DO CITÔMETRO  câmara de fluxo Amostra entra por baixo. Céls entram uma a uma e são atingidas pelo laser (azul). Alguns feixes ... são desviados, mas seguem em frente, sendo detectados pelo detector forward sootter (FSC) outros são desviados p/o lado, sendo detectados pelo detector sidescatter (SSC)  O que diz cada detector?     FSC – compara TAMANHO da céls     SSC – compara COMPLEXIDADE das céls Complexidade = qnts organelas e outras coisas tem na cel!! (dependedo que tem no citoplasma – define o desvio de luz)  Detectores criam em gráfico (DOT PLOT) Assim identifica‐se a cel q está passando!! Mas e os Ac grudados nelas? P/saber se a cel possui Ag na superfície e aí tem Acs grudados deve‐se passar p/a análise da fluorescência emitida, de que cor e com qual intensidade!! Obs: FSC e SSC detectam desvio da luz azul!!  As cores emitidas pelos Acs excitados são detectadas por outros sensores. O mais curioso é que os sensores que detectam as diferentes cores são iguais entre si, mas o que muda é que no meio do caminho dos raios há espelhos diferentes que refletem só um tipo de cor e aí esta é captada pelo detector!! (D)  Aí esses detectores tb geram gráficos. São os HISTOGRAMAS  Td cél tem uma fluorescência intrínseca, mas qd há marcação do Ac ele aumenta essa fluorescência em céls positivas!!  
USO DIAGNÓSTICO OU DE CONTROLE: paciente HIV+ precisa ser acompanhado para saber o número de céls CD4+ circulantes. Se este número cair mt deverá trocar o tratamento antiretroviral!! Para isso: 1° ‐ extrai o sangue 2° ‐ faz‐se imunofluorescência direta p/marcar linf. CD4 e CD8 3° ‐ divide‐se o sangue em 4 tubos: controle (s/Acs) Ac anti CD4 FITC (conj c/fluorescência) Ac anti CD8PE Ac anti CD8PE + Ac anti CD4 FITC 4° ‐ passa o sangue no citômetro 5° ‐ analisa o DOT PLOT e informa ao aparelho “quem é a cél” de interesse (escolhe o GATE). Isso no controle!! 6° ‐ ajusta o equipamento p/que mais na esquerda do gráfico fiquem as céls c/menor fluorescência e mais p/baixo qd tem tamanho pequeno!! 7° ‐ avaliar os gráficos gerados em cada tubo!!  Na prática: exame padrão ouro utiliza marcação: CD3 + CD4 + CD8 pq? Pq há céls que tem CD4 e não são linfócitos e que tem CD8 e tb não são! Linf T helper – CD3 + CD4 Linf T citotóxico – CD3 + CD8  CD34 – céls tronco hematopoiéticas CD39 –   Maior expressão de CD69 na memb e aí mais Ac se liga e maior é a fluorescência!  Há tb testes funcionais ... neutrófilos Geralmente produzem radicais livres oxidados que liberam p/matar microrganismos Podemos testar a geração desses radicais pelo TESTE OXIDATIVO * utiliza‐se um complexo (DHR) que qd oxidado libera luz     2) doenças malignas No DOT PLOT ...   Cél cinza – normais   Cél negra – fenótipo aberrante e em maior quantidade (marcadores indevidos)  SORTING Obs: isolar céls por uma característica específica q vc determina (tamanho, complexidade, marcador p/CD10, CD19). Dps pode ser complementada pelo DCR p/ver se há mutação no marcador!  O equipamento é constituído por um cristal bisoelétrico (transforma en. Eletrônica em cargas positivas ou negativas). Aí coloca carga nas gotículas que contém em seu interior células com a característica desejada. Depois coloca‐se a gotícula entre 2 placas carregadas para isolá‐la das outras gotículas não marcadas.   
COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE 
 
  Os anticorpos não são os elementos fundamentais de resposta imune. As moléculas presentes na superfície de células chamadas moléculas de classe I e de classe II é que desempenham um papel fundamental, apresentando antígenos aos linfócitos T.   CPH = Complexo Principal de Histocompatibilidade – conjunto específico de genes localizados em um dado cromossomo e cuja função não era muito bem esclarecida antigamente. Acreditava‐se que a função era diferenciar um indivíduo de outro causando rejeição de tecidos e órgãos, mas isso não seria uma função “inteligente”. Independente disso, esses genes realmente definem se haverá ou não compatibilidade entre os indivíduos e se ocorrerá rejeição além de regular outras funções de imunidade.       Compatibilidade = aceitação de transplantes       Incompatibilidade = rejeição de transplantes  
HLA:   As diferentes espécies de animais possuem CPH diferentes e próprios. O CPH dos seres humanos recebeu o nome de HLA, pois inicialmente acharam que as moléculas de complexo eram encontradas apenas na superfície de leucócitos, mas na verdade estão em várias células diferentes do organismo, até células que não são do sistema imune.  
Rejeição de Transplantes   A idéia de que os genes de HLA regulam a rejeição de transplantes vem do fato que a rejeição é rápida, em curto período de tempo (aguda), quando os indivíduos possuem HLA diferentes (incompatibilidade).   Mas se sabe que, mesmo quando HLA é idêntico entre os indivíduos, existem antígenos menores de histocompatibilidade (antígeno menor) que não  fazem parte de HLA, mas podem levar à rejeição mais lenta  e gradual de transplantes (crônica). Essa rejeição pode ser controlada e evitada por uso de imunossupressores.    
Conclusão:    ‐ Somos diferentes um dos outros em vários genes.    ‐ A principal diferença que causa rejeição é em HLA (aguda).    ‐ Mas há também antígenos menores que levam à rejeição (crônica).  
Reação Leucocitária Mista ‐ Revela muitos aspectos do sistema imune. ‐ Mistura dos soros de 2 indivíduos diferentes (contém leucócitos): gera uma ativação celular muito forte com ativação, proliferação e secreção de mediadores.  Podemos evitar que uma das populações de um dos soros responda à presença de outra e vemos apenas a resposta dessa outra ou vemos as reações de ambas, uma cotra a outra.   Para evitar confusões misturamos soros com o mesmo ABO e Rh.   Essa reação leucocitária mista é uma reação imunológica, pois tem memória (2ª vez é mais intensa) e especificidade de resposta.   Ela é uma excelente maneira de verificar a compatibilidade entre dois indivíduos quando há necessidade de transplante: quanto mais intensa a reação, maior é a chance de rejeição.   A resposta que vemos na reação leucocitária mista é uma resposta dos linfócitos T. Nenhuma outra célula do organismo responde à incompatibilidade entre HLAs. Nesse caso específico, os linfócitos T são CD4+ (Thelper), pois reagem e se proliferam contra os leucócitos do outro indivíduo. Portanto, quem responde são os linfócitos T CD4+, mas quem provoca a resposta podem ser outras células do sistema imune.  
Outras Maneiras Diferentes de Diferenciar HLA 
  
Detecção de anticorpos anti‐HLA No soro de indivíduos que recebem transfusão sangüínea de um doador com HLA diferente, vemos muitos anticorpos anti‐HLA. Obs.: para fazer transfusão se faz apenas teste de compatibilidade entre ABO e Rh, outros não.   No soro de mulheres que tiveram gestações normais e desenvolveram anticorpos contra HLA de origem paterna presentes no feto. Nem toda resposta imune leva à destruição dos tecidos. Esse evento prova isso. A mãe tem anticorpos contra HLA fetal, mas não o destrói.  Anticorpos monoclonais: Facilita a detecção de anticorpos anti‐HLA em alta quantidade. Permite a tipagem  dos antigenos de HLA, assim como também o fazem o soro de receptores  e de mulheres ex‐grávidas.  
Moléculas de Classe I   Encontradas inicialmente na superfície de leucócitos e não em hemácias.     Estão na superfície da maioria das células nucleadas do organismo. São antígenos de superfície. Produtos de HLA.   São proteínas idênticas em todas as células nucleadas do organismo, mas diferentes entre os indivíduos ‐ marcador imunológico que confere a individualidade.   São moléculas polimórficas, ou seja, há uma grande variabilidade genética nos genes que codificam essas moléculas diferente, mas todas funcionais. (outros genes polimórficos: cor de olho, cabelo, pele, ...) Obs.:há genes cuja variabilidade leva à doenças  ex.: gene da globina ‐ anemia  falciforme                   Essas moléculas de classe II funcionam como Aloantígenos (Ag de doador) para o soro de indivíduos diferentes (incompatíveis) e geram resposta imunológica. 
   
 
As moléculas de classe I de um indivíduo:    Cada pessoa normal tem pelo menos três genes diferentes em um msm cromossomo, que codificam cada um deles, uma molécula de classe I. Eles estão próximos nos cromossomos e codificam: HLA‐A, HLA‐B e HLA‐C. Como recebemos de nossos pais um cromossomo com 3 genes e de nossa mãe outro cromossomo homólogo com 3 genes para HLA, sendo a maioria dos indivíduos heterozigotos, expressamos 6 moléculasde classe I diferentes!! Padrão de co‐dominância (todos são expressos). Aí, na superfície de uma msm célula existe várias moléculas de classe I diferentes coexistentes.     
A estrutura do MHC I São 3 elementos que a constituem: 
Polipeptídeo com três porções globulares e porção transmembrana de 
inserção: é o produto dos genes de HLA (A, B ou C) 
Ptn globular: é sempre a msm para todas as moléculas de classe I de todos os indivíduos (não é polimórfica). 
β2 microglobulina: se associa indiferentemente a todos os produtos de HLA de classe I. Função de estabilizar o complexo. Não é produto de HLA. É codificada por outro cromossomo.  
Na estrutura de MHC I é inserido: 
Peptídeo: fragmento de ptn ALTAMENTE VARIÁVEL ENTRE AS MOLÉCULAS DE CLASSE I. Sendo diferente entre moléculas de classe I do msm tipo (A p.ex.) de um msm indivíduo. É um fragmento de ptns do próprio organismo ou de microorganismos que infectam o organismo. Sempre deve haver a dissociação entre MHC I e esse peptídeo para q a MHC I fique na membrana.  
 Ou seja: As moléculas de classe I possuem todas uma semelhança estrutural que garante q sejam expostas na memb. E realizarem funções. Mas apresentam uma diversidade pela genética tb mto importante. (esquema semelhante aos anticorpos)  Dentro de um indivíduo, cada gene de HLA (A, B ou C) possui 2 formas alélicas ( 1 do pai  outro de mãe)!!  As moléculas CI são “parentes” dos Ac. Os 3 domínios globulares de MHC I são semelhantes ao domínios dos AC!! As MHC I são as moléculas de HLA + abundantes no organismo, mas há tb outras moléculas de HLA especializadas, presentes apenas em células do SI!! 
 
 
Moléculas de Classe II 
 Presentes apenas em algumas células do SI: macrófagos, céls. Dendríticas e linf. B. Expressas na sup. Celular, se ancoram na membrana. Céls que expressam MC II tb expressam as MC I!  
Estrutura: 2 cadeias polipeptídicas (α e β) cada uma com 2 porções globulares  Ambas codificadas por genes de HLA diferentes dos genes de HLA para MC I Uma msm região de HLA codifica a cadeia α e β de um dado tipo de MC II São várias regiões diferentes codificando pares α‐ β diferentes. Ex.: regiões DR, DQ e DQ codificam HLA DR, HLA DQ e HLA DP! Essas regiões estão separadas, mas no msm cromossomo dos genes q codificam as MC I!! O q faz com q apenas algumas céls. do SI expressem MC II é q apenas elas  possuem os fatores de transcrição!! Existem diferentes MC II na superfície d um msm macrófago (co‐dominância) MC II são altamente polimórficos (mtos genes diferentes e geralmente cada indivíduo é heterozigoto: alelos do pai e da mãe). Possui tb o PEPTÍDEO ALEATÓRIO entre cadeias α e β.  Conclusão: Se somarmos toda a variabilidade para MC I + a variabilidade de MC II vemos q HÁ UMA GRANDE DIVERSIDADE ENTRE OS TECIDOS DOS INDIVÍDUOS ‐ A REJEIÇAÕ É A REGRA! O DIFÍCILÉ A COMPATIBILIDADE!!       Estimativa de se achar um doador compatível: 1 em 143000!!!  O polimorfismo de HLA se expressa de 2 formas: MC I MC II 
 A capacidade de se ativar uma resposta leucocitária mista depende inicialmente da diferença entre moléculas de classe II, pois o estímulo para a reação ocorrer são Ag C II 
presentes na superfície de células do SI (macrófagos, linf. B) reconhecidas por linfócitos T helper (CD4+) que respondem com intensa proliferação clonal e produção d citocinas!!  
O que é compatibilidade? 
 Indivíduos podem ser compatíveis para HLA, ou seja. Possuem HLA iguais e podem ser compatíveis para as moléculas menores de histocompatibilidade (são iguais entre os indivíduos). Quando há compatibilidade para os 2 – EVITA REJEIÇÃO EM 100%. Quando há compatibilidade apenas para HLA – REJEIÇÃO AGUDA é EVITADA, mas pode ocorrer a crônica!! (evitada por imunossupressão).  
Atenção!! 
  Entre indivíduos diferentes e entre moléculas de histocompatibilidade de um msm indivíduo, a variabilidade genética é concentrada nos domínios + externos (regiões variáveis) que se associam ao peptídio aleatório!!Já a porção + interna contém os domínios altamente conservados (ctes)!! 
 Os linfócitos T CD4+ só reconhecem MC II e é esse reconhecimento que INICIA O PROCESSO DE REJEIÇÃO!!  Portanto, a reação leucocitária mista possui 2 fases:  
1ª fase: linf. T CD4+ respondem às MC II de sup. de macrófagos e então se proliferam e secretam mediadores (citocinas) que influenciam em outras céls. do SI!! (p.ex.: linf. T CD8+). Os linf. T CD8+ são os linf. T citotóxicos que qndo ativados são capazes de matar Ag estranhos estimuladores, mas para matá‐los precisam reconhecer MC I.(fase inicial)  
2ª fase: linf. T CD8+ respondem às MC I de sup. De várias céls, como tb os macrófagos e MATAM‐NOS – Fase efetora! Os linf. T citotóxicos só são ativados qndo linf. T helper sinalizam!! Geralmente eles estão inativos! (incapazes de resp.).  
Atenção: Os linf. T CD4+ têm papel central, mas não absoluto na rejeição de 
transplantes. 
 
 
Hierarquia na Resp. Imune 
 
  A rejeição de transplantes depende de interação entre populações celulares e cada população tem uma função!! Linf. T CD4+: reconhece Ag em MC II e ativam linf.CD8+ e outras céls (macrófagos, linf. B). Linfócito CD8+: mata células que reconhece como “estranhas” por MCI.  Transplante de tireóide.   A tireóide (células do parênquima e estroma) “sobrevive” em temperaturas reduzidas (geladura) por um bom tempo fora do corpo.   Constataram que o transplante imediato de tireóide de um indivíduo para outro incompatível leva à rejeição, mas se a tireóide for mantida for mantida por um 
tempo na geladeira e depois transplantada para o receptor, NÃO OCORRE 
REJEIÇÃO! Por que?   Descobriu‐se que apesar de o ep. tireoideano sobreviver a baixas temperaturas, os leucócitos (macrófagos) residentes de tireóide morrem e aí não há rejeição, pois 
não há apresentação de antígenos em MHCII para os linfócitos CD4+ e aí não dá 
inicio à rejeição!!   Ou seja, é a presença de macrófagos residentes na tireóide (células dendríticas) que, ao apresentarem MHCII aos linfócitos CD4+ do receptor, promovem a rejeição.   Portanto, os leucócitos com MHCII residentes dos nossos tecidos e órgãos é 
que permitem a rejeição ­ Tudo é como e por que começa a rejeição.       
Resposta imune celular    
 
  Resposta imune celular: descoberta em animais experimentais. Diferentemente da imunidade humoral (imunização passiva por transferência de Acs) a imunidade celular não pode ser transferida entre indivíduos, pois é dada pelos linfócitos e estes possuem moléculas de HLA e promovem rejeição. A imunidade celular atua contra infecções virais e micobactéria. Se transferíssemos linfócitos de um individuo para outro, eles seriam rejeitados.  
Experimento: Análise da resposta imune celular. Específica p/ que? 1‐ Pegamos os linfócitos TCD8+ do soro de indivíduos que foram infectados pelo vírus influenza e se curaram.  OBS: Os linfócitos TCD8+ aparecem no soro quando a pessoa está em fase de recuperação de infecção e como são citotóxicos destroem as células que contém o 
vírus da influenza.   Essas células infectadas são verdadeiras “fábricas de vírus” produzindo muitas proteínas virais em seu interior.  2‐ Se misturarmos linfócitos TCD8+ de ind. em recuperação + cels. infectadas 
pelo vírus influenza do mesmo indivíduo, os linfócitos TCD8+ destroem as cels. 
Infectadas pelo vírus influenza. 2*‐ Se as cels. do individuo não estivessem infectadas ou estivessem infectadas 
por outro vírus, NÃO HÁVERIA DESTRUIÇÃO! 
OBS:2 e 2* ­ especificidade para o vírus influenza. 
 3‐Se pegarmos, por outro lado, células de outro indivíduo infectado pelo vírus 
influenza, o linfócito T citotóxico pode ou não destruí‐las, dependendo das diferenças em HLA.   Nesse caso específico, vemos que quando o HLA(A) é diferente, o linfócito 
TCD8+ não destrói as cels. Infectadas do outro individuo. 
 4‐ Mas quando o outro indivíduo também possui HLA (A5) e está inf. pelo 
vírus influenza, o linfócito T citotóxico destrói as células. 
 
OBS:3 e 4 ­ especificidade para a molécula de HLA.Conclusão:A especificidade do linfócito T citotóxico é para 1 molécula de HLA de 1 tipo apenas e apenas quando esta célula está infectada por um tipo específico de vírus.   Isso ocorre pois é provavelmente esta MCI que mostrou uma parte do 
vírus! Provavelmente tem a ver com o peptídeo aleatório!    
A resposta imune celular também é policlonal­  Diferentes linfócitos T reconhecem a mesma célula infectada por um dado vírus por meio de diferenças de MCI.  
Muito importante: A resposta imune celular não distingue o próprio (self) do 
não­próprio (non­self) e sim reconhece a interação entre os 2. O vírus influenza não existe para o linfócitoTCD8+ quando livre no meio, apenas quando está associado a uma MCI do organismo. A fusão entre próprio e não­próprio é que é reconhecida como 
estranha e atacada. 
 
 
 
Função real das MHC (HLA). Elas não servem para rejeitar transplantes até por que essa é uma situação artificial, que a natureza não previa. Servem para auxiliar na resposta imune celular ao expor antígenos não­ 
próprios.   Os vírus, por exemplo, estão “escondidos” dentro das células e para serem destruídos, as células infectadas também serão. Elas têm um papel fundamental nisso ao expor um pedaço de vírus em sua superfície indicando infecção. 
 
Mecanismos de exposição de antígenos:   O vírus começa a ser sintetizado no citosol e entre ele e a membrana existe o RER que é o local de síntese dos HLA (proteínas de membrana são sintetizadas no RER).   Assim, o vírus precisa chegar até o RER para se unir ao HLA e ser exposto 
na membrana junto à ele. Como?   Ubiquitinas são proteínas que marcam as proteínas que vão para o proteossoma serem degradados. Assim tanto proteínas da própria célula, quanto proteínas virais ubiquitinizadas quando passam próximo ao proteossoma serão 
degradados em pepitideos. É um processo aleatório, independe de a ptn. estar 
defeituosa ou normal.( há porém uma sinalização bioquímica). 
  Os pepitideos gerados no proteossoma vão para o RE. 
  A membrana do RE possui um sistema de bombas especializadas no 
transporte de peptídeos: TAP1 e TAP2 (transporte associado ao transporte de antígenos) que gastam ATP para colocar peptídeos para dentro do RE, concentrando­
os e transferindo­lhes para próximo ás moléculas HLA em formação. Aí eles grudam fortemente as moléculas e são expostos na membrana junto a eles. 
 
  A principio, esse processo é desvantajoso para a célula, pois a maioria dos peptídeos gerados e apresentados junto à MCI (nesse caso) são derivados de proteínas da própria célula, mas em células infectadas, geralmente predominam peptídeos 
virais. Mas é claro que peptídeos próprios também são expostos.   A resposta imune não pode ser explicada apenas pelo imenso repertório de peptídeos expostos em mol. HLA na membrana! O repertório de linfócitos T tem que 
bater com esse repertório de peptídeos e para haver resposta não basta o reconhecimento! Vários outros fatores estimulatórios devem estar presentes!  
Informação do momento atual: .   Se o peptídeo viral grudar em proteínas que não MCI, o linfócito TCD8+ não o reconhece! Então, a produção de MCI é constante para coincidir com a degradação 
de proteínas virais. Mas o mais importante é que a membrana celular mesmo assim não fica repleta de MCI, pois há renovação das moléculas a todo momento. Portanto, a presença de MCI com peptídeo viral na membrana é momentânea e indica um perigo 
atual.   A resposta imune não é uma resposta de resistência a infecção, até por que, receber tecido sadio não causa infecção, mas provoca resposta imune. Os antígenos de transplante (moléculas de histocompatibilidade) não têm nada a ver com transplante e sim com nossa resposta!   Somos diferentes, pois as moléculas de classe I de uma pessoa é diferente de outra e assim o vírus pode matar uma pessoa e não fazer mal à outra. Isso por que a 
resposta celular depende do reconhecimento simultâneo entre vírus e HLA (self) 
pelo linfócito T! (diferente do linfócito B que só reconhece o epítopo estranho).   Cada linfócito T possui uma estrutura de reconhecimento específica para reconhecer o antígeno viral no HLA próprio (self) do tipo MCI. É esse 
reconhecimento híbrido necessário que também impede de doar linfócitos TCD8+ 
de um indivíduo para outro, pois ele só reconhece antígeno unido à MCI próprios. 
­ Repertório personalizado!   O repertório dos linfócitos T possui essa especificidade hibrida devido ao tipo de seleção que ocorre durante a criação de diversidade neste repertório...   O repertório dos linfócitos TCD8+ é selecionado antes de ser usado e as 
células que são clones capazes de reconhecer o HLA do próprio organismo são 
escolhidos e as céls. que “não ligam” para o HLA próprio são descartadas.(seleção 
positiva) 
  Entretanto, ao contrário do que parece, esse não é um processo auto‐imune, pois 
as classes selecionadas devem ser capazes de reconhecer antígenos nos HLA 
próprios. É por isso que linfócitos TCD8+ só reconhece as células infectadas e não as do seu vizinho. (não dá para imunizar passivamente na resposta imune celular).    É importante ressaltar que o processo de formação do repertório dos linfócitos B é diferente dos de linfócito T, por que enquanto há seleção positiva dos linfócitos T que reconhecem o “ self” , há seleção negativa dos linfócitos B que reconhecem o “self” (são descartados)!      
IMUNODIAGNÓSTICO 
 Interação entre Ac e Ag (in vitro) para fins diagnósticos  Detecção de Ag e Acs  Ag + Ac   Ag...Ac                          Î                   São ligações fracas entre Ag e Ac e portanto reversíveis. O processo de associação e dissociação de Ag e Ac não governados por constantes (Ka e Kd respectivamente)   Ka = [Ag:Ac] / [Ag] [Ac]  Kd = [Ag] [Ac] / [Ag:Ac]  Assim, dependendo da força de interação entre Ag e Ac teremos mais complexos imunes (Ag+Ac).  Forças de interação:       Pontes de H; pontes iônicas (interação entre aminoácidos); interações hidrofóbicas (não interferem bem com a água e aí se agrupam, assumindo uma estrutura tridimensional globular, p ex, expondo apenas as porções hidrofóbicas na superfície).       São todas interações muito fracas, bem mais fracas do que ligações covalentes. O que faz com que a ligação Ac‐Ag seja estável é a soma de várias interações entre 1 mesmo Ag e Ac. Essas ligações são estáveis e específicas!!  Lembrar de Ig:      IgG cadeias leves e pesadas interagem por forças fracas e pontes de dissulfeto.             sítios de ligação de antígeno : porção N‐terminal das cadeias pesadas e leves!! Numa mesma Ig todas as valências reconhecem o mesmo antígeno!             na maioria das situações, o antígeno é infinitamente maior que o anticorpo, e este irá se ligar, portanto, a uma pequena parte da superfície do antígeno (epítopo)      Existem antígenos que são apenas um epítopo (haptenos). Eles são antigênicos (reconhecidos por anticorpos) e só precisam de carreador para ser imunogênico (provocar produção de anticorpo)!!       O Ac pode se ligar com as 2 valências em um mesmo antígeno, desde que existam nessa partícula epítopos iguais muito próximos. Mas na maioria dos casos os anticorpos ligam 2 partículas diferentes (aglutinação). 
       O sítio de ligação de Ag no Ac tem forma complementar ao Ac!! Na realidade, os sítios são ondulações suaves na estrutura do Ac!! Isso garante que os dois, ao interagirem, encaixam perfeitamente e não se aproximam ao máximo (modelo chave­
fechadura). OBS: Hemácias são enormes e tem carga positiva em sua superfície. Então se repelem entre si. Por isso IgG não é capaz de aglutinar hemácias normais. Mas em alguns casos IgG pode aglutinar partículas (ex1: quando IgG atua sobre salmonellas cujos epítopos estão nos cílios de bactérias que se aproximam ou ex2: hemácias sem cargas).  
EPÍTOPO        Varia entre 7 e 15 aminoácidos do Ag (bem pequeno)        Porção que interage com o Ac e portanto não pode interagir com muitos aminoácidos. Na cadeia leve + cadeia pesada apenas9 aminoácidos do Ac no total interagem com o epítopo.  
DETECÇÃO DE Ag E Ac         Intenção do Imunodiagnóstico: formar imunocomplexos        Se um indivíduo tem sintomologia e realmente estiver infectado, ele deve ter Ac anti‐Ag específico no soro.        Vemos imunocomplexos entre Ag e Ac para comprovar:  
   Em uma IgG... Os “braços” do Ac são móveis e quando a angulação é de 180o, eles ficam distantes e ligam Ag. Mais distantes, maior corbetura de raio.     Diferença entre afinidade e avidez:          Afinidade capacidade de reconhecer o epítopo.          Avidez soma de todas as afinidades     Imaginemos uma situação em que os epítopos estão em dezenas de milhares sobre a superfície da célula. Como os epítopos são iguais, dois epítopos se ligam um em cada sítio do IgG (bivalência).      No caso de apenas um Ag ligado ao Ac é bem mais fácil separar do que quando há dois Ags ligados ao Ac. Isso porque, no último caso, a avidez é muito maior! Aí é mais comum soltar primeiro um Ag e só depois o outro. Quando o anticorpo é decavalente, a avidez é maior ainda!!!  
REATIVIDADE CRUZADA       Um mesmo epítopo pode estar em diferentes ptns de diferentes microorganismos (Leishmania e vírus do HIV). Então um AC para esse epítopo pode agir contra ambos e uma pessoa que já teve leishmaniose pode dar positivo para HIV (falso positivo).       *Definição de causa:             1) Dois Ags diferentes compartilhando um epítopo idêntico            2) Ac específico para um epítopo liga‐se a um epítopo não relacionado que tenha propriedades químicas semelhantes (corpos, estrutura), porém com menor afinidade do que com o epítopo “original”.           Ex: 1) As vacinas se baseiam no princípio da imunoreatividade.                                       ‐Vacina contra varíola 
                                      ‐M. bovis da BCG X M. tuberculosis (epítopos iguais nas duas espécies de microorganismos). O M. bovis perde a capacidade infectante, se adaptando a vida em cultura. Porém tem baixa eficácia.                2)Grupos sangüineos                                       ‐ antígenos A e B são açúcares encontrados tanto em hemácias quanto na superfície de bactérias comensais da flora intestinal. São idênticos entre bactérias e hemácias.  
FORMAÇÃO DE IMUNOCOMPLEXOS PARA DIAGNÓSTICO  ‐ Placa de Elisa contendo Ag específico exposta ao soro do paciente. Se imunizado (com Ac), o soro deve reagir com os antígenos para formar imunocomplexos. ‐ Colocar soro na placa. ‐ Fases de lavagem para evitar que Ag soltos ou Ac soltos dêem falsos positivos. ‐ Marcação para ver imunocomplexos formados (sistema revelador: fluorocromo, radioisótopo e enzima).   
ANTÍGENO ÍNTEGRO           Podemos usar Ag por meio de incubação de parasitas (Ag íntegro) nas lâminas e depois colocar soro de um paciente infectado ou não. Se der positivo, aparecem imunocomplexos, apresentando Igs no soro.        Os imunocomplexos podem ser marcados por fluorescência.                 ‐ a ptn A tem alta afinidade pela parte constante de Ig e é acoplada à fluorescência e aí marca os Igs.                                                                                                                              
ATENÇÃO 1: só fica fluorescente se houverem Acs no soro e ai a ptn A com fluorescência se gruda ao Ac e quando olharmos na lamina vemos! 
ATENÇÃO 2: não marca o Ag, marca depois o Ac. Obs: não cora Acs errados pois eles são lavados.    
Outras formas de Ag usados além do íntegro: Extrato:parasita lisado, usa apenas o extrato.( brutos/ semipurificado) Purificado: sem membrana, evita que Acs normalmente formados reajam. Recombinante: gene de micobactérias é colocado em E.coli para produzir ptns que são os Ags. Peptídeo    Obs: as Igs humanas são reconhecidas por outros organismos (animais) como antígenos e geram então Acs que podem ser usados como anti‐anticorpos. Esses anti‐anticorpos podem ser ligados a uma enzima (ex HRP) ou a fluorescência que os marca sendo chamados de conjugado.   * Quando fazemos interação entre Ags e Acs devemos saber quantos epítopos existem para ai existirem tantos Acs.   ‐ soro policlonal: nossos Acs para diferentes epítopos de um mesmo Ag e irá formar um macrocomplexo (rede tridimensional) e aí pode ocorrer:    Precipitação: Ac solúvel e Ag também solúvel.     Aglutinação: Ac solúvel mas Ag insolúvel.       Quando tem muito anticorpo ou muito antígeno não aglutina (não forma rede). Deve‐se trabalhar em uma faixa de equivalência entre Ag e Ac.   
Hemaglutinação indireta quantitativa (sorologia da doença de Chagas): 
 1) Placa de hemaglutinação: plástico que repele ptns, portanto não absorvem‐nas, não tem afinidade. As hemácias não aderem à parede. Os poços são em forma de cone. São mais ou menos 96 por placa. 
 Ex: ptns de T. cruzi + hemácias de carneiro: hemácias recobertas “in vitro” por reações químicas com ptns (Ags) de T.cruzi.   Pega‐se essa mistura de hemácias recobertas e coloca em um dos poços e ai as hemácias precipitam e ficam no fundo d poço(hemossedimentação).   Quando jogamos Ac do soro de um paciente chagasico no poço o que acontece é que os Ac antiAg presentes na superfície de hemácias se ligam a essas hemácias formando uma rede e impedindo que as hemácias sedimentem. Não há ponto preto no centro do poço. Obs: se tem muito Ac a rede é muito grande e não há nenhum pontinho no centro do pocinho. Se não houver muito Ac ai algumas hemácias sedimentam e formam um pontinho rosa claro no centro. Se não houver Ac todas as hemácias sedimentam e fica um pontinho preto.   
ELISA­  Ensaio Imunoenzimático  Pocinhos em placas diferentes (placa de ELISA): fundo não é cônico, é achatado e também aderem ptns. Pega solução de ptns de T.cruzi e coloca num pocinho por um tempo ai as moléculas protéicas aderem às paredes do pocinho: “sensibilização”. Forma‐se varias camadas de Ags. Lavagem com tampão TBS que quebra forças fracas entre ptns e deixa apenas uma monocamada de antígenos de T. cruzi.        4) Adição do soro que pode conter Ac específicos para ptns de T.cruzi e outros Acs também. No caso de um paciente que não é chagásico não há Ac anti T.cruzi.     Dá‐se 1 hora mais ou menos que é para Ac ligarem Ags.        5) Lavagem: elimina todos os Acs que não ligaram nos Ags de T. cruzi (ou seja, elimina todos os Ac de pacientes não doentes). No soro do paciente sadio não sobra nada e no do doente sobram imuno complexos Ag‐Ac T. cruzi.        6)Primeira revelação:  “Joga‐se” anti‐corpos marcados com enzima no poço. No caso de um poço positivo há ligação dos Acs ligados à Ags ( DUPLO CONJUGADO: Anti Ac conjugado + Ag‐ Ac). Já no negativo eles ficam soltos.         7) Última lavagem        8) Revelação: A enzima funciona como “bandeirinha” que acusa a presença do Ac! Adicionamos um substrato incolor e solúvel que irá ficar colorido por ação da enzima = vemos amarelo.        A utilização de Elisa é mto mais comum e mais usada pois: ‐ não precisa usar hemólise ‐ a reação enzimática é uma etapa de amplificação de sinal ( poucas enzimas agem sobre vários substratos) que permite uma alta sensibilidade do teste dando positivo mesmo que a pessoa tenha poucos Acs!    Portanto o Elisa pode ser quantificado (a intensidade é quantificada por um programa), evita subjetividade da observação da hemossedimentação.    Quanto mais produto = mais intensa coloração. 
   Essa placa é submetida a um espectrofotômetro e aí o produto colorido emite uma luz quantificável. Obs! O produto não é insolúvel! É solúvel e ai não precipita, o q é mto importante para deixar passar a luz!  Atenção: Se não fizermos a 1ª lavagem pode dar falso negativo! (Ac gruda em camada superior e é lavado nas lavagens seguintes).      Usar mistura de Ags numa placa de Elisa não dá pra saber para qual dos Ags a pessoa tem Ac! Portanto devemos ter um teste confirmatório que confirma esse diagnóstico imunológico! É o Western Blot.   Western Blot  ‐Separa ptns por tamanho em um gel de eletroforese (migração de moléculas em conseqüência a um campo elétrico).‐ Desnaturamos ptns com SDS que confere a todas as ptns carga negativa de modo que todos migrem para o pólo positivo, moléculas pequenas passam mais rápido pelo gel e as grds demoram. ‐ Assim, se separa Ags por tamanho. ‐ A transferência dessas ptns para uma membrana de nitrocelulose é chamada Blot – Western Blot e vemos no fim bandos de marcação do tamanho das ptns na m. de nitrocelulose. Cortamos então as tirinhas e colocamos nas canaletas (finas membranas de nitrocelulose com bandas de marcação das ptns). 
       Nas caneletas com tirinhas, colocamos o soro do paciente contendo Ac anti‐Ags presentes na tirinha. Mas aí,como sabemos qual faixa horizontal é cada Ag, sabemos que se aparecer uma banda em tal faixa,é porque havia Acs contra o Ag  no soro do paciente.       Os Acs do soro grudam, então, no Ag específico. Depois, jogamos Ac conjugados marcados e aí se joga um produto insolúvel (substrato) que se transforma num produto colorido devido a ação da enzima.       Aí, o substrato se adere. Caso seja positivo, serão visualizadas todas as bandas ou apenas as bandas as quais tem Ac. Já no negativo, não serão visualizadas bandas as quais deveríamos ver. HIV: GP120 positivo e mais outras proteínas positivas!!!!!!!!!!!!       Fazemos tanto Elisa quanto o Western Blot , pois o Elisa é muito barato e por isso é usado para triagem. Já o Western Blot é usado para confirmar !!!!!!!!!!!. Ex.: No Elisa, o teste de HIV pode ser positivo e no WB negativo quando a pessoas tem Leishmaniose.    
AUTOIMUNIDADE E REGULAÇÃO  Fazemos Ac e células T capazes de reconhecer nossos Ag, inclusive Ag que não estão no timo.  Poliendocrinopatia associada ao X:  É auto imune. A partir dela, clonou‐se o gene AutoImmune Regulatory Element (AIRE), presente nas células epiteliais medulares tímicas. Transcreve um fator de transcrição que regula a expressão de Ag ectópicos no timo, em células epiteliais medulares. É importante para desinibir os promotores de genes que codificam proteínas de tecidos periféricos, expressas por células epiteliais medulares tímicas, levando à 
seleção negativa dos clones autoreativos. Assim, provoca a expressão de Ag (proteínas do tecido periférico) que não estão no timo (ectópicos): insulina, tireoglobulina.  Na ausência desse gene, há essa doença auto imune, caracterizada por candidíase, diarréia, displasia ectodérmica (lesões nas unhas do pé e boca) e alopecia: APECED (baixa incidência)  Addison’s disease Hipoparatireoidismo Hepatite autoimune Candidíase mucocutânea crônica displasia Ectodérmica com vitiligo e alopécia Diabetes tipo 1, atrofia gonadal, anemia perniciosa, hipotireoidismo  A medula tímica é o local onde a deleção é mais favorável, pois há maior quantidade de TCR e porque tem mais Ag expresso. A doença aí acontece porque tem muitos clones que reconhecem auto‐Ag, e esses clones atacam o nosso corpo, por exemplo, os queratinócitos. Sem esse gene, não expressa as proteínas da periferia, e os clones auto‐reativos não são mortos. Na pessoa normal, também não é 100% dos auto‐reativos que morrem, mas fica um n° bem baixo. Nesse caso, não há seleção negativa desses linfócitos, e eles ainda são ativados. Existe uma regulação da resposta imune, seja a que responde a Ag extrínseco ou não. Se a APC produz TGF‐β E IL‐10, inibe a expansão e a resposta dos clones. Mas a própria célula T pode produzir esses dois mediadores. As células produtoras de IL‐10 são células CD4, chamadas Tr1, e são induzidas durante a resposta imune, tendo a função e reprimi‐la.  Células produtoras de TGF‐β inibem a resposta imune: proliferação, produção de muitas citocinas: são induzidas através da inoculação do Ag por via oral. É assim que não temos reação imune a tudo que comemos. Na deficiência de TGF‐β, o indivíduo tem inflamações sucessivas ao comer qualquer coisa. Existe um tipo de célula regulatória CD4+ que pode produzir TGF ou exercer sua função na dependência de contato físico, independente de TGF. Essa célula é gerada no timo e denominada Treg. É regulatória e pode produzir TGF, IL‐10 ou não produzir nada, só suprimir por contato, principalmente as CD. Também são úteis para a eliminação de tumores. Elas têm importante papel na manutenção do controle da resposta imunológica. Elas são CD4/CD25+  e parecem células anérgicas: têm fenótipo de células ativadas,  têm os marcadores de superfície, mas não produzem IL‐2 e não proliferam quando re‐estimuladas. E ainda são capazes de inibir o crescimento de células que estiverem ativadas. Sua função efetora é inespecífica: inibem toda e qualquer célula ativada que entre em contato com ela. Quando há apenas o sinal dado pelo Ag, mas não há co‐estimuladores, os linfócitos T expressam receptores de IL‐2, mas não produzem IL‐2. Ou seja, fica congelada, não responde, não proliferam quando re‐estimuladas, mas tem fenótipo de cel. ativada As células regulatórias, ao serem estimuladas, ficam com seu receptor de superfície da célula ativado, mas não prolifera nem produz Ac e, se entrar em contato com uma célula ativa, vai inibi‐la. Se forem eliminadas, um adulto morre em 15 dias de reação inflamatória generalizada. Será que foram feitas para nos proteger de doenças auto‐imunes? O que faz da célula Treg diferente é que ela tem um gene que faz o fator de transcrição FoxP3, que suprime a ativação da produção de citocinas. Todas as células regulatórias têm FoxP3. As Treg têm esse fator e têm fenótipo de célula ativada. Esse fator de transcrição é indispensável para o surgimento e desenvolvimento das Treg. Existem as células Treg naturais, produzidas no timo, que reconhecem Ag com alta afinidade, mas não são eliminadas: passam a atuar como Treg, a expressar FoxP3. 
Existem também as induzidas, geradas na periferia, não se sabe bem por qual mecanismo, mas in vitro, a incubação com IL‐6 e TGF‐β faz com que elas passem a ser Treg. As cels Treg inicialmente só recebem 1 estímulo, o do Ag específico ao qual respondem. Aí, quando vê dois estímulos (Ag+co‐estímulos), é ativada em sua função de supressora e passa a agir inespecificamente. Minhas células Treg podem inibir as células ativas de outra pessoa. A expressão de FoxP3 é forte no baço, timo, em CD4+ e CD8‐ (ausente na CD8+ e em células B). Uma deficiência natural dessa molécula leva a uma resposta proliferativa muito maior. As cels de um animal normal, ao entrarem em contato com ciclosporina A, por exemplo, têm sua proliferação muito diminuída. Um animal com deficiência de FoxP3, a curva de proliferação demora muito para baixar: 10mg da droga diminui a proliferação do normal em 70%, mas praticamente não afeta a do deficiente em FoxP3. Ou seja, são células resistentes à imunossupressão, o paciente é tratado com altas doses de corticóides. Causa a doença IPEX: a)Imuodeficiência          b)Poliendocrinopatia         c)Enteropatia         d)X linked heritance (herança ligada ao X)   Foi descrita em 1982 com síndrome de diarréia (ataque às células intestinais, muitas vezes provoca disenteria), poliendocrinopatia e infecção fatal na infância, desenvolvimento de diabetes muito precoce, dermatite, eczema, glomerulopatia, deficiência no crescimento e desenvolvimento e no desenvolvimento neurológico. Há respostas muito grandes a Ag, pois são células muito sensíveis. Já foram encontradas mutações nesse gene em todas as partes da molécula. Geralmente, as mutações no promotor do gene levam a um fenótipo menos severo. O repertório da periferia pode não conter os clones de células T que reconhecem como sendo os mais perigosos. 
Lembrar: 100% dos nossos clones T, normalmente, são um pouco autorreativos!!!!! Nesse caso, o repertório periférico não contém os clones autorreativos, provavelmente os mais perigosos, mas contém clones que reconhecem Ag teciduais que não estavam presentes no timo enquanto se desenvolviam. Diabetes mellitus, tireoidite, oorofite, gastrites auto imunes: todas relacionadas à auto‐imunidade.Há associação entre alguns MHC e o desenvolvimento de doenças. Poucos peptídeos induzem doenças auto‐imunes. Ex.: já se sabe

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