Metodos de Imunodiagnostico 2011_1

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Métodos de Imunodiagnóstico
Walter M. R. Oelemann
Depto. Imunologia –IMPPG
Bibliografia:
Kuby Immunology 4ª ed. capítulo 6
Vaz, Takei & Bueno Imunoensaios: Fundamentos e Aplicações
Benjamini et al., Immunology, 4ª ed.
http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/ab-ag-rx.htm
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• Interação antígeno – anticorpo 
= associação bimolecular
• Reversível
• Altamente específica
• Especificidade levou ao desenvolvimento de vários 
imunoensáios
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• Imunoensaios são usados para
– detecção de anticorpos específicos em flúidos corporais 
do paciente
– detecção de antígeno patógeno-específico no espécime 
clínico
• Imunoensaios exercem papel importante 
– no diagnóstico de doenças
– no monitoramento da resposta humoral 
– na identificação de moléculas de interesse biológico ou 
médico
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• Imunoensaios diferem
– na velocidade de sua execução
– em sua sensibilidade e especificidade
– no tipo de resultado obtido
• qualitativo
• quantitativo
• Princípio:
interação in vitro entre Ac e Ag e detecção 
subsequente dos imunocomplexos formados
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AG AC AG AC+
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DETECÇÃO DE ANTÍGENOS E ANTICORPOS
AG AC
SISTEMA
REVELADOR
Precipitação
Aglutinação
MonoclonaisPoliclonais
Enzima
Radioisótopo
Fixação
do C`
Fluorocromo
Íntegro
Recombinante
Peptídeo
Extrato
Purificado
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Visão geral de imunoensaios (1)
• Interação ente Ac e Ag solúvel em solução aquosa 
resulta em uma rede tridimensional de 
imunocomplexos que, por fim, desenvolve um 
precipitado visível precipitação
• Precipitação em líquidos
• Precipitação em géis
– Imunodifusão radial (método de Mancini)
– Imunodifusão dupla (método de Ouchterlony)
– Imunoeletroforese
Tipos de epítopos (determinantes antigênicos)
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Precipitação
Excesso de anticorpo inibe a precipitação!
O Ac só pode se ligar de forma monovalente
Efeito pro-zona
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Precipitação em gel
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Visão geral de imunoensaios (2)
• Interação ente Ac e Ag particulado em suspensão aquosa 
resulta em uma rede tridimensional de imunocomplexos
que, por fim, desenvolve um precipitado visível 
aglutinação
• Hemaglutinação: tipagem ABO
• Aglutinação bacteriana: Salmonella typhi
• Aglutinação passiva
• Inibição da aglutinação
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Hemaglutinação 
• Tipagem ABO
– Misturar eritrócitos a 
serem tipados com anti-
soro anti-A ou anti-B
– Quando antígeno está 
presente na superfície dos 
eritrócitos, estes aglutinam
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Hemaglutinação indireta (passiva) 
• Eritrócitos de carneiro recobertos 
(“sensibilizados”) com mistura de antígenos 
(ex.: T. cruzi)
• Teste c/ soro de pacientes chagásicos em 
diferentes diluições seriadas
• Efeito pro-zona devido a
– Concentração de Ac demasiadamente alta 
(ligação monovalente)
– Antícorpos que ligam o Ag são incapazes 
de aglutinar
Ac incompletas (frequentemente da 
classe IgG)
– Bons Ac aglutinadores: IgM
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Inibição da hemaglutinação 
• Modificação da reação de aglutinação
• Ensaio altamente sensível p/ detecção de pequenas quantidades 
de Ag
– Teste de gravidez
– Teste anti-droga: 
• Amostra de urina incubada c/ Ac contra a droga; Adição de 
hemácias sensibilizadas c/ a droga; Ausência de aglutinação 
sugere presença da droga na urina
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Teste de gravidez 
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Radio-imunoensaio (RIA) em fase líquida ou sólida
• Ensaio mais sensitivo p/ detecção de 
Ac ou Ag
• Ligação competitiva entre Ag não 
marcado e Ag radioativamente 
marcado c/ Ac de alta afinidade
• Ag marcado misturado c/ Ac em conc. 
que saturam os sítios de ligação no Ac
• Adição de quantidades crescentes da 
amostra a ser testada contendo Ag não 
marcado em quantidade desconhecida
• Ac interage c/ ambos os tipos de Ag
• Quanto mais Ag não marcado estiver 
presente, mais Ag marcado vai ser 
substituído nos imunocomplexos
RIA
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Imunoensaios em fase sólida
• ELISA (enzyme-linked 
immonosorbent assay) 
• = Ensaio imunoenzimático 
(EIA)
• Western blot
• Antígeno adsorvido em 
superfície sólida
• Reação com soro de paciente
• Imunocomplexo formado 
detectado por anti-anticorpo
marcado com enzima 
(“conjugado”)
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Determinantes antigênicas nas Ig
• Anticorpos são glicoproteínas
• São potentes imunógenos (em espécies diferentes)
• Anti-anticorpos (anti-Ig) ferramentas valiosas no estudo do 
desenvolvimento da célula B e da resposta humoral
• 3 tipos diferentes de determinantes:
– Determinantes isotípicas
– Determinantes alotípicas
– Determinantes idiotípicas
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Determinantes antigênicas nas Ig: Isotipo
• Determinantes das regiões constantes de ambas as cadeias 
• Definem as classes de Ig
• Idênticos em indivíduos da mesma espécie
Geração de anti-anticorpos
• Anti-anticorpos reconhecem determinantes isotípicas
– Ig de humano purificado injetado em camundongo
– Camundongo produz anti-Ig Humano
– Anti-Ig pode ser „conjugado‟ com enzima 
• Fosfatase alcalina (AP)
• Peroxidase (HRP)
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ELISA (1)
• Conjugado: 
– anti-IgGhum-HRP; 
– anti-IgAhum-HRP; 
– anti-IgMhum-HRP; 
– anti-Ig totalhum-HRP
• No ELISA, a enzima transforma um substrato incolor solúvel em um 
produto colorido solúvel
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ELISA (2)
ELISPOT
• ELISA tipo sandwich
• Detecção de células T 
Mtb-específicas no 
sangue periférico
• Indício de infecção 
ativa
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Western Blot (2)
Anode (+)
Catode (-)
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Western Blot (3) exemplo: doença de Chagas
No WB, a enzima transforma um substrato incolor solúvel em um produto 
colorido insolúvel
HIV
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Percurso da infecção por HIV (1)
HIV
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Percurso da infecção por HIV (2)
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Reatividade Cruzada
Definição e Causa:
• Dois Ag‟s diferentes compartilham um epítopo idêntico
• Ac específico para um epítopo liga-se a um epítopo não 
relacionado mas com propriedade químicas semelhantes
Performance de ELISA
• Avaliação do protocolo com um painel de 
soros
• 100 amostras positivas
– obtidas de pacientes confirmados com 
sintomatologia e isolamento viral
• 100 amostras negativas
– obtidas de indivíduos sadios, sem sintomas 
(ex. doadores de sangue)
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SENSIBILIDADE
= capacidade do ensaio de identificar como positivos todos os 
espécimes clínicos provenientes de indivíduos doentes
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
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SENSIBILIDADE S
= capacidade do ensaio de identificar como positivos todos os 
espécimes clínicos provenientes de indivíduos doentes
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
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• Das 100 amostras positivas, o 
teste é positivo para 99. 
• 1 amostra é falso-negativa
• S = 99/100 = 99%
ESPECIFICIDADE
= capacidade do ensaio de identificar como negativos todos 
os espécimes clínicos provenientes de indivíduos sadios
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
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ESPECIFICIDADE E
= capacidade do ensaio de identificar como negativos todos 
os espécimes clínicos provenientes de indivíduos sadios
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
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• Das 100 amostras negativas, 
o teste é negativo para 98. 
• 2 amostras são falso-positivas
• E = 98/100 = 98%
O ensaio apresenta 99% de sensibilidade e 98% de especificidade
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
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• A “população” apresenta uma 
prevalência da doença de 50% 
(100/200). 
• Se o resultado do teste é positivo, 
qual a probabilidade de que o 
indivíduo testado realmente tem a 
doença?
• Valor preditivo positivo (VPP)
• VPP = VP / (VP + FP)
• VPP = 99 / (99 + 2) = 98,02%
Populações com diferentes prevalências
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 198 297
Teste 
não 
reativo
1 9.702 9.703
Total 100 9.900 10.000
Doença 
presente
Doençaausente
Total
Teste 
reativo
990 180 1.170
Teste 
não 
reativo
10 8.820 8.830
Total 1.000 9.000 10.000
• Prevalência: 100/10.0000 = 1%
• N = 10.000
• S = 99/100 = 99%
• E = 9.702/2.200 = 98%
• VPP = 99/297 = 33,3%
• VPN = 9.702/9.703 = 99,9%
• Prevalência: 100/10.0000 = 10%
• N = 10.000
• S = 990/1.000 = 99%
• E = 8.820/9.000 = 98%
• VPP = 990/1.170 = 84,6%
• VPN = 8.820/8.830 = 99,9%
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Linha de corte (cut-off)
• Distribuição hipotética dos resultados obtidos em grupos de indivíduos sadios e doentes.
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Linha de corte (cut-off)
• Distribuição hipotética dos resultados obtidos em grupos de indivíduos sadios e doentes.
• Cut-off A: S máxima, E baixa
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Linha de corte (cut-off)
• Distribuição hipotética dos resultados obtidos em grupos de indivíduos sadios e doentes.
• Cut-off A: S máxima, E baixa
• Cut-off B: S baixa, E máxima
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Linha de corte (cut-off)
• Distribuição hipotética dos resultados obtidos em grupos de indivíduos sadios e doentes.
• Cut-off A: S máxima, E baixa
• Cut-off B: S baixa, E máxima
• Cut-off C: S máxima com E máxima; FP e FN são indicados
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ELISA versus Western Blot
• ELISA é mais sensível (Ac‟s no soro reagem com mistura 
de Ag‟s no mesmo poço) 
• WB é mais específico (separa mistura de Ag‟s em bandas 
discretas que reagem separadamente com Ac‟s no soro) 
• ELISA é bom teste de triagem: 
– Valor de cut-off ajustado para que não haja resultados falso-
negativos
– Pode haver resultados falso-positivos
• WB é teste confirmatório ideal:
– Discrimina entre resultados verdadeiramente positivos e falso-
positivos
Algoritmo para interpretação da pesquisa de Ac contra HIV (1)
Algoritmo para interpretação da pesquisa de Ac contra HIV (2)
E >99,5%
S = 100%
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Imunofluorescência (1)
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Imunofluorescência (2)
Vermelho: filamentos de actina 
Verde: microtúbulos
Azul: Núcleo (DAPI)
Ac contra antígeno de membrana
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Imunocitoquímica c/ ouro coloidal: Microscopia eletrônica
Linfócito B marcado com anti-MHC II (partículas de 30 nm) e anti-
MHC I (partículas de 15 nm)
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