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RESUMO - reação em cadeia polimerase PCR

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Universidade Federal da Bahia - UFBA
REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE - PCR
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA até um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por métodos simples e clássicos de separação e identificação de substâncias. A multiplicação destes trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio entre: a) Denaturação das cadeias do DNA genômico; b) anelamento (annealinng) dos primers, usados para delimitar a seqüência a ser amplificada; c) temperatura ótima específica da enzima: 72ºC; d) reinício do ciclo. Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos.
As etapas básicas são:
1. Desnaturação (96º C): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.
2. Anelamento (55-65ºC): Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.
3. Extensão (72 ºC): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.
Reagentes Necessários para a Reação 
A reação SEMPRE parte de um DNA molde, extraído convenientemente da amostra, ou de uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA complementar). O ideal é que o ácido nucléico esteja livre de impurezas (proteínas, lipídeos, outro ácido nucléico, reagentes de extração, etc.) e numa concentração mínima de 5µg/mL, apesar de quantidades bem menores poderem ser utilizadas (em medicina forense, chegou-se a utilizar quantidades de até 10-12 mol de DNA). A DNA polimerase: A mais utilizada ainda é a Taq, numa concentração que varia de 1 a 4U por microlitro de solução. Normalmente, a maioria das DNA polimerases disponíveis no mercado são fornecidas conjuntamente com uma solução-tampão específica, cuja composição varia de acordo com o fabricante. Basicamente, estas soluções contêm íons diversos (Na+ , Cl- , K+ , entre outros) que otimizam as condições de reação. Alguns tampões contêm ainda detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formação de dímeros das cadeias enzimáticas, proteínas estabilizantes (BSA = Bovine Serum Albumin = Albumina Sérica Bovina) e algumas substâncias que agem na denaturação da cadeia molde de DNA (DTT = Dithiothreitol, β-mercaptanoethanol), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases. 
Um reagente de importância crítica é o MgCl2 , doador muito estável de íons Mg2+, que são cofatores indispensáveis para atividade da enzima. Algumas enzimas utilizam outros íons metálicos como cofatores. Um desses casos, e talvez o mais interessante, é a enzima Tth (Thermus thermophillus) Polimerase. Esta enzima possui atividade DNA polimerásica em presença de íons Mg2=; porém, na presença de Mn2+ esta mesma enzima apresenta atividade de uma transcriptase reversa, ou seja, sintetiza DNA a partir de uma cadeia de RNA. Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5´ da desoxirribose. São adicionados pela polimerase complementarmente à fita-mãe. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTP´s em concentrações iguais à reação. Os dNTP´s são ligados à fita-mãe pela polimerase numa área delimitada pelos primers, que são pequenas seqüências de DNA (12 a 35 bases) complementares às bordas.
Interação proteína-DNA 
A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada para fazer muitas cópias de uma região específica do DNA, e para isso é imprescindível que haja uma interação proteína-DNA. Assim como ocorre naturalmente nos seres vivos, para que o DNA seja replicado é necessário que uma proteína DNA polimerase esteja presente, como o PCR é uma técnica usada em laboratórios a proteína de DNA polimerase escolhida para realizar o processo in vitro foi a Taq polimerase, obtida da bactéria Thermus aquaticus. Essa escolha foi feita porque ao realizar o PCR a alta temperatura é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas, e a T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa à 70°, (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. A interação se dá a partir de dois primers que são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobam a região de interesse, em seguida são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares e então os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, e a região que está entre eles será copiada.
COMPACTAÇÃO DE DNA
A compactação do DNA ocorre pela formação do nucleossomo através da ligação de disco proteico, constituído por quatro pares de proteínas chamadas histonas à molécula de DNA. A combinação nas duas voltas pela dupla-hélice de DNA das histonas compõem o nucleossomo. Vários nucleossomos se unem, formando um agregado. Essa fita é mais condensada do que a fita de origem. Utilizando proteínas, essa fita 
 
Esse dobramento múltiplo faz com que 1,82 metros de DNA caibam no núcleo de cada célula do nosso corpo. O resultado final é um DNA completamente condensado, com uma estrutura familiar possível de ser visualizada em um microscópio: os cromossomos.
Pelos graus de compactação do DNA, é possível que em um pequeno cromossomo metafásico, abrigue uma longa cadeia de DNA.
Os diferentes níveis de condensação de DNA são:. (1) Cadeia simples de DNA . (2) Filamento de cromatina (DNA com histonas). (3) Cromatina condensada em interfase com centrómeros. (4) Cromatina condensada em profase. (Existem agora duas cópias da molécula de DNA) (5) Cromossoma em metafase.
Para utilizar a técnica de PCR não é necessário usar algum nível de DNA compactado como, por exemplo, um cromossomo ou alguma fase da cromatina. Apenas sequências de partes específicas da fita de DNA serão utilizadas para serem amplificadas milhões ou bilhões de vezes, produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas por outras técnicas.
Referências:
https://pt.khanacademy.org/science/biology/energy-and-enzymes/enzyme-regulation/a/enzyme-regulation
fcav.unesp.br/Home/departamentos/tecnologia/luciamariacararetoalves/aula-4---enzimas---mecanismo-de-acao.pdf
https://www.ufrgs.br/lacvet/site/wp-content/uploads/2020/11/minerais_cofatores.pdf
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr
https://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf

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