Coloração - LAB. DE BIOLOGIA CELULAR - BIO 112

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PRÁTICA 02 - COLORAÇÃO 
 
INTRODUÇÃO 
 
 As diferentes estruturas celulares interagem praticamente da mesma forma com 
a luz, sendo que a velocidade com que a luz atravessa os diferentes compartimentos 
celulares é muito próxima. Isto é consequência da constituição química e da densidade 
dos diferentes componentes celulares, ou seja, dos seus índices de refração. As 
pequenas diferenças no índice de refração não são suficientes para dar contraste 
às diversas estruturas celulares. 
 O uso de substâncias coloridas com capacidade de ligação diferencial a 
componentes químicos específicos da célula permite a sua identificação e localização. 
Para ser utilizada como corante, uma substância deve possuir cor e capacidade de 
ligação com grupos químicos específicos das células ou de seus produtos. 
 A cor apresentada pela molécula de um corante é atribuída à presença de 
grupos cromofóricos (ou cromóforos). Estes grupos representam uma região da 
molécula capaz de absorver os raios luminosos de determinados comprimentos de onda 
e refletir as radiações complementares não absorvidas. Corantes vermelhos, por 
exemplo, apresentam intensa absorção de luz de comprimentos de onda 
correspondentes às outras cores, em especial o verde, deixando passar aqueles 
referentes ao vermelho. 
 Denomina-se coloração vital a aplicação de corantes no indivíduo ainda 
vivo. Estes corantes não devem alterar as estruturas e fisiologia da célula, podendo, 
portanto, serem utilizados na coloração de células vivas. O lítio carmin e a tinta da China 
(nanquim) são exemplos de corantes usados na coloração vital. Por outro lado, quando 
o material é corado logo após a sua remoção do organismo, a coloração é 
denominada supra vital. O vermelho neutro, o verde janus, o azul tripan e o azul de 
metileno são exemplos de corantes usados na coloração supra vital. 
 Em geral, os corantes interagem com os componentes celulares por meio 
de seus radicais ionizáveis, por interação eletrostática. Quando o radical ionizável do 
corante é aniônico (apresentando cargas negativas), este é dito de natureza ácida. 
Inversamente, se o corante é catiônico (apresentando cargas positivas), ele é dito de 
natureza básica. Os componentes dos tecidos que se coram prontamente com 
os corantes básicos são chamados basófilos; os que têm afinidade 
pelos corantes ácidos são chamados acidófilos. 
 Em pH fisiológico (aproximadamente 7,2), os ácidos nucléicos (DNA e RNA) 
apresentam cargas negativas, uma vez que eles possuem grupos fosfato ionizáveis na 
sua estrutura. Por isso, eles têm afinidade por corantes básicos como, por exemplo, o 
azul de metileno e a hematoxilina. Regiões celulares onde há predomínio de 
substâncias ácidas, como o núcleo, são denominadas de basófilas por terem 
afinidade por corantes básicos. O citoplasma também apresenta algumas regiões 
basófilas, dada à presença de RNA (principalmente o RNA ribossômico). 
 As proteínas, que participam da composição de quase todas as estruturas 
celulares, podem apresentar caráter ácido (quando contém predominantemente 
aminoácidos com radicais do tipo -COO-), ou básico (quando contém 
predominantemente aminoácidos com radicais do tipo -NH3+). Esses radicais estarão 
ionizados dependendo do pH do meio intracelular. Grande parte das proteínas 
encontradas no citoplasma tem afinidade por corantes ácidos, o que confere a 
acidofilia característica desta região da célula. A eosina e a fucsina ácida são corantes 
ácidos e, portanto, coram as regiões celulares onde predominam os componentes 
de caráter básico. 
 Uma das técnicas de coloração muito utilizada na citologia e na histologia animal 
é a coloração pela hematoxilina e eosina (HE). 
 
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 A hematoxilina, por ser um corante básico, cora o núcleo (cor azul) devido aos 
ácidos nucléicos nele presentes. A eosina, por ser um corante ácido, cora o citoplasma 
(cor rosa) devido à predominância de proteínas básicas nesta região da célula. 
 Este tipo de coloração, envolvendo afinidade ácido-base, embora facilite o 
estudo da morfologia celular, não dá maiores informações a respeito da constituição 
química das estruturas coradas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1. OBJETIVOS 
 
- Conhecer diferentes tipos de corantes. 
- Observar o material biológico antes e após a coloração. 
- Relacionar a constituição química da célula e a utilização de corantes ácidos e básicos. 
- Justificar a importância dos corantes na microscopia de luz. 
 
2. ATIVIDADE 
 
2.1. Células da mucosa oral 
 
- Coloque uma gota de solução salina 0,9% sobre uma lâmina. 
- Com um palito de fósforo faça uma suave raspagem na mucosa bucal. 
- Transfira o material para a gota de solução salina 0,9%. 
- Cubra o material com lamínula e observe ao microscópio, utilizando as lentes objetivas 
de 10, 20 e 40X. 
- Inicie a focalização do material com o diafragma fechado, porém, regulando a sua 
abertura a cada mudança de objetiva. 
- Após a observação com a lente objetiva de 40X, volte à lente objetiva de 10X e retire 
a lâmina do microscópio. 
- Coloque uma gota do corante azul de metileno em uma das bordas da lamínula. 
- Encoste um pedaço de papel de filtro no lado oposto ao da gota de corante. O papel 
absorverá a solução salina, permitindo que o corante passe por capilaridade para o 
espaço entre a lâmina e a lamínula. 
- Aguarde alguns minutos e observe o material ao microscópio. 
- Inicie a focalização regulando abertura do diafragma a cada mudança de lente objetiva. 
 
- Após a observação, responda: 
 
a. Esquematize uma célula e indique o núcleo, o citoplasma e o limite celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
b. Por que no enunciado anterior foi dito limite celular e não membrana plasmática? 
 
Porque não é possível observar a membrana plasmática no microscópico de luz (por 
causa da sua espessura). 
 
c. Por que foi mais difícil observar as células antes da coloração? 
 
As diferentes estruturas celulares interagem praticamente da mesma forma com a luz, 
sendo que a velocidade com que a luz atravessa os diferentes compartimentos celulares 
é muito próxima. Isto é consequência da constituição química e da densidade dos 
diferentes componentes celulares, ou seja, dos seus índices de refração. As pequenas 
diferenças no índice de refração não são suficientes para dar contraste às diversas 
estruturas celulares. 
 
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Por possuirem compostos onde a constituição química e densidade são muito similares. 
Dessa forma a refração da luz ocorre de forma muito parecida em toda a célula. 
 
d. Qual foi o efeito do corante sobre as células? 
 
Aumento do contraste. 
 
e. O que se entende por substância corante? 
 
Para ser utilizada como corante, uma substância deve possuir cor e capacidade de 
ligação com grupos químicos específicos das células ou de seus produtos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.2. Corte histológico de fígado (hepatócitos) de rato (Mus musculus) corado 
hematoxilina e eosina (HE) 
 
- Observe que, neste material, as células não aparecem individualizadas. Estas estão 
organizadas compondo um tecido, o que dificulta a visualização dos limites celulares. 
Estas células possuem forma cúbica, núcleo esférico e central e são denominadas 
hepatócitos. 
- Após a observação, responda: 
 
 
a. Qual é a cor predominante no citoplasma das células e qual é o corante responsável 
pela coloração? 
 
A cor predominante no citoplasma das células é rosa e o corante responsável pela 
coloração é a eosina. 
 
b. O que caracteriza quimicamente os corantes ácidos e os básicos? 
 
Ácido-grupo ionizável negativo 
Básicos-grupo ionizável positivo 
 
c. Cite alguns exemplos de corantes ácidos e de corantes básicos. 
 
Corantes ácidos: eosina 
Corantes básicos: hematoxilina e azul dimetileno 
 
d. O que são estruturas basófilas e acidófilas? 
 
Regiões celulares onde há predomínio de substâncias ácidas, são chamadas de 
basófilas, por terem afinidade por corantes básicos. 
Regiõescelulares onde há predomínio de substâncias básicas, são denomidas 
acidófilas, por terem afinidade por corantes ácidos. 
 
 
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e. A que se deve a basofilia apresentada pelo núcleo e a acidofilia pelo citoplasma? 
 
Devido a presença dos ácidos nucleicos no núcleo(núcleo) – afinidade com corantes 
básicos. 
Porque predomina proteínas básicas(citoplasma) – afinidade com corantes ácidos. 
 
f. Qual é a limitação apresentada pelas técnicas de coloração que envolvem interações 
eletrostáticas? 
 
Essa técnica não dá maiores informações a respeito da constituição química das 
estruturas coradas.