Aula 2 - Caracterização da urease

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Maria Fernanda Brandão – UC3 
 
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Caracterização da urease 
Mecanismo de ação da urease 
 Seres humanos não tem urease 
 Urease tem alta especificidade para o substrato 
da ureia (NH2CO-NH2) transformando-o em amô-
nia e gás carbônico 
 
 
 Em meio aquoso, ocorre a formação de carbo-
nato de amônio (sal de caráter básico) 
 
Detecção do produto usando indicador ver-
melho de fenol 
 
 Ácido (amarelo), neutro (laranja), básico 
(rosa/vermelho) 
 
Especificidade enzimática da urease 
 Diferencia até mesmo ureia de tioureia 
 
 
Inibição irreversível da urease por mercúrio 
 Sais de mercúrio reagem com os grupos SH da 
urease não permitindo o encaixe ao substrato, ir-
reversível (afinidade muito grande) 
 
 
Teste da uréase que detecta H. pylori 
 O teste da urease é um exame laboratorial utili-
zado para identificar Helicobacter pylori, através 
da detecção da atividade da urease bacteriana. 
 Helicobacter pylori está associada à gastrite, eso-
fagite e duodenite, úlceras, câncer e linfoma do 
estômago. 
 
Biópsia 
 Um pequeno pedaço da parede do estômago é 
retirado e colocado em um frasco contendo ureia 
e o indicador ácido-base (vermelho de fenol). 
 90% de confiabilidade 
 
 
 
Teste respiratório 
 Durante a endoscopia digestiva alta, que avalia a 
saúde do esôfago e do estômago 
 Realizado através de coleta de gases após admi-
nistração oral de ureia com carbono 13 marcado 
 Na presença da bactéria, a urease degrada a 
ureia, liberando o carbono 13 que é absorvido e 
exalado em forma de CO2 
 95% de confiabilidade 
 
 
 
Reação da caracterização da enzima urease 
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 Tubo 1: 2 ml de tampão fosfato 1 mmol/L pH 7,0 
com 1% de ureia, 2 gotas de urease, 1 gota de 
vermelho de fenol. Incubar a 37oC por 5 minutos. 
 Tubo 2: 2 ml de tampão fosfato 1 mmol/L pH 7,0 
sem ureia, 2 gotas de urease, 1 gota de vermelho 
de fenol. Incubar a 37ºC por 5 minutos. 
 
 
 
Prática 
 Reação do biureto: indica proteína (pelo menos 
tripeptídeo devido às ligações peptídicas)  ca-
racteriza a urease 
 Tubo 1: Colocar 2 gotas da solução de urease 
e juntar 2 ml de água destilada. Agitar e adicio-
nar 2 mL do reativo do biureto. Misturar. 
 Tubo 2: Colocar 2 ml de água destilada e 2 ml 
do reativo do biureto. Misturar. Comparar a cor 
nos dois tubos de ensaio. 
 Resultado: o tubo 1 contém urease pois fica de 
cor violeta (positivo) enquanto o tubo 2 fica trans-
parente 
 Teste de atividade da enzima: a ureia é o subs-
trato da urease, ocorrendo a formação de carbo-
nato de amônio, que permitirá a mudança de cor 
do meio de amarelo para rosa 
 Tubo 3: 2 ml de tampão fosfato 1 mmol/L pH 7,0 
com 1% de ureia, 2 gotas de urease, 1 gota de 
vermelho de fenol. Incubar a 37ºC por 5 minutos. 
 Tubo 4: 2 ml de tampão fosfato 1 mmol/L pH 7,0 
sem ureia, 2 gotas de urease, 1 gota de verme-
lho de fenol. Incubar a 37ºC por 5 minutos. 
 Resultado: na presença do substrato (tubo 3), 
há formação de carbonato de amônio (sal básico 
 fica rosa/vermelho) enquanto no tubo 4, que 
não tem o substrato ureia fica laranja (neutro) 
 Desnaturação proteica: a enzima, por ser uma 
proteína, ao ser desnaturada perde a sua ativi-
dade biológica. 
 Tubo 5: 2 ml de água destilada, 2 gotas de 
urease. Ferver 2 minutos 
 Tubo 6: 2 ml de tampão fosfato 1 mmol/L pH 7,0 
com 1% de ureia, 1 ml da solução de urease 
fervida e 1 gota de vermelho de fenol. Incubar a 
37ºC (temperatura ótima) por 5 minutos 
 Resultado: a solução não fica rosa pois a en-
zima foi desnaturada, ou seja, não hidrolisa a 
urease formando carbonato de amônio, portanto 
não fica rosa, e sim amarelada/laranja 
 Efeito de sais de mercúrio: os sais de mercúrio 
reagem com os grupos SH da urease não per-
mitindo o encaixe ao substrato (inibição irrever-
sível) 
 Tubo 7: 2 ml de água destilada, 2 gotas da solu-
ção de urease, agitar e juntar cuidadosamente 1 
gota de cloreto de mercúrio a 0.01%. Agitar e 
adicionar 2 ml de tampão fosfato 1 mmol/L pH 
7,0 com 1% de ureia e 1 gota da solução de ver-
melho de fenol. Misturar. Incubar a 37oC por 5 
minutos 
 Resultado: o mercúrio deslocou o hidrogênio 
inibindo a enzima e formando ácido clorídrico. 
Por isso, o tubo fica amarelo (ácido) 
 Especificidade da enzima: a tioureia é um com-
posto estruturalmente análogo à ureia, pode ser 
utilizado pela urease, mas não ocorre a formação 
do carbonato de amônio 
 Tubo 8: 2 ml de tampão fosfato 1 mmol/L pH 7,0 
com 1% de tioureia, 2 gotas de urease, 1 gota de 
vermelho de fenol. Incubar a 37oC por 5 minu-
tos. 
 Tubo 9: 2 ml de tampão fosfato 1 mmol/L pH 7,0 
com 1% de ureia, 2 gotas de urease, 1 gota de 
vermelho de fenol. Incubar a 37oC por 5 minutos 
 Resultado: o tubo 8, que contém tioureia não 
fica rosa, e sim laranja, pois não houve reação, 
enquanto o tubo 9, que contém o substrato 
urease, fica rosa 
No tubo 1, há substrato, 
portanto a urease con-
verte a ureia em sal bá-
sico, o carbonato de 
amônio, ficando rosa.