Aula_3_Microscopia_de_luz

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13/11/2012
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Microscopia de Luz
Fundamentos
Ondas luminosas
721 a.c. - Lentes com propriedade de ampliação
1280 - Lentes utilizadas em óculos na Itália
1595 –Zacharias Jansen
1619-1624 – Galileu Galilei
Histórico
1660 – Robert Hooke
1660 – Van Leeuwenhoek
Histórico
Século XIX O Microscópio Moderno
Histórico Trajetória da luz
Luz
Lente 
condensadora
Lente 
Objetiva
Lente 
Ocular
Observador
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Esquema geral de 
funcionamento
Esquema geral de 
funcionamento
O que é limite de resolução?
Menor distância entre 2 pontos, onde 2 
objetos podem ser vistos como distintos
Limites de resolução
� Resolução 
�Olho humano 0,2 mm
� Microscópio de luz 0,2 um
� Microscópio eletrônico 0,2 nm
� Racional da microscopia
Limites de resolução
É dado pela equação:
L.R. = λ.K
a.n.
λ= comprimento da onda luminosa
K= constante (0,61)
a.n.= abertura numérica da lente 
Limites de resolução
a.n.= abertura numérica da lente
a.n.=n.senα
n= índice de refração entre objeto e objetiva
(n=1 ar, n=1,33 água, n=1,5 óleo de imersão)
α = é o semi-ângulo de abertura formado 
pelo eixo óptico e os raios externos do feixe 
de luz que penetram na objetiva. 
Limites de resolução
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Limites de resolução
L.R. = λ.K
a.n.
Luz branca= 0,55 µm
L.R.= 0,55*0,61/1,4 = 0,239 µm
Microscópio de luz
Sistema óptico
1. Condensador 
2. Lentes Objetivas
3. Lentes oculares
Microscópio de luz
Sistema Mecânico
1. Módulo de ajuste das 
oculares e canhão
2. Revólver
3. Mesa ou platina
4. Base
5. Corpo / coluna
6. Comandos do Charriot
7. Parafusos Macrométrico 
(junto a base) e 
micrométrico externo ao 
macrométrico.
Modificações dos sistemas ópticos
Objetivas O microscópio de luz atual
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O microscópio Invertido O esteromicroscópio
O microscópio de luz atual Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
�Coleta do material
�Fixação
�Desidratação
�Clarificação ou Diafanização
�Inclusão
�Microtomia 
�Coloração
Coleta do material
�Tempo de retirada do tecido (Autólise)
�Manutenção do tecido em solução 
fisiológica
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Fixação química por imersão
Fragmentos de tecidos
Células isoladas 
Monocamadas de células
Formalina, Formaldeído, Glutaraldeído, Líquido de 
Bouin, Carnovisk
Placa de 24 poços
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Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Fixação química por perfusão
Eficaz por colocar o fixador ao nível pericelular 
e celular
Pressão de perfusão e artefatos
Perfusão inicial / Perfusão de solução fixadora
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Fixação física congelamento rápido
O material será colocado em TissueTek em moldes
Congelado em nitrogênio líquido 
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Desidratação / Diafanização – Tecidos
� Meios de inclusão hidrofílicos (gelatina, carboWax)
� Meios de inclusão hidrofóbico
� Imersão no agente de desidratação numa série 
crescente (50% - 70% - 80% - 90% - 100%)
� Álcoois etílico, butílico, metílico e isopropílico, 
a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido propileno. 
� Imersão no agente diafanizador numa série crescente
(50% - 70% - 80% - 90% - 100%)
� Xilol, clorofórmio, óleo de cedro, benzol e 
salicilato de metila
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Inclusão
� Remoção do xilol e impregnação com o agente 
de inclusão (parafina) 
�Parafina fundida a 56ºC a 60ºC (2x)
�O bloco de parafina contendo a amostra 
resfriará a temp. amb.
�Celoidina, goma arábica, parafina plástica, 
polietileno glicol e parafina esterificada
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Microtomia
� Micrótomo
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Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Microtomia
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Esquema do processamento
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Microtomia
� Criostato
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Macrófago infectado com Leishmania lainsoni
Fibroblastos de derme
Macrofagos infectados com
Leishmania amazonensis
corados pelo Giemsa.
Formas epimastigotas 
e tripomastigotas de 
Trypanosoma cruzi.
Células de Sertoli-Leydig,
corada com hematoxilina e
eosina.
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Coloração
�Cortes de tecidos incolores – (remoção parafina 
e hidratação)
�Coloração contrasta as estruturas teciduais
�Ação da maioria dos corantes se baseia na 
interação entre os radicais ácidos ou básicos 
dos corantes com os dos tecidos
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
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Coloração
�Corantes básicos (CB)
Hematoxilina, azul de toluidina e azul de metileno
Componentes do tecido que coram com CB são 
basófilos
�Corantes ácidos (CA)
Eosina, fucsina ácida, azul de anilina e orange G
Componentes do tecido que coram com CA são 
acidófilos
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Cartilagem, hematoxilina e eosina.
Córnea, azul de toluidina Retina azul de toluidina
Preparo de amostra biológicas para
microscopia de luz
Coloração
�Associação de corantes
Epitélio intestinall, hematoxilina e eosina mais alcian blue.
Microscopia de luz
Tipos de
Microscopia 
de Luz
1. Campo claro
2. Fluorescência
3. Confocal
4. Campo escuro
5. Contraste de Fase
Microscopia de luz
� Campo Claro
◦ É a mais usual;
◦ A imagem é obtida pela transmissão de luz através 
◦ de uma cultura de células.
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Microscopia de luz
Campo Escuro
� Pode ser utilizada no estudo de células vivas;
� Permite a identificação de uma amostra 
iluminada com o fundo escuro,
� Pouco utilizada
Microscopia de luz
� O que a técnica de campo escuro faz?
1) Contraste negativo
- Bloqueia os raios não desviados centrais
- a amostra fica clara sobre um fundo escuro;
- cria uma aparência tridimensional da amostra;
- a resolução é a mesma do campo claro.
Microscopia de luz
condensador
objetiva 
Luz não coletada pela objetiva
Luz difratada pela amostra
amostra
Anel de campo escuro
Só entra luz na objetiva se houver material com 
índice de refração maior que o da água.
Campo Escuro
Microscopia de luz
Sem amostra Com amostra
Campo Escuro
Microscopia de luz
Campo Escuro
Raiz de dente humano preparo 
por desgaste.
Sal (cloreto de sódio).
Microscopia de luz
Contraste de Fase
� Avanço no estudo de células vivas.
� Não necessita coloração.
� Explora propriedades físicas de índices de refração da 
luz.
� Contraste é devido à diferença de fase dos raios 
luminosos que atravessam a amostra.
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Microscopia de luz
Contraste de Fase
Técnica desenvolvida por Frits Zernike 
na década de 30, recebeu o prêmio 
Nobel em física em 1953.
Microscopia de luz
Contraste de Fase - configuração
objetiva
amostra
condensador
Raios desviados
90º fora de fase
Não desviados
não desviados + 90º Raios desviados180º fora de fase
Anel de fase
Anel de fase
Microscopia de luz
Contraste de Fase 
Osso de dinossauro fossilizado
com quartzo no canal de Havers
preparo por desgaste.
Contraste de fase osso compacto 
humano preparo por desgaste.
Microscopia de luz
Contraste de Fase de interferência diferencial de Nomarski
Microscopia de luz
Contraste de Fase de interferência diferencial de Nomarski
DIC
DICCF DICCF
Mucosa
bucal.
Mucosa bucal.
Heliozoário
Microscopia de luz
Figura: Quatro tipos de microscopia óptica. Imagens da mesma
célula (fibroblasto) em cultura. A) Microscopia de campo claro.
B) Microscopia de contraste de fase. C) Microscopia de contraste
de fase de interferência diferencial de Nomarski. D) Microscopia de
campo escuro.
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FIM!