Revisão para a 2° Prova de Biologiak

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Revisão para a 2° Prova de Biologia Molecular
Monitora: Maíra Aspahan
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Roteiro de estudo
Transcrição e processamento
Tradução e síntese proteica
Regulação da expressão gênica
Epigenética
Mutação e reparo
Engenharia genética
Técnicas de análise de DNA
Bases moleculares do câncer
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Transcrição Gênica
Síntese de RNA a partir de um segmento molde de DNA (a fita que não está sendo transcrita neste momento é chamada de codante).
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Transcrição Gênica
Engloba as fases de iniciação, alongamento e terminação.
A síntese de RNA começa em regiões do DNA chamadas de promotoras, que indicam para a RNA polimerase onde a transcrição deve ser iniciada. 
Participação de fatores de transcrição (em eucariotos) e fator Sigma (em procariotos) que recrutam a RNA polimerase e auxiliam no controle da expressão gênica. 
Em Eucariotos a principal região promotora é a TATA box.
Em Procariotos a principal região promotara é a Pribnow box.
Enhancers: sequências específicas distantes da região promotora do gene, com habilidade de elevar a taxa de transcrição gênica.
Silencers: sequências específicas que inibem a transcrição gênica.
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Transcrição Gênica
Em Procariotos existe apenas uma RNA polimerase.
Em Eucariotos existem 3 tipos de RNA polimerase:
RNA polimerase I: RNAr
RNA polimerase II: RNAm e RNAsno (micro nucleolar-splicing do RNA)
RNA polimerase III: RNAt e RNAsn (micro nuclear- processamento químico do RNAr)
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Transcrição gênica em procariotos
Promotor (Pribnow box) + Fator Sigma.
RNA polimerase (só tem uma).
Síntese do RNAm pronto.
Tradução acoplada (não existe separação celular em núcleo e citoplasma).
O RNAm não sofre processamento.
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Transcrição Gênica em Procariotos
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Transcrição Gênica em Eucariotos
Promotor (TATA box) + Fatores de transcrição.
RNA polimerase I, II e III.
Síntese de pré-RNA que será processado.
Exportação do RNAm pronto (após o processamento).
A tradução só ocorre no citoplasma, portanto não é acoplada à transcrição.
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Término da transcrição
Sequência de parada indica a finalização da síntese da molécula de RNA.
Ocorre formação de uma estrutura em grampo, que desencadeia:
Parada da RNA polimerase
RNA se solta do DNA
RNA se dissocia da RNA polimerase
Reestabelecimento da dupla fita de DNA
Liberação da RNA polimerase da fita molde de DNA
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Término da transcrição
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Processamento do pré-RNAm de Eucariotos (ainda no núcleo)
Adição do CAP 5’ (proteínas se ligam ao CAP 5’ e o ribossomo, por sua vez, se liga a essas proteínas até atingir o códon de iniciação. A CAP 5’ aumenta a estabilidade do RNAm e influencia no splicing).
Adição da cauda poli-A na porção 3’ (a poliadenilação protege o RNA da ação de exonucleases, mantendo o RNA intacto por mais tempo)
Splicing (remoção dos íntrons no spliceosomo) e splicing alternativo (processamento de um pré-RNAm de forma diferente, com alteração na retirada de introns, o que por fim contribui pra formação de uma proteína diferente)
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Eeeeeeeee!
Finalmente o RNAm eucarioto está pronto e pode ser exportado para o citoplasma para ser traduzido!
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Visão geral da transcrição
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Diferenças dos RNAm de procarionte e eucarionte
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Tradução do RNAm em proteínas
Biossíntese de polipeptídeos e proteínas a partir de um RNAm decodificado nos ribossomos.
Apenas os exons são codificados porque o RNAm maduro já sofreu splicing, logo os introns já foram removidos.
Códon de iniciação: AUG (codifica metionina em eucariotos e formilmetionina em procariotos)
Catalisada por fatores de iniciação (IFs)
RNAm (códons)
RNAt (anti-códons)
Códons de terminação nuclear: UAG, UGA e UAA.
Códon de terminação mitocondrial: UAG, UGA, UAA e AGG
Sentido da síntese: 5’ -> 3’
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Tradução do RNAm em proteínas
Início:
Fatores de iniciação + subunidade menor do ribossomo ligado à ponta 5´do RNAm (reconhece o CAP) + AUG permite a ligação da subunidade maior do ribossomo
Ribossomo: 4 sítios de ligação
Sítio de ligação pro RNAm
Sìtio A- aminoacil (para RNAt)
Sítio P- peptidil (para RNAt)
Sítio E –exit (para RNAt)
RNAt iniciador com metionina ou formilmetionina no sítio P
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Tradução
Alongamento: (A- P- E)
RNAt iniciador com metionina ou formilmetionina no sítio P (Primeiro)
Ligação do próximo RNAt ao sítio A, emparelhado ao segundo códon do RNAm. 
Forma-se uma ligação peptídica entre a metionina ou formilmetionina do sítio P com o segundo a.a. colocado no sítio A.
A metionina ou formilmetionina é transferida do sítio P pro sítio A, ligado ao a.a. que já estava no sítio A (translocação). O RNAt iniciador vai sozinho pro sítio E.
Met + a.a. vão do sítio A para o sítio P (ou seja, sítio E com RNAt livre, sítio P com met + a.a. e sítio A livre)
Chegada de um novo RNAt com outro a.a. no sítio A.
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Tradução
Término
Códons de terminação nuclear: UAG, UGA e UAA.
Códon de terminação mitocondrial: UAG, UGA, UAA e AGG
Os códons de terminação não especificam nenhum a.a.
Fatores de liberação (adição de uma molécula de água).
Subunidades maior e menor se desprendem uma da outra.
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Regulação da expressão gênica
Genes constitutivos são sempre expressados.
Genes induzíveis favorecem a expressão gênica quando for conveniente, sendo ligados e desligados de acordo com a necessidade celular.
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Regulação da expressão gênica
Operon é a unidade de regulação da expressão gênica em procariotos.
Operon = sítio promotor + operador + genes estruturais.
O operon anabólico: operon trip (regula a síntese de triptofano)
Operon catabólico: operon lac (regula a quebra de lactose a partir da síntese de lactase)
Gene regulador: codifica um peptídeo repressor que vai se ligar ao operador para bloquear o processo de transcrição. 
Atenção: o gene regulador não faz parte do operon. 
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Regulação da expressão gênica
Promotor: sequência específica de DNA que sinaliza o início da transcrição para a RNA polimerase.
O promotor contém o operador, que é uma sequência de nucleotídeos reconhecida pela proteína repressora, que se liga ao operador.
Operador: 
ocupado pela proteína repressora: impede que a RNA polimerase chegue até o promotor, impedindo assim, a transcrição gênica.
Não ocupado pela proteína repressora: permite a transcrição porque permite que a RNA polimerase chegue ao promotor.
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Regulação da expressão gênica
O operon anabólico: operon trip (regula a síntese de triptofano)
A proteína repressora é ativada quando duas moléculas de triptofano se ligam a ela (o que indica que há muito triptofano disponível, logo não é necessário que mais triptofano seja sintetizado).
Operador + proteína repressora = bloqueio da transcrição.
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Regulação da expressão gênica
Operon catabólico: operon lac (regula a quebra de lactose a partir da síntese de lactase).
A transcrição de enzimas que degradam lactose só estará ativada em baixa quantidade de glicose e alta de lactose.
A proteína repressora é inativada quando lactose se liga a ela (isso indica que há muita lactose, logo é necessário sintetizar enzimas para degradá-la).
Lactose= glicose + galactose
Transcrição: 
alta concentração de glicose e baixa de lactose;
Lactose inativa a proteína repressora ao se ligar a ela
RNA polimerase é ativada quando Cap está ligado a AMPc;
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Epigenética
Atividade reguladora de genes que não envolve mudanças na sequência de DNA, e que pode ser repassada para a prole.
Como alguma coisa que nem envolve mudança no DNA pode afetar a expressão gênica?
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Epigenética
Metilação do DNA (inativa genes): adição de um grupo metil à citosina por uma metiltransferase. Ilhas CpG, ricas em citosina, fosfato e guanina, são sinalizadoras para a metilação e ficam próximas às regiões promotoras. Metilações são desfeitas nas células embrionárias e neoplásicas.
Modificação das histonas
Metilação (inativa ou ativa genes. Metilação de arginina ativa enquanto de lisina inativa.)
Acetilação (complexos com fatores de transcrição proteicos que ativam genes -> eucromatina)
Desacetilação (remove o grupo acetil causando inativação
gênica)
Fosforilação (inativação de genes na mitose)
Silenciamento do RNA
RNA diretamente silenciado devido à metilação do DNA
Silenciamento gênico pós-transcripcional
RNA de interferência, micro RNA e outros
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Epigenética
Imprinting
Padrão de marcação dos genes passados pelo pai e pela mãe
para a prole.
Há genes que apenas estarão ativos se forem herdados da mãe,
enquanto outros só estarão ativos se herdados do pai.
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Mutação e reparo
Tipos de mutação:
Samesense: o códon mutado codifica o mesmo a.a. Ex: AAA trocado por AAG continua sintetizando lisina
Missense: o códon mutado codifica um a.a. diferente daquele codificado antes da mutação. Ex: GAG (glutamato) por GAC (aspartame).
Nonsense: o códon é mutado para um códon de terminação, logo não é sintetizado nenhum a.a. e a proteína fica com um a.a. a menos. Ex: AGC (serina) por AGG (códon de terminação).
Frameshift: houve a inserção ou a deleção de pares de nucleótidos (em número não múltiplo de 3), fazendo com que no mRNA respectivo o ribossoma passe a identificar códons desfasadamente a partir desse ponto (a 3' da mutação, portanto), produzindo uma cadeia polipeptídica que não só tem uma série de mutações missense como tem um número de aminoácidos diferente (geralmente menor) do que o normal. Por exemplo, se a terceira adenina na sequência de códons AAG-AUU-UCC-UCA-AUG-GAA-U fosse removida, o péptido correspondente seria
 AAG-UUU-CCU-CAA-UGG-AAU.
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Mutação e reparo
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Engenharia genética
Tecnologia do DNA recombinante.
Envolve a união de um fragmento de DNA a uma molécula maior, utilizando-se uma endonuclease de restrição e a DNA ligase. 
A clivagem do DNA com a mesma enzima de restrição cria extremidades complementares adesivas que são unidas pela ação da DNA ligase 
Desta forma, um fragmento de DNA pode ser inserido em uma molécula maior, que passa a ser recombinante. 
Assim, um determinado gene do genoma humano pode ser inserido no genoma de uma bactéria, por exemplo, e lá ser amplificado ou mesmo transcrito várias vezes. 
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Técnicas de análise de DNA
Reação de Polimeralização em Cadeia (PCR): consiste em fazer cópias de DNA, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. 
Existem cinco etapas:
Na amostra são colocados primers, fitas de DNA, enzima Taq polimerase e nucleotídeos livres.
A amostra é aquecida a aproximadamente 95ºC para que ocorra desnaturação proteica e a fita de DNA se separe.
Resfria-se a amostra para a temperatude de 60 a 65ºC para permitir que os primers possam se parear.
A amostra é novamente aquecida até 72ºC para que a Taq polimerase possa atuar pareando os nucleotídeos livres e sintetizando uma nova fita.
Esse processo deve ser repetido em torno de 30 vezes.
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Técnicas de análise de DNA
Southtern blotting
A mistura de fragmentos de DNA de dupla fita gerados pelo seu tratamento com nucleases é separado de acordo com o peso molecular na eletroforese. 
Uma folha de papel de nitrocelulose ou papel de nylon (blotting) é colocado sobre o gel, e os fragmentos de DNA separados são transferidos para a folha pelo blotting. O gel é mantido em um suporte de esponja em um banho de solução alcalina, e o tampão é sugado através do gel e do papel de nitrocelulose pelo papel toalha empilhado em cima da nitrocelulose. Conforme o tampão é absorvido, os fragmentos de fita simples são transferidos do gel para a superfície da folha de nitrocelulose, onde se aderem firmemente. Esta transferência e necessária para manter o DNA firme ao local no qual a hibridização acontece. 
A folha de nitrocelulose é cuidadosamente retirada do gel. 
A folha contendo a banda correspondente ao DNA de fita simples está dentro de um saco plástico selado contendo tampão e a sonda, de DNA marcado radioativamente, específica para a sequência de DNA desejada. A folha é exposta por um longo período de tempo à sonda sobre condições favoráveis de hibridização. 
A folha removida do saco e lavada rigorosamente, somente o DNA hibridizado com a sonda ficara retido no papel. Depois é auto-radiografado, o DNA que está hibridizado com a sonda aparecerá como bandas na auto-radiografia. Uma adaptação desta técnica para detectar sequências específicas em RNA é chamado de Northern blotting. Neste caso moléculas de mRNA são analisadas em gel de eletroforese e a sonda é usualmente uma fita simples de DNA. 
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Northern Blotting
As moléculas de RNA intactas puras são fracionadas, de acordo com seus tamanhos, dentro das bandas de eletroforese em gel. 
Para agruparem as moléculas de RNA com o DNA de prova, uma réplica do padrão das bandas de RNA penetra no filtro de nitrocelulose, de forma semelhante ao processo descrito para o DNA. 
Faz-se o mesmo processo de auto-radiografia e, finalmente, é possível dizer se este é o gene que realmente estamos estudando, através da comparação dos tamanhos conhecidos. 
Desta forma, é possível comprovar a presença ou a ausência de determinado gene para a célula, compará-lo com células sem patologia e ver sua significação. Em um Northern Blot usando DNA de prova curto, é possível analisar e mapear o exato lugar onde o RNA normal está faltando. 
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Bases moleculares do câncer
Câncer: transformação celular envolvendo comprometimento das propriedades de crescimento e diferenciação celular. 
Mutação somática: aparece em algum momento da vida. Está restrita a um grupo de células.
Mutação germinativa ou constitutiva: presente no embrião. É hereditária.
As mutações que resultam em câncer geralmente ocorrem em:
Oncogenes
Genes supressores de tumor
Genes de reparo
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Bases moleculares do câncer
O distúrbio genético (câncer) pode ser provocado por mutação ou deleção em alguns genes que codificam proteínas capazes de estimular o crescimento e divisão celular; estes genes mutados são chamados de oncogenes. Os genes normais (não mutados) são chamados de protooncogenes. 
O gene BCL-2 é um protooncogene que suprime a apoptose celular.
Maneiras de ativar oncogenes: 
Mutação somática, de ganho de função e dominante.
Inserção viral (ex: HPV)
Translocação (ex: cromossomo Philadelphia -> leucemia mielóide crônica).
Amplificação: expansão da cópia de um gene no genoma celular.
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Bases moleculares do câncer
P53: gene que codifica proteína de mesmo nome.
Supressor tumoral.
Monitora o ciclo celular e repara o DNA se necessário.
Está localizado no cromossomo 17 (17p13.1 ).
Mutações nesse gene aumentam as chances de cânceres.
Atua no ponto de checagem G1/S.
Estimula o gene P21, que sintetiza a proteína P21, que está relacionada ao reparo e apoptose celular. A P21 se liga à CDK, impedindo que esta se ligue à ciclina e fosforile compostos intermediários do ciclo celular. O ciclo é então paralisado a fim de reparar o erro encontrado.
P21 é uma CKI (cinase inibidora de CDK) logo freia o ciclo celular).
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Questões
1) Com base na fita molde de DNA de procarioto citada a baixo e na tabela do código genético, responda as seguintes questões:
DNA molde: 5' CTA ATA GGG AAA AAA CAT 3'
	a) Escreva a seqüência de desoxirribonucleotídeos da haste complementar codante,indicando as pontas 5' e 3' 
	b) Escreva a seqüência de nucleotídeo do RNAm moldado. Indique as extremidades 5' e 3'.
	c) Escreva a seqüência primaria do oligopeptídeo recém sintetizado especificado pelo RNAm acima indicando as pontas amino (N) e carboxílica(C)
	d) Se houver uma mutação no quarto desoxirribonucleotídeo na haste molde, mutando de A para T, o que acontecerá com o oligopeptídeo especificado pelo DNA mutado? Diga que tipo de mutação está ocorrendo.
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Os nucleotídeos são contados no sentido 5’-> 3’.
O RNA é sintetizado no sentido 5’ -> 3’ a partir de trilho 3’-> 5’
a) DNA codante - 3’ GAT TAT CCC TTT TTT GTA 5’
b) RNAm - 3’ GAU UAU CCC UUU UUU GUA 5’
c) oligopeptídeo - 
Ponta N-Formil met- Phe-Phe-Pro-Tyr-Ponta C 
ou 
Ponta C-Tyr-Pro-Phe-Phe-Formil met-Ponta N 
d) Mutações pontuais:
 Somesense = códon alterado codifica o mesmo aminoácido
 Misense = códon alterado codifica um aa
diferente
 Nonsense = códon alterado sinaliza o término da cadeia
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2) Porque o código genético é dito degenerado e quase universal?
Vários códons codificam um mesmo a.a.
Todos os organismos têm o mesmo DNA, exceto o mitocondrial que tem certas diferenças.
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3) Genes eucariotos são geralmente constituídos de éxons e íntrons. Essas seqüências são tanto transcritas como traduzidas? A remoção dos íntrons (splicing) deve ser extremamente precisa. Por quê?
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Todas são transcritas, porém só éxons são traduzidos. O splicing é necessário para o funcionamento correto das proteínas.
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4) Faça um resumo do processamento do RNAm. 
R: Pós transcrição antes da tradução.
ETAPAS:
Capeamento – ponta CAP na extremidade 5’ do RNAm
Poliadenilização – Poli-A polimerase põe nucleotideos adenina na extremidade 3’ do RNAm
Splicing – Tira íntrons, une éxons->RNAm “verdadeiro”
OBS: Splicing alternativo é responsável pela produção de várias proteínas diferentes a partir de um gene.
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5) ) Defina enhancers e seu papel na expressão gênica.
Enhancers são sítios de DNA onde se ligam proteínas que estimulam a taxa de transcrição. Eles podem se localizar próximos ou não do gene promotor.
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6) O que é um operon? Qual o papel do gene regulador?
R: Operon é uma unidade de regulação que apresenta genes estruturais e um promotor com sítio operador. É responsável pela produção de um conjunto de enzimas que atuam numa dada via metabólica, sendo responsável pela expressão de um fenótipo.
O gene regulador é responsável por ligar e desligar o operon.
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7) que é TATA BOX? Qual a sua função? 
R: É uma seqüência de DNA rica em bases T e A, presente no sítio promotor de eucariotos. É reconhecida pela RNA polimerase e sinaliza o início da transcrição.
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8) Explique os mecanismos pelo qual o repressor do Triptofano ativa ou desativa genes em bactérias.
O peptídeo repressor da via do triptofano liga-se a ele quando este se encontra em excesso no organismo, garantindo que, ao se ligar ao operador, a RNA polimerase não consiga “funcionar” já que o peptídeo repressor impede a passagem desta aos genes estruturais. Quando ocorre queda nos níveis de triptofano, o peptídeo repressor desliga-se dele permitindo a passagem da RNA polimerase, quando este está ligado ao operador, e a produção dele.
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9) Compare o operon Lac com o operon Trip de E.Coli com relação ao papel da lactose e do triptofano na regulação da expressão dos genes estruturais envolvidos.
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R: A lactose atua promovendo um controle positivo: liga-se ao repressor inibindo-o e estimulando, assim, a via do operon lac; enquanto o trip ativa o repressor que se liga ao operon inibindo a via do operon trip, ou seja, promove o controle negativo do operon trip.
Gli 0/ Lact + => AMPc elevado; Repressor inibido; CAP ativa; Operon ativo
 CAP livre baixo; CAP ligado ao AMPc elevado. 
Gli +/ Lact + => AMPc baixo; Repressor inibido; CAP inibida; Operon inibido
 CAP livre elevado; CAP ligado ao AMPc baixo.
Gli 0/ Lact 0 => AMPc elevado; Repressor ativado; CAP ativa; Operon inibido 
 CAP livre baixo; CAP ligado ao AMPc elevado.
Gli +/ Lact 0 => AMPc baixo; Repressor ativado; CAP inibida; Operon inibido
 CAP livre elevado; CAP ligado ao AMPc baixo.
Para aqueles que não querem decorar a tabela:
1- Na ausência de glicose, o AMPc está sempre elevada e a CAP ativa (é a ligada ao AMPc);
2- Repressor inibido somente na presença de lactose;
3 - O Operon só estará ativo quando não tem glicose e existe lactose.
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10) No que consiste Epigenética? O que é Epimutação?
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R:	Epigenética é a área da biologia molecular relacionada ao DNA ligada, não aos seus genes em si, mas ao silenciamento desses através de acetilações, metilações e outros. Esses fenômenos ocorrem normalmente para controlar a expressão gênica e os fenótipos de cada tecido.
Epimutação são mutações em nível de expressão gênica (porque ocorrem quando um promotor é metilado, portanto, não ocorre mutação na seqüência normal do gene, dessa forma o gene fica silenciado e a transcrição não ocorre).
OBS.: Exemplos de epimutações:
	- acetilação das histonas → (eucromatina) promovem a expressão dos genes;
	- metilação das histonas → (heterocromatina) silenciam os genes;
	- fosforilação das histonas → inativação de genes na mitose;
	- mudanças na conformação da cromatina
Citosina ao lado de guanina metilada por DNA metil-transferase; mais presente nas ilhas CPG e regiões intergênicas. Padrão de metilação determinado por fatores ambientais. Histonas podem esconder TATABox e regular positivamente ou negativamente a transcrição, quando metiladas. Quando acetiladas, o DNA fica repelido por carga negativa, permitindo a transcrição. Ubiquitinação indica que a célula está velha e será degradada.
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11) ) O que se entende por "imprinting" genômico?
R: Imprinting genômico é a determinação da expressão de um gene, através de informações epigenéticas pela sua origem, materna ou paterna, adaptando-as ao seu sexo e acrescentando outras informações, próprias, através de metilações ou desmetilações.
Síndrome de Prader-Willi
Gene da mãe silenciado por epigenética SEMPRE e o do pai está mutado e inativado na doença
Síndrome de Angelman
Gene do pai silenciado por epigenética SEMPRE e o da mãe está mutado e inativado na doença 
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12) O que são lesões espontâneas? Qual a importância do sistema de reparo para a integridade do DNA?
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R: Lesões espontâneas são alterações no DNA, que ocorrem sem atuação de agentes externos. Como esses erros são muito comuns, o mecanismo de reparo é muito importante para a manutenção da integridade do DNA. (Sem o reparo haveria irregularidade nas bases). Ex. de lesões espontâneas: depurinação → perda de purina e desaminação → troca de amina por hidroxila. 
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13) O que se entende como PCR e para que serve na medicina? (Dê 3 exemplos).
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R: Polymerase chain reaction (Reação de polimerização em cadeia) é a técnica em que se amplifica um pedaço de DNA. Serve para diagnóstico de doenças como leucemia e linfomas; kits diagnósticos de Carga Viral de HIV; pesquisa de bactérias patogênicas; pesquisa pra deterctar polimorfismo e mutações patológicas; medicina forense, etc. 
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14) Por quais mecanismos podem ser reparadas as lesões no DNA causadas por luz UV? Cite 3 e descreva sucintamente cada um deles. 
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R: Metilação → através do aumento de concentração de um agente metilante (reparo adaptativo), ocorre um estimulo à produção de uma enzima suicida que, ao unirem-se a um grupamento metil, inativa-se e, então, juntos são degradados. Pareamento de bases erradas (Excisão de bases) → a n-glicosilase corta a base errada e a insertase insere a correta. • Reparo adaptativo: Ocorre quando há metilacão do DNA. Uma enzima chamada “enzima suicida” liga-se a esse metil, que antes estava unido ao DNA, e impede que estes genes sejam expressos. Ocorre desmetilação das bases. • Reparo por excisão de bases: Ocorre quando há pareamento errado de bases. A enzima n-glicosilase irá retirar apenas a base pareada errada e a insertase, irá colocar a base correta no lugar. A pentose não é retirada. Para cada base, existe uma n-glicosilase e uma insertase específica. • Reparo por excisão de segmentos de nucleotídeos: Esse mecanismo pode corrigir a lesão causada por praticamente qualquer alteração volumosa na estrutura da dupla hélice do DNA. Enzimas utilizadas: n-glicosil 
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15) Um cientista decidiu clonar o gene do hormônio de crescimento humano. Qual seria a melhor estratégia para fazê-lo?
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R: Técnica de DNA recombinante: a clonagem do gene codificador do hormônio em bactérias geneticamente modificadas.
A partir do RNAm da pró-insulina, extraído de um pâncreas humano, obtém-se um DNAc da pró-insulina. Isso é feito, utilizando-se a enzima transcriptase reversa, formando um híbrido de DNA-RNA. É feito, então, um grampo com a própria extremidade 3’OH da fita de DNA já formada, servindo com primer para a síntese do filamento
complementar de DNA. A alça é removida por digestão. A pró-insulina é precursora das cadeias alfa e beta da insulina. Cada uma dessas partes é inserida em um plasmídeo que infectam duas bactérias distintas. Isso porque uma bactéria apenas não é capaz de sintetizar as duas cadeias. Um clone produzirá a cadeia alfa e o outro a cadeia beta. Essas unidades serão purificadas e unidas in vitro com ponte de enxofre.
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16 ) “Questão extra pra prova” - Como funciona cada tipo de RNA abaixo:
- RNA de interferência
- SRP (Signal Recognition Particle)
- Small Nucleolar RNAs
- Cajal Body Especifics RNAs
- Xist e Tsix
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RNA de interferência: O RNAi inibe a ação de determinados genes, mas estes não permanecem suprimidos por longo tempo. São RNA´s de fita dupla que se ligam a complexos de proteínas e encontram trechos equivalentes de RNAm, que é destruído. Assim, a proteína não é produzida e o gene é silenciado.
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RNA´s nucleolares/snoRNA´s: guiam modificações químicas (metilação ou pseudo uridilacao) nos RNA´s ribossomicos, RNA´s transportadores e outros nucleolares 
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Particula de reconhecimento de sinal: srp: os 15 a 20 1os aa da regiam n-terminal constituem o peptideo sinal que interage com a srp, que é um complexo ribonucleoproteico que promove a ligacao da ptn nascente a um complexo protéico ao lado citoplasm ao reticulo endoplasm, o que acaba ancorando o ribossomo. durante a elongacao, a ptn é translocada p interior do lumem do reticulo endoplasmático e a seqüência sinal é removida proteoliticamente antes da terminação. 
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ScaRNA: no corpúsculo de cajal no núcleo funcionamento pos transcricional, é o local onde ocorre splicing dos pqn RNA´s 
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Tsix: controla a expressão do xist e determina a escolha do cromossomo que sera inativado 
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xist: RNA nao codificador que estabiliza o x inativo atraves de modificacoes de cromatina, como desacetilacao de histonas e metilacao de promotores.
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Small nucleolar RNAs (snoRNAs) são uma classe de pequenas moléculas de RNA que conduzem modificações químicas (metilação oo pseudouridilação) em RNAs ribossomais (rRNAs) e outros genes de RNA (tRNAs e outros pequenos RNAs nucleares. 
O processamento do pré-RNA é realizado com a ajuda de um grande número de pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) que são agrupados com proteínas particulares para formar partículas chamadas pequenas ribonucleoproteínas nucleolares (snoRNPs). Os snoRNPs associam-se ao precursor do rRNA antes que ele seja completamente transcrito, realizando cortes enzimáticos em zonas específicas do transcrito. Todas estas alterações ocorrem após a incorporação dos nucleotídeos ao RNA nascente, isto é, pós-transcripcional.
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A partícula de reconhecimento de sinal, SRP (do inglês) é um complexo RNA- proteína presente em todos os organismos conhecidos. Nos eucariotos a SRP está envolvida na translocação de proteínas para o retículo endoplasmático e nos procariotos está envolvida na translocação de proteínas para a membrana celular e mais além. 
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