ok controle aula rep 06.10

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Alexandra Woods
Controle M. e físico-químico de P de origem animal
06/10/2011 - Reposição
Coliformes
Vamos ver a parte de coliformes
É uma parte que tem muita importância na microbiologia de alimentos, talvez seja uma das aulas mais relevantes no controle microbiológico.
Os coliformes são classificados, podem ser chamados de coliformes totais. Os coliformes totais são um grupo que possui 20 e 24 espécies com diferentes características.
São um grupo onde os MO são bastonetes, gram – e não esporulados (isso é importante porque o fato de não ser esporulado significa que esse grupo não são tão resistentes como o Clostridium perfringes que é esporulado). 
O tratamento térmico atual é capaz de destruir esse grupo de MO.
É um grupo que não apresenta nenhum mecanismo de resistência específica. 
Não resiste ao tratamento térmico usual. Se eles não resistem ao tratamento térmico usual significa que quando eu encontro coliformes totais em produtos processados, essa contaminação ocorreu pós tratamento térmico.
Então encontrar coliforme total num alimento processado vai significar que essa contaminação ocorreu pós tratamento térmico ou o tratamento térmico pode ter sido feita de forma ineficiente.
Mas como eles são muito sensíveis, dificilmente o tratamento térmico dentro de uma industria que não seja eficiente não vai atingir a temperatura de 60°c, então geralmente é atribuído a contaminação pós tratamento.
São aeróbios ou anaeróbios facultativos. Ou seja, são aeróbios crescem na presença de O2.
O que é ser anaeróbio facultativo: na ausência de O2 eles conseguem se multiplicar, por isso que eles são anaeróbios facultativos.
É um grupo que não produz esporos, gram – e são bastonetes.
São facilmente destruídos pelo tratamento térmico.
Uma característica que é a principal característica desse grupo é que eles são capazes de fermentar a lactose à 35°C.
A principal característica desse grupo é fermentar a lactose a 35°c. Isso é o que vamos precisar em toda aula.
Dentro do grupo de coliformes totais, nós temos o grupo dos coliformes termotolerantes, que também são conhecidos como coliformes à 45°c ou como coliformes fecais. Essa denominação de coliformes fecais está caindo em desuso.
Esse grupo é composto por MO que são capazes de fermentar a lactose com a produção de gás (igual aos coliformes totais, porém eles são capazes de fermentar a lactose até a temperatura de 45°c)
Então o grupo dos coliformes termotolerantes é um subgrupo dos coliformes totais.
Todo coliforme termotolerante é um coliforme total. Porém nem todo coliforme total é um coliforme termotolerante.
Os coliformes totais são fermentadores da lactose com produção de gás à 35°c.
Para ser classificados como coliforme termotolerantes é necessário que o MO fermente a lactose produzindo gás até 45°c.
Nesse grupo dos coliformes termotolerantes temos 4 gêneros importantes:
- Enterobacter
- Achrombacter
- Citrobacter
- Escherichia coli
A Enterobacter, Achrombacter e a Citrobacter, elas podem ser encontradas no TGI, no solo e nos vegetais. 
Enquanto que a Escherichia coli só é encontrada no TGI. 
A E.coli é uma bactéria exclusivamente do TGI, ela vai ser o nosso foco na microbiologia de alimentos. Quando eu identifico a E.coli no alimento significa que essa contaminação foi de origem fecal. 
Nos outros 3 gêneros eu não posso afirmar que foi origem fecal, porque eles também são encontrados nos vegetais e no solo.
Essa denominação de coliformes fecais está caindo em desuso justamente por isso, porque se eu isolar um Enterobacter, eu posso falar que é um coliforme fecal pela nomeclatura, porém não necessariamente foi oriundo das fezes, por isso que está havendo essa mudança na nomeclatura. O mais correto é coliforme termotolerante ou coliforme à 45°C.
Quando eu isolo E.coli no alimento, as chances de ter contaminação por outros patógenos é muito grande porque o TGI é rico em diversas bactérias. Se eu tenho a presença de E.coli, porque não vou ter a presença de outros patógenos? 
Então a nossa aula de hoje vai ser focada justamente na E.coli.
Escherichia coli 
Existem diversas cepas de E.coli, sendo que 4 delas são consideradas as mais importantes. Mas existem outras que também provocam doenças alimentares, mas são as que tem menor ocorrência.
Posso ter as cepas:
E.coli enteropatogenica clássica.
E.coli enteroinvasora 
E.coli enterohemorragico
E.coli enterotoxigênica
Essas 4 cepas possuem importância na microbiologia de alimentos, vira e mexe estão envolvidas em surtos e cada uma tem sua peculiaridade.
A E.coli enteropatogênica clássica (EPEC) 
Vai acometer principalmente recém nascidos.
É a causa de alta mortalidade em recém nascidos. Porque os recém nascidos ainda não possuem o sistema imunológico completo, então eles são muito mais susceptíveis a adquirir qualquer doença.
A população adulta e mais velhas não são susceptíveis porque já possuem o sistema imunológico formado.
Alem disso, é muito fácil o recém nascido desenvolver a doença causada por essa cepa porque a dose infectante para a ocorrência dos sintomas é muito baixa.
A forma como essa cepa age no organismo é a forma normal. Vai ocorrer a ingestão do alimento com o MO, então é tipo infecção. O MO vai se aderir a mucosa intestinal, vai se multiplicar e vai levar a reação inflamatória provocando quadros de diarréia, febre, dor abdominal e vômitos.
Vai ter febre porque o quadro não é provocado por toxina. 
A E. coli enteropatogênica clássica está mais relacionada com a morte de recém nascidos. Geralmente ela é responsável por 15% dos óbitos em recém nascidos que sofreram surtos alimentares, é considerado um percentual alto. Geralmente quem vai fazer a mamadeira é quem vai contaminar. Geralmente é a alimentação de 0-3 meses. O problema é o manipulador, não é a matéria prima.
A segunda cepa patogênica é a E.coli enteroinvasora (ou enteroinvasiva - EIEC)
A E.coli enteroinvasora é representada pela sigla EIEC. 
Pode acometer qualquer individuo em qualquer idade, onde só basta o individuo ingerir a dose infectante que varia de 106 a 108 UFC. Essa dose infectante é variável porque se for um individuo imunossuprimido, 106 é o suficiente para provocar a doença. Mas se for uma pessoa sadia, ela precisa ingerir um pouco mais do MO para que os sintomas apareçam.
Vai ocorrer a ingestão do alimento com o MO, esse MO vai aderir a mucosa intestinal e vai se multiplicar. Essa cepa possui a capacidade de penetrar na mucosa e na submucosa intestinal.
Então eu tive a ingestão do alimento com o MO, adesão e multiplicação, e como é uma cepa com capacidade invasiva, ela vai invadir a mucosa intestinal e a submucosa. Vai romper os vasos, a parede intestinal/mucosa intestinal pode necrosar, a pessoa vai ter uma diarréia com sangue justamente porque como invade a submucosa ela vai destruir também os vasos sanguíneos. Ela vai ter febre e uma cólica intensa.
Geralmente está ligado ao consumo de água contaminada, ou de alimentos contaminados que tenham sido preparados com água não tratada.
Essa cepa possui o mecanismo de ação muito semelhante a Shigella, que é uma outra bactéria. Então por isso que nós precisamos diferenciar. Os sintomas são os mesmos, então as vezes vc não consegue diferenciar se foi por ação da Schigella ou se foi por ação da E.coli enteroinvasora.	
Independente de qual cepa que esteja contaminando meu alimento, a única forma que eu tenho como evitar é lavar as mãos, cuidar da própria higiene. Porque dessa forma vc vai diminuir os riscos de contaminação do alimento. Por mais que alguns alimentos já tenham na sua composição coliformes totais, não vai ocorrer a manifestação dos sintomas se ingerir uma dose muito baixa. Então geralmente vai estar muito relacionado com quem manipula os alimentos.
E. coli enterotoxigênica (ETEC)
Também é conhecida como ETEC.
É conhecido como a causadora da “Diarréia dos viajantes”.
Geralmente vai ocorrer em locais sem saneamento básico ou com saneamento básico precário.
O que vai acontecer: Ela é conhecida com esse nome porque geralmente a populaçãolocal já está resistente a cepa, então a população local não desenvolvem nada, mas se agente for naquele local e consumir ali, nós podemos ter essa infecção. 
Esses locais mais alternativos que não tem uma vigilância sanitária local, geralmente vai ser o local onde vai ocorrer esse problema.
Pode acometer individuo de qualquer idade.
Vai ocorrer a ingestão do MO, a adesão e a multiplicação. No momento que essa cepa se multiplica ela é capaz de produzir uma toxina. Vai produzir a toxina, essa toxina vai levar ao desequilíbrio da pressão osmótica pelo aumento do AMP (que é uma enzima).
Vou ter a ingestão do MO junto com o alimento, vai aderir as vilosidades intestinais, vai se multiplicar no intestino e durante a multiplicação vai produzir uma toxina.
Essa toxina vai provocar o desequilíbrio da pressão osmótica pelo aumento do AMP cíclico. A partir daí o individuo vai apresentar uma diarréia bem intensa, bem aquosa (porque vai estar perdendo muito liquido por esse desequilíbrio) e esbranquiçada, sem febre.
Não tem febre porque teve produção de toxina. Toda vez que vc tiver produção de toxina, qualquer MO que for produtor de toxina e isso for causar a doença, eu nunca vou ter febre. Febre é só quando não tiver produção de toxina.
E.coli enterohemorrágica (EHEC)
A ultima cepa que atualmente é a cepa que merece mais destaque é a e.coli enterohemorragica (EHEC), é a cepa mais nova e a mais agressiva.
Nesse grupo dessa cepa, como principal representante temos a e.coli O157:H7. É uma cepa muito nova e muito agressiva. Ela provoca a morte. 
O seu primeiro relato foi em 1982, é relativamente nova. Ela foi relatada primeiramente após a ocorrência de um surto, após um grupo de pessoas consumirem hambúrguer de uma rede de fast food nos EUA e passar mal, algumas pessoas chegaram a morrer e foi nessa época que surgiu a e.coli O157:H7, por isso que ficou conhecida como “Doença do hambúrguer”
Essa cepa apresenta algumas características muito peculiares. A e.coli O157:H7 é extremamente resistente a antibióticos, até aos antibióticos de ultima geração já não vem fazendo efeito, por isso que ela acaba se tornando um problema ainda maior.
Alem disso, a e.coli O157:H7, existem diversos trabalhos mostrando a capacidade de sobrevivência dessa espécie. Ela consegue se desenvolver em vários ambientes, é muito fácil de vc encontrar. A professora trabalha com ela e viu que resiste a congelamento, resfriamento, etc. 
Elas possuem características muito peculiar. Existem diversos trabalhos, principalmente em carne bovina que mostra isso, quanto a sobrevivência dela. Iogurte, carne, tem muito relato da sobrevivência dela. Por isso que é uma preocupação mundial.
Toda carcaça que for exportada daqui pra outro pais, principalmente para America do norte e Europa, essa carcaça deve ter laudo negativo para E.coli, justamente pelo trauma que eles tem relacionados a doença do hambúrguer. 
Aqui dentro no Brasil não é necessário, mas o que for pra exportação é necessário.
Ultimamente tem ocorrido outros surtos, o ultimo que aconteceu foi no broto de alfafa na Alemanha, que foi descoberto que era a E.coli O157:H7. 
Nos EUA e no Canadá tem muito relato dessa cepa em enlatados. Geralmente o enlatado sofre processamento térmico muito drástico, e vc encontrar a e.coli enterohemorragica naquele enlatado é preocupante. Mas não se sabem ainda os mecanismos de resistência direito.
Perigo: é uma cepa extremamente resistente. 
O reservatório dessa cepa são os bovinos. Mas isso não indica que eu não possa ter em pescado, em leite e em derivados. O principal reservatório são os bovinos, por isso que a maioria dos produtos incriminados em surtos por E.coli enterohemorrágica são relacionadas com o consumo de carnes cruas ou mal passadas. 
Um dos alimentos mais incriminados em surtos provocados por E.coli enterohemorrágica são a ingestão de carne crua ou mal passada.
O grande problema é que proprietários de cães e gatos muitas das vezes tem mania de dar aos seus animais carne crua. Isso pode ser uma fonte de contaminação, uma fonte de infecção por e.coli enterohemorrágica.
Outro problema: hambúrguer preparado em fast food. Geralmente eles possuem uma espessura grossa, então eles retiram do freezer, colocam na chapa quente e rapidinho do lado de fora fica bom, mas dentro está mal passado, e ai eu posso ter também uma infecção alimentar pelo consumo desse hambúrguer.
Eu preciso ter a certeza que no centro geométrico do meu hambúrguer atingiu a temperatura de 60°C, o que muitas das vezes não acontece. É muito comum vc receber a carne mal passada no restaurante.
O que vai acontecer: Vai ocorrer a ingestão do MO com o alimento contaminado, vai ocorrer a adesão e a multiplicação na mucosa. Quando se multiplica é capaz de produzir uma toxina citotóxica. Então a e.coli enterohemorrágico é capaz de produzir durante a sua multiplicação uma citotoxina.
Essa citotoxina vai dar a essa cepa a capacidade também de penetrar na mucosa e na submucosa intestinal. Então a cepa vai produzir a citotoxina e vai invadir a mucosa e a submucosa.
A pessoa vai ter uma diarréia com sangue, muita dor abdominal e não vai ter febre porque vai ser provocado por uma toxina.
Se for uma pessoa sadia com sistema imunológico bom, provavelmente a pessoa vai ter essa diarréia com sangue, não vai conseguir chegar a um diagnostico, porque é muito difícil vc saber que está com uma diarréia porque vc ingeriu um alimento contaminado com a e.coli enterohemorrágica. Vai ficar alguns dias ruins e depois vai melhorar. ou em alguns casos, algumas pessoas precisam ser internadas para se hidratarem e para receber a antibioticoterapia.
O maior problema é a população de risco, que são os idosos, gestantes, recém nascidos ou pessoas que possuam sistema imunológico debilitado.
Porque: porque no momento que essa cepa (MO) invade a mucosa e submucosa ela vai conseguir atingir a corrente sanguínea, porque rompe as barreiras que existiam entre a corrente sanguínea e a parede intestinal. Atingiu a corrente sanguínea, dificilmente a pessoa consegue se curar, porque essa cepa tem um tropismo pelo parênquima renal. Então ela vai atingir o parênquima renal, destruindo esse parênquima e provocando uma doença chamada de “Síndrome Urêmica Hemolítica”. 
Então invadiu a mucosa e submucosa, a cepa consegue chegar à corrente sanguínea, na corrente sanguínea essa cepa vai ter tropismo pelo parênquima renal. Vai destruir o parênquima renal provocando uma doença chamada de “Síndrome Urêmica Hemolítica”.
Então quando chega nesse ponto de desenvolver essa síndrome urêmica hemolítica, dificilmente a pessoa consegue sair desse quadro, porque atingiu a corrente sanguínea, tem septicemia. 
A melhor forma de se evitar a contaminação de qualquer alimento pela E.coli é fazendo um tratamento térmico mínimo de 60°C ou refrigerando esse alimento numa temperatura máxima de 7°C. Porque em temperaturas inferiores a 7°C esse grupo não consegue se multiplicar.
O que acontece é que tanto o resfriamento quanto o congelamento eles não são capazes de destruir o MO, eles são capazes apenas de retardar a multiplicação. 
Agora vamos ver a parte da análise propriamente dita. 
Colimetria
O que é a Colimetria: é um método quantitativo de número mais provável (NMP) de coliformes presentes naquele alimento.
Essa técnica de numero mais provável pode ser utilizada em outras analises, em outros MO. Mas nesse caso quando eu falo de colimetria eu estou me referindo a coliformes. 
O que seria esse numero mais provável: como eu vou trabalhar com um caldo, que é um meio liquido, eu não consigo visualizar as colônias. Então foi criada uma tabela, que é chamada de “Tabela do número mais provável”, onde essa tabela de acordo com os tubos que forem positivos na minha análise, ela vai me fornecer a provável quantidade de MO presente naquela amostra.
Ex.: Existem 2 tabelas:
Uma tabela que vai trabalhar com a probabilidade de 95% de acerto ou seja, 5% de erro.
Uma segunda tabela que vai trabalhar com 99% de acerto, ou seja, 1% de erro, é muito mais confiável.O que vai me determinar qual tabela que vou utilizar é a minha analise, se é uma analise fiscal, se é analise de rotina, se houve algum surto, etc.
Porque? Qual vai ser a diferença? 
Se eu trabalho com 95% de acerto, vou trabalhar com 3 series de 3 tubos. Quando falo em série, estou falando em diluição.
Vou trabalhar com 3 diluições de 3 tubos. Ou seja, vou ter 3 tubos da diluição 10-1, 3 tubos da diluição 10-2 e 3 tubos da diluição 10-3.
Isso significa que estou trabalhando com 3 séries de 3 tubos, ou seja 3 diluições em triplicata.
Quando eu trabalho com a tabela que me oferece 99% de acerto, eu trabalho com 5 séries, ou seja, 5 diluições de 3 tubos. Ao invés de parar a diluição 10-3, vou parar na diluição de 10-5. 
No dia a dia, na rotina eu não vou fazer 5 séries de 3 tubos, porque é inviável para um laboratório particular fazer essa quantidade de tubos, leva muito tempo e é muito trabalhoso. Mas agora, se for uma analise fiscal vou fazer 5 séries de 3 tubos.
Se for uma analise de rotina, posso fazer analise de 3 series de 3 tubos, pois é apenas para analise do estabelecimento.
Depois que eu preparei as minhas diluições, sejam ela de 3 series ou de 5 series, eu vou começar a fazer o 1º teste:
Teste presuntivo
Esse teste presuntivo vai ter como objetivo a verificação (avaliar) da presença de MO Gram – , fermentadores da lactose à 35°C.
Esse teste é para eu saber se na minha amostra existe a possibilidade de ter o MO Gram –, fermentador da lactose. Porque os coliformes totais são Gram –, fermentadores da lactose
Vou utilizar o meio de cultura chamado de “Caldo Lauril Sulfato”. 
Esse caldo vai ter como substrato a lactose e o lauril sulfato que vai funcionar como um inibidor.
Vou pegar 1ml da diluição e vou inocular nesse caldo. 
Nesse caso de ser 3 séries, eu vou ter 9 tubos de Caldo Lauril sulfato. Cada tubo desse eu vou inocular em um tubo, por isso que é um pouco trabalhoso.
Inoculei o caldo lauril sulfato, vou incubar.
Uma coisa importante: para que eu diga que esse teste foi positivo, eu preciso ter uma forma de visualização (já que é um caldo, não vou ter colônia formada). 
Para ser positivo, a característica que esse meio tende a ficar turvo com um depósito de algum substrato no fundo (um resquício de substrato no fundo) e eu preciso saber se produz gás, porque além de fermentar a lactose o coliforme total fermenta a lactose produzindo gás. 
Como vou fazer para verificar a presença de gás? Dentro desse meu tubo com o meio de cultura vou ter um pequeno tubinho (como se fosse um tubo de ensaio pequeno ch. Tubo de Durhan) virado de cabeça pra baixo. Se produzir gás, o gás fica aprisionado dentro desse tubinho.
Então eu vou incubar esse meu tubo com o Caldo Lauril Sulfato com o tubinho de Durhan dentro à 35-37°C durante 24-48 horas. 
Porque: eu quero verificar se é um MO fermentador da lactose, com produção de gás à 35°c.
Encubei, retirei da estufa.
Foto: forma umas bolhas de gás no tubo Durhan, pode produzir tanto gás que o tubo chega a subir. Nesse momento eu sabia que nesses tubos eu tinha um MO gram – fermentador da lactose produtor de gás à 35°C.
Isso é uma coisa que merece atenção:
Quando eu tenho uma série de 3 diluições com 3 tubos cada um
Se essa 1ª serie der tudo negativo, não produziu gás e continua límpido. 2ª série também, e só a 3ª der positivo significa que houve alguma contaminação durante a análise. Porque se a diluição mais diluída apresentou crescimento, como que a primeira diluição não apareceu nada? Então foi um erro de manipulação, provavelmente houve uma contaminação durante a análise nessa terceira série. Então eu preciso repetir essa análise.
A minha amostra menos diluída nunca pode ter um resultado inferior à amostra diluída. Porque quanto mais eu vou diluindo, mais difícil vai ser de eu identificar o MO. 
Nesse caso eu deveria ter encontrado na 1ª e a 2ª positivas, e a 3º negativa, ai não teria problema. 
Quanto mais eu diluo, mais difícil vai ficar de eu achar o MO.
O que pode acontecer também, é de numa mesma diluição eu ter 1 tubo positivo e 2 negativos. Isso não é erro, o que pode ter acontecido é que as vezes no momento que vc pegou a quantidade de amostra para inocular, as vezes vc não homogeneizou direito e não pegou tanto inoculo quanto deveria.
 Agora, se eu tenho na 2ª diluição, 1 tubo positivo e 2 negativos, não tem problema, não é erro. As vezes quando vou pegar e fazer inoculação em outro local no tubo eu posso não pegar a quantidade que eu deveria pegar de bactérias.
Por isso que vc tem que fazer em triplicata, justamente para confirmar a sua análise. 
Teste confirmativo
Os tubos positivos no teste presuntivo, eles vão ser levados para o teste confirmativo. 
O que vou fazer: vou pegar os tubos positivos, e todos eles vão ser semeados em outros 2 meios distintos (cada tubo positivo vai ser semeado em 2 meios diferentes). Os tubos negativos vou descartar.
Lembrar: se estou trabalhando com 3 series de 3 tubos, estou trabalhando com 9 tubos. Se todos eles deram positivos, nesse momento vou trabalhar com 18 tubos, porque são 2 tubos diferentes.
Vou inocular 1ml dos tubos que foram positivos no teste presuntivo em um tubo contendo caldo VBBL e em outro tubo contendo o caldo EC. 
O caldo VBBL vai servir para confirmarmos a presença de coliformes à 35°C. O caldo EC serve para confirmar a presença de coliformes à 45°C, ou seja, coliformes termotolerantes. 
Porque: porque no teste presuntivo eu só sei que eu tenho um MO fermentador da lactose que produz gás, não posso afirmar que é um coliforme ainda. 
Então eu vou inocular nesse VBBL, o caldo VBBL que possui como substrato a lactose e como inibidores: o verde brilhante e a bile bovina. 
Esse meio vai possuir 2 inibidores: verde brilhante e a bile bovina.
Já o caldo EC vai ser rico em lactose que também é substrato e sais biliares (os sais biliares são inibidores).
Porque no Valdo VBBL eu tenho 2 inibidores e no caldo EC eu tenho somente 1 inibidor? Tenho só um inibidor porque a temperatura de incubação desses 2 tubos é diferente, como no caldo EC eu quero identificar a presença de coliforme termotolerante eu vou incubá-lo a 44-45°C durante 48 horas. Essa temperatura de 45°C já vai fazer uma seleção dos MO que vão crescer. Então nesse caso no caldo EC, a temperatura por funcionar como um mecanismo de seleção, ele tem menos inibidores do que o caldo VBBL.
O caldo VBBL será incubado à 35°C durante 24-48 horas.
O caldo EC a 44-45°c durante 24-48 horas.
Nesses 2 tubos eu também vou ter o tubo de Durhan.
Depois que eu retirei esses 2 tubos da estufa, eu posso ter 4 possíveis resultados. 
Para ser confirmado como positivo: o tubo tem que apresentar a turvação do meio e a produção de gás;
VBBL + EC +
VBBL + EC – 
VBBL – EC +
VBBL – EC –
VBBL + EC +: 
o que significa isso: Significa que eu tenho a presença de coliformes à 35°C e à 45°C, ou seja, eu tenho coliformes termotolerantes.
VBBL + EC –:
Significa que eu tenho coliforme total, porem não é coliforme termotolerante.
VBBL – EC +:
Significa que eu não estou trabalhando com o grupo dos coliformes, eu tenho um MO que é capaz de fermentar a lactose até a 45°C, mas não é coliforme.
VBBL – EC –:
Significa que o MO presente não consegue fermentar a lactose à 35°C nem à 45°C e não é um coliforme. 
Então a partir desses resultados vou começar a confirmar o que deu no meu teste presuntivo.
O que vou fazer:
Ex: + + : temos que anotar quantos tubos foram positivos no teste presuntivo.
e.x 10-1 tive 3 positivos, na 10-2 tive 2 tubos positivos e na diluição 10-3 tive 0 tubos positivos.
Eu vou na tabela de numero mais provável e lá eu vou que minha série foi 3, 2, 0, e lá vai me dizer quantos coliformes eu tenho nessa seqüência. 
Na tabela vem representado as combinações possíveis de tubos positivos.
 
O resultado seria representado ex.: 1,5 NMP de coli a 35°C/ml. É uma forma subjetiva porque vc não está contando, vc está apenas utilizando uma forma de conseguir saber mais ou menos o quanto tem de contaminante naquela amostra.
Vc pega a sua combinaçãoe vai olhar na tabela, e lá vai te dar o valor.