ok controle pratica 06.10.11
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ok controle pratica 06.10.11


DisciplinaControle M. e Físico-químico de Produtos de Origem Animal20 materiais146 seguidores
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não posso afirmar depois dessa prova que é um Clostridium perfringens. Para eu saber qual é a espécie, eu preciso realizar as provas bioquímicas.
Então essa primeira etapa vai apenas me dizer se é uma bactéria do gênero Clostridium ou não. 
Adicionei o meu meio de cultura na placa de petri, vou esperar em torno de uns 15-25 minutos para solidificar. Depois que solidificou eu vou incubar essa placa. Só que vai ter uma outra diferença quanto aos outros MO. Como é um MO anaeróbio, eu preciso cada vez mais dar condições de anaerobiose para eles, porque antes de incubar eu vou pegar a placa de petri e vou colocar na jarra de Gaspak. Essa jarra vem com uns riscos que são riscos compostos por uma substância e esses riscos vão retirar o O2 presente aqui dentro dessa jarra. Então o ambiente vai ser de anaerobiose. Vou colocar as placas aqui dentro, vou fechar e vou incubar essa jarra na estufa. 
Toda vez que estiver pesquisando um MO que seja anaeróbio eu preciso utilizar a jarra Gaspak na incubação. 
Vou incubar a jarra Gaspak com as placas a 46°C durante 24-96 horas. Essa temperatura e esse tempo também são diferentes do Bacillus e do Staphylococcus. Essa temperatura de 46°C vai ser favorável para o crescimento do Clostridium e além disso ela também vai ser seletiva porque os outros MO, a maioria deles não conseguem se desenvolver nessa temperatura. São raros os MO que possuem a temperatura ótima de crescimento a temperatura de 46°C. 
Uma outra coisa importante é que quando eu falo de incubação, tanto aqui quanto do Staphylococcus quanto do Bacillus, eu sempre vou utilizar a temperatura de incubação a temperatura ótima de crescimento do MO. 
Então eu incubei a jarra Gaspak na estufa, o tempo é maior porque eu preciso que os esporos esporulem, formem a forma vegetativa e formem as colônias visíveis. 24 horas dependendo do grau de contaminação do meu alimento pode crescer, porem é mais comum nós obtermos esse crescimento a partir de 72 horas. Sempre é bom lembrar que nessas etapas iniciais eu preciso ter a colônia isolada de uma colônia visível. Se eu tirar antes do tempo preconizado provavelmente não vai ter ocorrido a formação da colônia. 
Então eu retirei após as 96 horas, retirei a jarra Gaspak da estufa. O que eu vou observar: se for um MO do gênero Clostridium, o que vai acontecer: eles vão utilizar o sulfito. Ou seja, eles são sulfitos redutores, então eles vão reduzir o sulfito em sulfeto formando colônias com a coloração negra (fica bem pretinho).
Nesse momento, se eu retirar minha placa da estufa e eu observar a formação de colônias negras, significa que houve a utilização do sulfito, esse sulfito foi reduzido a sulfeto, tanto a coloração negra. Porque se dá essa coloração negra: quando há redução do sulfito em sulfeto também há liberação de ferro, e o ferro também é negro, então vai dar a essa colônia uma característica de cor escura. 
Nesse momento eu sei que estou trabalhando com um MO sulfito redutor, com um Clostridium sulfito redutor. Eu ainda não posso afirmar que seja o Clostridium perfringens. 
A partir desse momento eu vou partir para as provas bioquímicas. Assim como no Staphylococcus assim como no Bacillus, eu preciso restabelecer o potencial LOG do meu MO. Ou seja, o potencial de multiplicação. 
Vou pegar de 3-5 colônias características que cresceram no Agar SPS e vou semear no Agar nutriente inclinado. 
Toda vez que eu for restabelecer o potencial de multiplicação de um MO, independentemente da espécie, eu sempre vou utilizar um meio de enriquecimento, que vai ser um meio que vai dar condições para o meu MO restabelecer o seu potencial máximo de multiplicação.
Geralmente nós utilizamos o Agar nutriente, só que as vezes agente não tem o Agar nutriente no laboratório, então vc pode optar por outro meio de enriquecimento. 
Então eu vou pegar essas colônias características que cresceram no Agar SPS, as colônias negras e vou inocular no Agar nutriente inclinado. Vou incubar. Nesse momento não precisa estar na jarra gaspak, pode incubar normalmente no tubo de ensaio. Incubar a 46°C durante 24-48 horas. Vou utilizar esse tempo porque não estou trabalhando mais com esporo, estou trabalhando já com a colônia formada, então eu não preciso esperar a transformação do esporo na forma vegetativa. 
Relembrando: o Agar nutriente inclinado vai estar num tubo de ensaio inclinado, justamente para eu ter uma maior superfície de contato. 
Para a determinação, para a confirmação da espécie Clostridium perfringens eu vou realizar 5 provas bioquímicas:
- Prova de redução do nitrato a nitrito; 
- Prova da motilidade;
- Prova da coagulação do leite;
- Fermentação da glicose e da lactose;
- Prova da gelatinase.
Vamos ver que a partir de agora, todos os MO que vamos utilizar vai ter uma infinidade de provas bioquímicas. Então faz uma tabela mostrando quais provas bioquímicas se faz para cada grupo, para não nos enrolarmos.
A prova da gelatinase não vou falar de novo porque é igual a que foi feita para Staphylococcus aureus e para Bacillus cereus. Então estudar no caderno.
Vou utilizar o meio gelatina nutritiva e vou precisar um tubo controle e de um tubo onde vou inocular as minhas colônias, porque justamente como é uma gelatina eu não posso autoclavar o meu meio senão vai desnaturar, então eu preciso trabalhar com um grupo controle. Essa prova no caso do Clostridium perfringens vai ser positiva, ele vai ser produtor da enzima gelatinase. (Gelatinase +).
Então eu incubei o meu Agar nutriente inclinado em estufa, depois de 48 horas eu retirei. O que vou fazer agora: a partir das colônias que cresceram nesse Agar nutriente inclinado é que vou realizar todas as provas bioquímicas. 
A primeira prova: prova de redução do nitrato a nitrito.
Essa prova tem como objetivo verificar se o MO em questão, se ele é capaz de reduzir o nitrato em nitrito utilizando as enzimas Nitrato Redutase Assimilativa e Nitrato Redutase Respiratória. 
Ou seja, o objetivo dessa prova é verificar se o MO que está contaminando a minha amostra é capaz de reduzir o nitrato a nitrito através da produção dessas 2 enzimas: a Nitrato Redutase Assimilativa e a Nitrato Redutase Respiratória.
Dependendo a capacidade de desenvolvimento do meu MO, ele pode produzir muita quantidade de enzimas, ou uma quantidade um pouco menor. Dependendo dessa quantidade de enzima produzida, o nitrato pode ser reduzido a nitrito, quando a quantidade de enzima produzida for pequena. Ou no caso do MO produzir uma quantidade muito elevada das 2 enzimas, vou ter a redução do nitrato a amônia. Vai alem do nitrito, vai reduzir nitrato a nitrito e o nitrito em amônia.
Quando a quantidade de enzimas produzidas for uma quantidade pequena, vai reduzir o nitrato até nitrito. Então o que vou fazer: vou pegar 2 a 3 colônias que cresceram no Agar nutriente inclinado e vou semear, vou inocular no Caldo Nitratado. Como o próprio nome já diz, o principal substrato desse meio de cultura vai ser Nitrato. 
Vou incubar o tubo com caldo Nitratado inoculado a uma temperatura de 35-37°C durante 48 horas. 
Então eu peguei de 2-3 colônias que cresceram no Agar nutriente inclinado e semeei no caldo nitratado. Incubei esse caldo nitratado onde foi inoculado minhas colônias, vou tirar da incubação. 
Depois da incubação eu vou pingar 2 reagentes nesse tubo, que são: Ácido sulfanílico e o Alfa-naftil amina. Pode ocorrer 3 tipos de resultados: 
1º deles: Eu posso ter tido a formação de nitrito durante a incubação. Quando eu tenho a formação do nitrito durante a incubação e eu pingo os reagentes, o meu tubo do meio de cultura vai adquirir a coloração vermelha. 
Se ocorreu a redução do nitrato em nitrito durante a incubação, quando eu pingar os reagentes vai formar a cor vermelha, significa que a prova é positiva porque houve a redução do nitrato a nitrito. 
2º deles: Se houver a presença de nitrato no meu tubo após a incubação, significa que a bactéria em questão não é capaz de reduzir o nitrato em nitrito. 
Se depois da incubação tiver nitrato presente no tubo, significa que a