ok Controle Pratica AV2 29.09.11

Prévia do material em texto

Alexandra Woods
Controle M. e físico-químico de P de origem animal
29/09/2011 - Prática
Bacillus cereus
É uma espécie de bactéria, pertencente ao gênero Bacillus. Onde vão possuir a característica de ser aeróbio mesofilo, ou seja, necessita do O2 para seu crescimento e mesofilos porque a temperatura de crescimento ótimo pra ele é a temperatura ambiente.
Eles podem apresentar crescimento na temperatura que varia de 10 a 48ºC. é uma ampla faixa de temperatura. Porém, vão atingir a plena multiplicação quando eu tiver com uma temperatura de 28-35ºC, que é a nossa temperatura ambiente.
Uma coisa importante é que esses MO, são MO esporulados, são capazes de produzir esporos. Os esporos são uma característica de resistência, apesar do MO ser sensível ao tratamento térmico, os esporos são termorresistentes ao tratamento térmico usual. Esse é o grande problema.
Então quando eu submeto meu alimento ao tratamento térmico usual (que é a temperatura de 65-80ºC), eu posso eliminar o meu MO, porem se já tiver esporos presentes no alimento, os esporos vão esporular.
Então o grande problema do bacillus cereus é o fato de ser esporulado, justamente porque o tratamento térmico é suficiente para destruir a bactéria, porem não é suficiente para destruir os esporos.
Com isso, como os esporos são termorresistentes, ao ser aquecido a uma temperatura que varia de 65-80ºC, os esporos vão esporular.
Além disso, a água de atividade (Aa) que o bacillus cereus necessita para o seu crescimento ela deve ser de no mínimo 0,95. É considerado uma água de atividade alta, já que a atividade de água máxima de um alimento é 1. Então o bacillus cereus necessita de um alto teor de água de atividade para se multiplicar.
Provavelmente quando tiver trabalhando com um produto seco, dificilmente vou ter a multiplicação do bacillus sereus
Faixa de pH de crescimento de 4,9-9,3
Resistem a concentração salina de ate 7,5%, é uma concentração salina considerada alta.
Além disso, possuem como substrato preferido o amido. O fato de possuir o como substrato preferido o amido, é a principal característica desse grupo, porque eu sei que vão crescer em alimentos que tem teor de amido elevado, porque ele precisa usar o amido para se multiplicar.
Alem de ser esporulado, esse MO também é produtor de toxina. Então é um MO tipo intoxicação, ou seja, o que vai provocar a doença no individuo que ingeriu é a ingestão da toxina. Então eu preciso ter a toxina pré formada no meu alimento para que ocorra a intoxicação. 
Para que ocorra a produção de toxinas, é necessário que eu tenha no mínimo no meu alimento uma quantidade de 105- 106 UFC, porque somente a partir dessa quantidade de colônias é que essas bactérias vão conseguir produzir uma quantidade de toxinas que vão ser capaz de provocar sintomas na pessoa que ingeriu.
Então o bacillus sereus pode produzir 2 tipos de toxinas:
Termosensível (destruída pelo tratamento térmico) e outra toxina que é termorresistente. 
A toxina termosensível é destruída quando o alimento é submetido a uma temperatura de 55ºC durante 20 minutos. Vai ser responsável por provocar a síndrome diarréica.
O que vai acontecer: O individuo vai ingerir o alimento contaminado com o bacillus sereus e com a toxina já pré formada no alimento. 
Sempre lembrando que a toxina vai ser sempre pré formada no alimento e nunca vai ser formada no organismo.
Ingeriu o alimento contaminado com o MO e a toxina, essa toxina na mucosa intestinal vai provocar o aumento da adenilciclase. A adenilciclase é uma enzima que vai ser responsável também por manter o equilíbrio da flora intestinal, então quando eu tenho o aumento da produção de adenilciclase, vai haver um desequilíbrio da minha flora intestinal.
A adenilciclase é uma enzima responsável por manter o equilíbrio da flora intestinal, então quando tenho um aumento dessa adenilciclase, vai ocorrer o desequilíbrio dessa flora e o individuo vai ter uma diarréia intensa.
Além disso, essa toxina termosensível também tem uma ação necrosante sobre a mucosa intestinal, por ter essa ação necrosante, a diarréia além de ser intensa, vai ser acompanhada por sangue.
Nesse momento vou ter um individuo com uma diarréia intensa, com sangue e vai ter uma dor abdominal muito forte. 
Características de um indivíduo com síndrome diarréica: diarréia sanguinolenta intensa e muita dor abdominal.
Esse tipo de contaminação por bacillus sereus e produção dessa toxina termossensivel, e como já diz, termossensível é destruída pelo tratamento térmico. Então porque vou ter contaminação: provavelmente quando eu tenho essas intoxicações, elas vão ocorrer devido a uma contaminação pós tratamento térmico, após o produto pronto para o consumo. Então ou vai ser um alimento cru, ou vai ser um alimento que já está pronto pro consumo e que a contaminação ocorreu depois do processo térmico.
Os alimentos envolvidos são alimentos com teor de amido alta como: pudim, carne, pescado, massas e leite.
Então a toxina termossensível vai estar relacionada com alimentos que tem um teor de amido alto, e geralmente vai ocorrer em pudim, carne, pescado, massas, leite. Na verdade em tudo vc pode ter a contaminação pós tratamento térmico, só que dependendo do alimento, ele vai encontrar a condição favorável ou não para ele se desenvolver (amido e quantidade de água alta). 
Toxina termorresistente
A toxina termorresistente tem capacidade de resistir ao tratamento térmico a uma temperatura de 126°c durante 90 minutos. Então ela é extremamente resistente, porque resiste a uma temperatura alta durante um tempo muito longo (1,5 hora é muita coisa).
Nunca deixamos alguma coisa no fogo a essa temperatura durante 1,5 horas porque senão vc vai queimar o seu alimento. Então por isso que não conseguimos eliminá-la.
Essa toxina termorresistente é responsável por provocar a síndrome emética no individuo. A síndrome emética vai ser caracterizado por vômitos e mal estar, não vai ter diarréia.
Na síndrome diarréica eu vou ter uma diarréia intensa, sanguinolenta e com muita dor abdominal. Nesse caso da síndrome emética vou ter vômitos, mal estar muito grande e muito enjôo.
Qual vai ser o alimento mais incriminado com os surtos da síndrome emética: 
Vai ser o arroz, é uma das maiores causas de intoxicação pelo bacillus cereus.
Porque: O arroz tem alto teor de amido, o cultivo é realizado com muita água (que é outro fator que predispõe ao crescimento de bacillus sereus), e além disso, quando fazemos o arroz, vamos preparar com adição de água.
Se já tiver havido a produção de esporos, nesse momento vou ativar os meus esporos. Por isso que o arroz é o principal envolvido em surtos com o bacillus cereus.
Alem disso, é comum nós preparamos o arroz, e deixamos em temperatura ambiente ate a hora de ser consumido. Então o momento que eu deixei o arroz ali da hora do almoço até a hora do jantar é o momento que meu MO vai atingir a dose infectante e vai produzir o esporo e as toxinas, porque ele vai estar em temperatura ambiente que é a temperatura ótima do crescimento dele. Água de atividade alta, amido, etc. é o ambiente perfeito para a multiplicação do bacillus sereus.
Toda vez que eu pensar em bacillus cereus, vou pensar em arroz, porque é o principal alimento envolvido.
Por isso que devemos consumir o arroz em até no máximo 2 horas após o seu preparo, e se não for consumido em até 2 horas após o seu preparo, devo colocar em geladeira, e na temperatura que não ultrapasse a temperatura de -10°C (inferior a essa temperatura ele não consegue se multiplicar). 
Em leite também podemos encontrar bastante, porque o leite tem um teor de água elevado, e tem um pouco de amido.
A intoxicação vai ser provocada pela ingestão de uma das 2 toxinas, que vai estar presente no alimento.
Recebi minha amostra, e vou fazer a pesquisa de bacillus sereus:
O que vou fazer: Recebi a minha amostra, vou homogeneizar a minha amostra e vou diluir. Se tratando de bacilus cereus, geralmente vai ser uma amostra sólida, então eu vou precisar homogeneizar no Stomacher. 
Se eu tiver trabalhandocom leite, não preciso colocar no stomacher, posso homogeneizar balançando, mas se estiver trabalhando com carne, pescado ou com arroz, eu preciso colocar no stomacher para fazer a homogeneização.
Depois de fazer a homogeneização, vou fazer a diluição. (que é a mesma coisa que vimos, é o mesmo procedimento, vou diluir até a diluição que eu acho que é suficiente para fazer a contagem). Vou utilizar o plaqueamento de superfície. 
Mas porque eu não uso o plaqueamento de profundidade se o bacillus cereus é aeróbio mesofilos? Justamente porque quando uso em profundidade para aeróbios mesofilos não estou fazendo a contagem de um gênero especifico, estou fazendo contagem de MO indicadores, vou estar utilizando um meio de cultura que é não seletivo (que é o Agar padrão para contagem). Então quando uso um meio de cultura que é não seletivo, eu preciso utilizar outra forma de seleção que seria a técnica de plaqueamento em profundidade.
Como nesse caso eu estou pesquisando o bacillus, vou utilizar o plaqueamento de superfície, por se tratar de um meio de cultura específico, seletivo.
Então eu fiz as minhas diluições, o que vou fazer agora:
Pego 0,1ml de cada diluição e vou semear em duplicada em uma placa de petri que vai possuir já o meio de cultura (porque é plaqueamento de superfície). 	
Meio de cultura utilizado: Agar manitol gema de ovo polimixina. É o meio mais fácil de lembrar porque os componentes presentes nesse meio são os componentes que estão presentes no meio. 
Esse meio de cultura vai possuir: 
manitol + gema de ovo + polimixina + indicador de pH.
Indicador de pH utilizado: vermelho de fenol.
O manitol presente nesse meio de cultura é um substrato, porem é um substrato só para o gênero staphylococcus. O bacillus não utiliza o manitol.
A gema de ovo é ovo substrato, cujo o grupo que tem capacidade de utilizar é o bacillus e o staphylococcus também. 
Sempre lembrando: Essa 1ª etapa de plaqueamento de superfície é para verificar se existe o gênero bacillus, eu não vou conseguir identificar a espécie só com essa etapa.
A polimixina é um antibiótico inibidor de outros MO.
O que vai acontecer:
Semeei 0,1ml na minha placa de petri com esse meio de cultura. Vou encubar durante 48h a uma temperatura de 35-37ºC. 
Após a incubação, quando eu retirar essa placa da estufa, eu posso ter diferentes tipos de resultados:
- O vermelho de fenol em pH ácido é amarelo, faz com que o meio de cultura fique amarelo.
- Em pH neutro é vermelho. 
(O meio de cultura que nós utilizamos, assim que ele sai, que é pronto pro seu uso vai ser avermelhado, não é um vermelho forte, é mais pra rosa do que pra vermelho)
Então eu incubei a minha placa, retirei da estufa. Se o MO que estiver contaminando meu alimento utilizar o manitol, vai haver a produção de radicais ácidos, de componentes ácidos, e com isso meu meio de cultura vai adquirir uma coloração amarela. Isso significa que não é o gênero Bacillus, porque o Bacillus não é capaz de utilizar o manitol como substrato, isso é característica do staphylococcus. 
Se não houver o consumo de manitol, o meu meio vai continuar vermelho porque não vai haver a produção de componentes ácidos. Nesse caso é característica do Bacillus porque ele não tem a capacidade de utilizar o manitol, se não utiliza o manitol, não vai ter liberação dos compostos ácidos e o meu meio vai continuar vermelho-rosado.
Gema de ovo: tanto Staphylo quanto Bacillus são capazes de utilizar a gema de ovo. Então o que vai acontecer: Vou ter a hidrolise da gema de ovo que vai levar a precipitação da lecitina (a lecitina é um componente que também está no meio de cultura porém em pequenas quantidades). Ao precipitar a lecitina vai haver a formação de um halo claro ao redor da minha colônia. 
UFC: A colônia característica do gênero Bacillus: vai ser uma colônia avermelhada com o halo claro ao redor.
Para que seja Bacillus eu não posso ter a utilização do manitol e eu vou ter a utilização da gema de ovo. 
Pontos vermelhos: é uma característica porque está com um halo claro ao redor, que é por conta da hidrolise da gema de rosa.
Nesse momento sei que estou trabalhando com o gênero Bacillus. Agora, para saber se é Bacillus sereus ou não, eu preciso realizar as provas bioquímicas.
Vamos falar de Bacillus cereus que é a espécie que mais tem importância na industria de alimentos.
Para que eu caracterize a minha colônia formada anteriormente em Bacillus sereus, eu preciso que nessas 3 provas eu tenha resultado positivo.
Para começar a fazer as provas bioquímicas, eu preciso restabelecer o potencial de multiplicação do MO, ou seja, a fase LOG.
No Staphylococcus aureus, agente restabelece esse potencial através da adição de colônias ao caldo BHI.
Nesse caso não vou utilizar o caldo BHI, eu vou retirar 2 a 3 UFC características da minha placa com a alça de platina (as colônias características) e vou colocar num tubo com Agar nutriente inclinado. 
Vou encubar o Agar nutriente inclinado a 35-37ºC durante 24 a 48 horas. 
Ao retirar da estufa vou ver que cresceu na superfície do meio várias colônias. Será a partir desse crescimento que vou realizar as provas bioquímicas. 
Então coloquei na estufa o meu Agar nutriente inclinado, vou retirar da estufa e vou proceder as minhas analises bioquímicas.
Prova da gelatinase
A primeira analise a ser feita, é a prova da gelatinase (é igual a prova do staphylococcus, ver na aula de staphylococcus aureus). Para ser Bacillus é necessário que ocorra a produção da enzima gelatinase (igual de staphylo). Gelatinase +.
Prova da amilase
Objetivo dessa prova: Verificar se o MO é produtor da enzima amilase.
A amilase é capaz de degradar o amido em partículas menores, seja por hidrolise total, que vai originar a glicose, seja por hidrolise parcial que vai originar a maltose.
Então a amilase tem a capacidade de degradar o amido em partículas menores, e essa degradação é realizada através da hidrolise que pode ser total ou parcial.
Hidrólise parcial: vou ter como resultado a maltose
Hidrólise total: vou ter como resultado a produção glicose
Vou retirar algumas colônias que cresceram no Agar nutriente inclinado e vou semear no tubo de ensaio contendo o Agar amido. Vou semear algumas colônias que retirei do Agar nutriente e vou semear num tubo de ensaio contendo Agar amido.
Vou encubar a 30ºC durante 24 horas.
Após a encubação, ao retirar da estufa o meu tubo, eu não consigo identificar se houve a produção da enzima amilase. Vou precisar gotejar algumas gotas de lugol.
Se o meu MO em questão não for produtor de amilase, o amido presente naquele meio vai estar lá, o amido estando presente, ao pingar o lugol na superfície do meu meio, eu vou verificar a formação de uma cor azul que não é o Bacillus cereus (Bacillus cereus -) posso falar que é do gênero Bacillus, mas não é a espécie Bacillus cereus.
Se tiver ocorrido a degradação do amido em maltose, no momento que eu pingar o lugol na superfície do meu meio eu vou observar uma coloração vermelho claro. Então significa que o meu MO produziu a amilase e hidrolisou parcialmente o amido presente naquele meio. Então é um Bacillus cereus positivo. 
Se houver a produção da enzima amilase com conseqüência de hidrolise total do amido vou ter como resultado a produção de glicose. Então nesse momento ao gotejar o lugol vou observar uma coloração incolor na superfície do meu meio. Também vai ser positivo para Bacillus cereus.
Então para que eu passe para a próxima prova bioquímica, eu posso ter tanto a formação da cor vermelha como incolor, porque as 2 são características da degradação do amido (pela enzima amilase)
Vou para a última prova:
Prova do VP (voges-proskauer)
Essa prova do VP tem como objetivo verificar a capacidade do Bacillus degradar a glicose produzindo acetil metil carbinol. 
Objetivo principal é verificar a capacidade do MO em degradar a glicose produzindo o acetil metil carbinol.
O Bacillus cereus é capaz de degradar a glicose e produzir essa substancia.
Pego do Agar nutriente inclinado e vou colocar num tubo de ensaio contendoo caldo VP, esse caldo VP possui como principal componente a glicose. (por isso que utilizamos ele, porque nosso objetivo é verificar a degradação da glicose, então o nosso objetivo é utilizar um meio que dê substrato para o MO).
Coloquei no caldo VP, vou encubar por 24h numa temperatura de 30ºc.
Após a incubação, também não vai ser visível a degradação ou não da glicose, o que eu faço: pingo 2 reagentes que são:
- Alfa naftol e;
- KOH. Vou pingar uma gota de cada e nesse momento vou observar se houve ou não mudança na minha cor de cultura.
A cor do caldo VP antes de ir pra estufa tem uma coloração amarela, então quando eu não tenho a utilização da glicose, o meio vai continuar da mesma cor.
Se eu retiro da estufa e meu meio continuou na mesma coloração amarela significa que o MO em questão não teve a capacidade de degradar a glicose. Nesse caso significa que não é a espécie do Bacillus cereus. Pode ser do gênero Bacillus, mas não é da espécie Bacillus cereus.
Se houver a degradação da glicose vai ocorrer a produção do acetil metil carbinol e o meio de cultura que antes era amarelo, vai passar a ser vermelho, e isso é característico de uma prova positiva. Porque o objetivo da prova é verificar a capacidade do MO de degradar a glicose.
Meio vermelho: significa que toda glicose foi degradada, então é Bacillus cereus positivo.
Depois dessa prova eu posso afirmar que estou trabalhando com o Bacillus cereus. Então a colônia vermelha de halo claro que vimos lá em cima é uma colônia de Bacillus cereus.
Para chegar a cor vermelho eu preciso pingar o alfa naftol e o hidróxido de potássio.
É uma prova fácil de ver, onde vemos facilmente a mudança de cor.