Biologia Molecular

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Faculdade de Ciências Médicas Santa Casa de São Paulo
Melina Houlis
MEDICINA MOLECULAR - P1
ESTRUTURA E REPLICAÇÃO DO DNA
01. Diferencie nucleosídeo de nucleotídeo
Nucleosídeo corresponde a uma pentose e uma base nitrogenada. A ligação entre elas é
feita covalentemente através de uma ligação N-glicosídica, com a base nitrogenada ligada
ao carbono 1 da pentose
Nucleotídeo corresponde a um fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada. No
nucleotídeo, a ligação do nucleosídeo ao fosfato é feita através e uma ligação fosfodiéster,
com o fosfato ligado ao carbono 5 da pentose
02. Quais são as 3 formas de DNA
DNA tipo A: 11 pares de nucleotídeos por volta da hélice espiralada para direita. Presente
em hidratação < 65%
DNA tipo B: 10 pares de nucleotídeos por volta da hélice espiralada para a direita. É o
principal constituinte do DNA cromossômico
DNA tipo Z: 12 pares de nucleotídeos por volta da hélice espiralada para esquerda.
Acredita-se que ele contenha sítios de ligação de carcinógenos e pode, em eucariotos, estar
ligado a metilação do DNA
03. Descreva o passo a passo da replicação do DNA em eucariotos
A replicação do DNA é um processo semiconservativo, pois embora a dupla fita de DNA
seja separada, cada fita parietal individual é conservada nas duas novas duplas hélices
formadas. O processo de replicação em eucariotos está descrito a seguir:
SEPARAÇÃO DAS DUAS FITAS COMPLEMENTARES: em eucariontes, a replicação
inicia-se em múltiplos sítios ao longo da dupla hélice de DNA
FORMAÇÃO DA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO: as fitas se separam e formam um "V"
por onde ocorre a síntese ativa de DNA. A região da forquilha move-se bidirecionalmente ao
longo da molécula de DNA enquanto ocorre a síntese formando origens de replicação
(bolhas). As enzimas que mantêm a separação das fitas e desenrolam a dupla hélice são:
- DNA helicases: quebram as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas,
forçando a separação da dupla hélice. São dependentes de ATP
- Proteínas de ligação a DNA de fita simples (SSB): mantém as fitas de DNA
separadas na origem da replicação e protegem o DNA das nucleases que clivam o
DNA de fita simples.
Quando as duas fitas de dupla hélice se separam, começam a aparecer "torções" positivas
(superenrolamentos) que interferem no desenrolamento adicional da fita. Assim:
- Topoisomerases: removem as super torções na hélice
→ Tipo I: cortam de maneira reversível uma única fita da dupla hélice.
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→ Tipo II: cortam as duas fitas da dupla hélice e depois refazem a ligação
DIREÇÃO DA REPLICAÇÃO DO DNA: as DNA polimerases somente leem as sequências
nucleotídicas parietais no sentido 3' → 5'. Uma dupla hélice de DNA é sempre antiparalela,
ou seja, uma fita vai na direção 5' → 3' e outra no sentido 3' → 5'. Isto faz com que seja
necessário que as duas novas fitas, que também são antiparalelas a seus moldes, sejam
feitas de maneiras diferentes.
- Uma das novas fitas, a que se desloca de
5' para 3' em direção a forquilha de
replicação é chamada de fita líder. Esta fita
é feita continuamente, porque a DNA
polimerase está se movendo na mesma
direção que a forquilha
- A outra nova fita, que se desloca de 5'
para 3' distanciando-se do garfo, é mais
complicada. Esta fita é feita em
fragmentos porque, conforme o garfo
avança, a DNA polimerase (que se afasta
do garfo) se separa e se religa ao DNA recentemente exposto. Esta fita é chamada
de fita tardia e os pequenos fragmentos são chamados de fragmentos de Okazaki
INICIADOR DE RNA: o DNA polimerase não consegue iniciar a síntese de DNA a partir de
apenas fita simples. É necessário que seja sintetizada uma pequena região de fita duplas
de DNA e RNA, a qual contém o grupo hidroxila livre na extremidade 3'
- Primases: RNA polimerase específica que sintetiza pequenas regiões de RNA
complementares e antiparalelos, os primers.
ALONGAMENTO DA CADEIA
- DNA polimerase III: inicia a síntese a partir do grupo OH 3' do primer. Realiza o
alongamento da cadeia de DNA. Para que esse alongamento ocorra, é necessário
ter as DNTPs, ou seja, nucleotídeos formados por uma das bases. A DNA
polimerase quebra o DNTP e o nucleotídeo é ligado ao carbono 3 da pentose.
→ Além disso, a DNA polimerase III possui atividade de exonuclease 3' → 5', ou seja, a
medida que cada nucleotídeo é adicionado à cadeia, ela faz uma checagem, para ver se
está tudo correto.
- DNA polimerase I: possui atividade polimerase 5' → 3' e exonuclease 3' → 5' e 5' →
3', que permite a ela remover hidroliticamente o iniciador de RNA (primer).
DNA LIGASE: catalisa a ligação fosfodiéster final entre o grupo 5' - fosfato da cadeia
sintetizada pela DNA polimerase III e o grupo 3' - hidroxila da cadeia produzida pela DNA
polimerase I.
04. O que são telômeros?
Telômeros são as sequências de DNA não codificantes localizados nas extremidades dos
cromossomos. Eles mantém a integridade do cromossomo, impedindo que as nucleases o
ataquem e permitindo que os sistemas de reparo atuem corretamente.
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05. Qual a função da telomerase
A telomerase é uma proteína que atua como transcriptase reversa, ou seja, capaz de gerar
DNA a partir de RNA. Ela é ativa nas células germinativas, progenitoras (células tronco) e
cancerosas e é reprimida nas células somáticas. Em suma, ela mantém o DNA telomérico
intacto, impedindo o encurtamento do cromossomo a cada divisão celular. Isso ocorre
quando o molde de RNA da telomerase pareia-se com a extremidade 3’ da fita de DNA
simples e a transcriptase reversa sintetiza DNA 5' 3'. A telomerase move-se para a
extremidade recém sintetizada até o DNA telomérico aumentar.
06. O que é microRNA? Relacione ele com a formação e proteção contra o tumor
MicroRNA são moléculas de RNA não codificadores de proteínas, que agem como
reguladores pós transcricionais da expressão gênica. A fita de microRNA se liga, por meio
de enzimas, ao RNAm, formando um sistema enzimático chamado RISC. A interferência do
RISC pode ser o de destruir o RNAm ou silenciá-lo.
Existem microRNAs protetores contra o desenvolvimento de tumores e existem microRNAs
tumorigênicos por si só:
- O microRNA pode se ligar ao oncogene e impedir a transcrição da proteína
oncogênica
- O microRNA pode silenciar genes de supressão tumoral, favorecendo o
desenvolvimento do tumor
07. Qual a implicação das fitas de DNA serem antiparalelas?
Como a enzima DNA polimerase III atua no sentido 5' → 3', o fato das fitas de DNA serem
anti-paralelas implica que elas não poderão ser replicadas simultaneamente de forma
contínua. Para contornar esse problema, é necessário a ação conjunta de um grupo de
enzimas (primases, DNA polimerases e DNA ligases) para replicar o DNA da fita sense de
como concomitante à replicação contínua da fita antisense
TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO
08. O que é RNA polimerase e quais os seus tipos
As RNA polimerases são as enzimas chave da transcrição. Elas rastreiam o DNA à procura
de sítios promotores e desenrolam um fragmento de dupla hélice para que a sequência de
bases possa ser lida.
- RNA polimerase I: sintetiza o precursor do RNAr no nucléolo
- RNA polimerase II: sintetiza os precursores dos RNAm e alguns RNAsn no
nucleoplasma
- RNA polimerase III: sintetiza os precursores do RNAt no nucleoplasma
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09. Quais as fases da transcrição?
INICIAÇÃO: a síntese de RNA começa em regiões do DNA chamadas de regiões
promotoras (sequências específicas reconhecidas pela RNA polimerase II) que direcionam
a transcrição de genes e não são transcritas. Existem 3 tipos de regiões promotoras:
- TATA-box: é a mais comum entre eucariotos, prevalente em genes rapidamente
transcritos. É um sequência curta que interage com a proteína TBP, que define o
início da transcrição na maioria dos genes dependentes de RNA polimerase II.
- Promotores iniciadores
- Ilhas CpG: repetições de di, tri ou tetra nucleotídeos
Todas asRNA polimerases têm em comum a TBP que se liga ao DNA pelo sulco menor
(praticamente todas as proteínas se ligam ao DNA pelo sulco maior), formando uma cela
curvando o DNA. O TATA box é curvado em direção ao sulco maior, o que gera uma
interação mais íntima entre o fatores de transcrição e RNA polimerase II com o DNA
ALONGAMENTO: o RNA recém sintetizado pareia-se temporariamente com a fita molde de
DNA, formando um híbrido curto de RNA-DNA. Uma vez iniciada, a transcrição segue numa
velocidade de aproximadamente 50 nucleotídeos por segundo, estando a RNA polimerase
ligada à fita molde de DNA até encontrar o sinal de término da transcrição
TÉRMINO: o final da transcrição é um processo bem controlado, no qual sequências típicas
dos transcritos de RNA indicam o local para a finalização da síntese dessa molécula
- O RNA formado é imaturo e necessita passar por um processamento para se tornar
maduro
10. O que é processamento e quais as suas fases?
O RNA formado pela transcrição é imaturo e necessita passar por um processamento para
se tornar maduro. Esse processo serve para proteger o transcrito contra a ação de algumas
enzimas, facilitar o transporte para o citoplasma e orientar o encaixe na subunidade 40s
ribosomal. Ele é dividido em três fases:
CAPEAMENTO: corresponde a uma alteração na extremidade 5'
- Ocorre a remoção do fosfato terminal e adição de GMP
- Auxilia a estabilização do RNAm e permite o início da tradução
POLIADENILAÇÃO: corresponde a uma alteração na extremidade 3'
- A sequência AAUAAA determina a clivagem do mRNA na extremidade 3'
- Ocorre a adição sequencial de 200 resíduos de AMP à extremidade 3' clivada
SPLICING: corresponde a remoção dos íntrons e a junção do éxons
- Esse processo é realizado pelo spliceossoma, o qual forma o mecanismo de lariat
(alça), que precisa de snRNA (RNA pequeno nuclear), que forma o snRNP. Múltiplos
snRNPs unem os sítios doadores e receptores de encadeamento, e realizam 2
reações de transesterificação
→ A snRNP U1 forma a ligação com GU (doador 5'); snRNP U2 se liga ao A e realiza a
primeira transesterificação
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→ Ocorre a aproximação do sítio doador 5' e receptor 3', levando a segunda esterificação
→ O íntron é removido e liberado como uma estrutura em forma de laço e é degradado.
→ O RNA maduro deixa o núcleo através do poros da membrana nuclear
obs. splicing alternativo
- Os pré RNAm de alguns genes podem sofrer diferentes corte-junções, pois há
diferentes combinações de éxons dentro do mesmo gene (isoformas).
- As isoformas podem fornecer uma variedade de possibilidades funcionais e tecido
específicas
11. Qual o papel da alça na expressão gênica
Em relação ao splicing: a alça é formada no processo de splicing/remoção dos íntrons.
Como ela está ligada diretamente ao splicing e esse processo é um fator que altera a
expressão gênica, a formação correta da alça é importante
Em relação às regiões promotoras: um determinado fator de transcrição se liga ao
elemento responsivo e provoca a transformação da heterocromatina do TATA box em
eucromatina. Então, as TBPs da RNA polimerase II se ligam à eucromativa e, por meio do
sulco menor do DNA, atraem outros fatores de transcrição, para que eles se liguem a TATA
box, formando o complexo proteico da transcrição. Esse complexo é responsável por
produzir a alça na fita de DNA que aproximará o elemento responsivo, região promotora e
sítio de início da transcrição
12. Quais as fases da tradução?
INICIAÇÃO
- Formação de um complexo pré iniciação: subunidade ribossomal menor; RNAt
iniciador carregando uma metionina; e fatores protéicos de iniciação, como eIF-2
- A subunidade 40S ribosomal reconhece a extremidade 5' Cap do RNAm e percorre o
RNAm até encontrar o códon de iniciação AUG
- Ocorre o pareamento do códon iniciador com o anticódon do RNAt no sítio P da
unidade ribossomal maior
- O próximo RNAt com outro aminoácido pareia-se com o próximo códon no sítio A
- O primeiro peptídeo é catalisado por uma proteína ribosomal
ALONGAMENTO: continua-se a leitura dos códons, no sentido 5' → 3' pelo ribossomo com
a adição dos aminoácidos na região C terminal do peptídeo que está sendo formado
- TRANSPEPTIDAÇÃO: durante a formação de cada ligação do peptídeo, o
polipeptídeo (proteína sendo formada) anexado ao RNAt no sítio P é transferido para
o grupo amino do aminoacil-RNAt no sítio A pela peptidiltransferase
- TRANSLOCAÇÃO: o ribossomo se move para o próximo códon (5' → 3') e o RNAt
vazio é ejetado e o peptidil-RNAt sai do sítio A para o sítio P
Logo que o RNA mensageiro chega ao citoplasma, o ribossomo posiciona seu sítio P
sobre o 1º códon do RNA mensageiro e um RNA transportador carrega um aminoácido
metionina até essa área P. Em seguida, um outro RNA transportador carrega o 2º
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aminoácido (referente ao 2º códon) e o posiciona no sítio A do ribossomo. Então, ocorre a
transpeptidação: o aminoácido do sítio P é transferido para o sítio A, se ligando ao
aminoácido do RNA transportador ali presente – note que o RNA transportador do 1º
aminoácido continuou no sítio P. Em seguida, ocorre a translocação: o ribossomo segue
adiante, ejetando o RNA transportador que estava em seu sítio P e colocando seu sítio P
sobre o 2º códon (logo, o sítio A fica sobre o 3º códon). Desta forma, a proteína em
montagem (e o RNA transportador do 2º códon) que estava no sítio A passam a estar no
sítio P. E o ciclo recomeça, com a adição de novos aminoácidos a proteína em
montagem.
TERMINAÇÃO: ocorre quando há um stop códon (não é reconhecido por nenhum RNAt,
mas sim por fatores liberadores de proteínas eRF). O fator R se liga ao sítio A e libera a
cadeia de polipeptídeo. O ribossomo, agora inativo, libera o RNAm e dissocia suas
subunidades
13. Após a tradução, as proteínas podem sofrer modificações pós-traducionais.
Explique o que são e dê exemplos
As modificações pós traducionais modulam a interação molecular, estabilidade e localização
da proteína, mas também podem levam a proteínas alterados e desenvolvimento de
doenças neoplásicas, metabólicas e neurológicas
- Hidroxilação
- Metilação
- Fosforilação
- Adição de carboidratos: as proteínas secretadas das células ou enviadas para
lisossomos são glicadas
- Adição de lipídios: ocorrem em proteínas que participam da transdução de sinais.
- Clivagem pós tradução: clivagens internas tornam o produto maduro menos. Às
vezes a metionina é clivada do produto primário, logo nem todas as proteínas têm
metioninas.
- Acetilação: a grelina só é ativa quando é acetiladas pela ligação do ácido octanóico
à serina na posição 3
- Ubiquitinação: a ubiquitina é um polipeptídeo feito por 76 aminoácidos. Sua principal
função é sinalizar proteínas a serem degradadas com uso de ATP na via proteolítica
da ubiquitina proteassoma.
- Sumoilação: pode alterar a atividade de fatores de transcrição. O SUMO é um
polipeptídeo de 97 aminoácidos que liga-se de maneira covalente aos resíduos de
lisina da proteína. Pode alterar sua estabilidade, atividade e localização de fatores
de transcrição
EXPRESSÕES GÊNICAS
14. O que são Housekeeping Genes (HKGs)?
São genes constitutivos que regulam funções celulares básicas e sua transcrição é
constante.
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- B-actina: codifica elementos do citoesqueleto
- GAPDH: via glicolítica
- HPRT1: recuperação metabólica dos nucleotídeos
15. O que são genes reguladores?
São genes que possuem uma expressão gênica específica em cada tipo celular e sua
transcrição é variável
- Hipófise: GH
- Medula: adrenalina
16. O que é elemento responsivo?
O elemento responsivo da especificidade ao gene que será transcrito, ou seja, são
sequências cis atuantes nas quais fatores de transcrição específicos podem se ligar
- A proteína presente no citoplasma se liga ao elemento responsivo e com isso exerce
seu papel ativador ou inibidor da transcrição do gene
17. Oque é fator de transcrição?
O fator de transcrição é uma proteína nuclear que dá condição para a RNA-polimerase
iniciar a transcrição, pois o DNA em heterocromatina impede a ligação dos fatores de
transcrição e impede a transcrição. Existem fatores tras atuantes e cis atuantes, que fazem
o controle transcricional da expressão gênica
18. O que são fatores tras-atuantes e fatores cis-atuantes?
TRANS-ATUANTES: fatores regulatórios codificados por genes. Eles reconhecem
sequências específicas na região de controle do gene, como os motivos de ligação. Tornam
possível a ação da RNA polimerase
CIS-ATUANTES: sequências regulatórias nas quais podem se ligam os fatores trans. Ou
seja, são sequências do DNA, como promotores, enhancers, silenciadores, elementos
responsivos nos quais os trans-atuantes se ligam
- TATA BOX: na região de timina adenosina, a cerca de 25 nucleotídeos a montante
do sítio de início da transcrição. É na TATA box onde se ligam os fatores gerais de
transcrição
- CCAAT box: cerca de 40 a 100 nucleotídeos a montante do sítio de início da
transcrição
→ Algum fator trans-atuante se liga num cis-atuante e permite a ligação da RNA-polimerase
para iniciar a transcrição
19. O que são motivos de ligação?
Os motivos de ligação são motivos estruturais que permitem a ligação (reconhecimento)
específico dos fatores de transcrição aos seus genes alvo. São sequências trans-atuantes
que se ligam aos genes alvo (cis-atuantes). Sua função é fortalecer e estabilizar essa
ligação, de modo a prolongar o efeito do fator sobre a transcrição
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- Dedos de zinco: receptores do hormônio esteróide
- Zíper de leucina (bZip): mediação de resposta nuclear a sinais na superfície celular
20. Tanto os fatores de transcrição, quanto ou motivos de ligação, apresentam
dois domínios de ligação. Quais?
Domínio de ativação de transcrição: realiza o contato
com os fatores de transcrição
Domínio de ligação ao DNA: liga os fatores de transcrição
aos seus genes alvos. Eles fortalecem a ligação do DNA ao
promover a curvatura maior
21. Qual a diferença entre uma região codificadora e uma região regulatória?
CODIFICADORA: contém a informação para o produto do gene (geralmente uma proteína)
REGULATÓRIA: contém sequências reconhecidas e ligadas por proteínas que determinam
a transcrição e influenciam a quantidade de RNA transcrito
22. O que são agentes reguladores?
Agentes reguladores são moléculas que podem se localizar e agir a grandes distâncias da
região promotora central. São de 3 tipos:
- Enhancers (estimuladores) CIS e ativadores TRANS: controlam o tempo de
transcrição basal iniciados pelos promotores centrais. Eles são em geral tecido
específico e podem localizar-se muito distantes dos genes que eles regulam
- Silencers (CIS) e repressores TRANS: os silenciadores clássicos orientam a
repressão da transcrição (são reguladores negativos), podendo impedir a ação dos
ativadores. São tecido específicos, ou seja, bloqueiam a expressão em todos os
tecidos exceto o desejado
- Insulators (isoladores): localizam-se entre o estimulador ou silenciador e a região
promotora central, bloqueando a propagação da influência desses fatores. Atuam
como isoladores
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23. Como ocorre a regulação da transcrição gênica em resposta a um estímulo
externo?
Ocorre normalmente por sinalização endócrina causada pela liberação de hormônios devido
ao estímulo externo.
24. O que é transcrição alternativa?
A transcrição clássica consiste em 1 gene produzir 1 unidade de transcrição e esta, 1
proteína. Na transcrição alternativa podem se formar diferentes isoformas proteicas. Isso
ocorre pela presença de promotores alternativos e pelo splicing alternativo
- Promotores alternativos: são promotores que possuem expressão específica para
cada tipo celular. A utilização alternativa de promotores implica na utilização
alternativa de éxons
- Splicing alternativo: os pré-RNAm de alguns genes podem sofrer diferentes
corte-junções, pois há diferentes combinações de éxons dentro do mesmo gene,
formando isoformas. As isoformas podem fornecer uma variedade de possibilidades
funcionais
25. O que é metilação? Explique como a hipo e hipermetilação podem favorecer
ou proteger de um tumor
A metilação do DNA é o principal mecanismo de inativação gênica em humanos. Ela ocorre
no radical citosina
- Ocorre em ilhas CpG, regiões reguladores e são tecido específicas
A hipermetilação das ilhas CpG na região promotora de um gene tumoral impossibilita sua
transcrição; a hipometilação não inibe os fatores de transcrição, fazendo com que as
regiões sejam transcritas, favorecendo o tumor
26. O que é imprinting genômico?
É um mecanismo epigenético de regulação da expressão gênica no qual um dos alelos é
metilado, permitindo a expressão de apenas um dos alelos parentais
→ Cromossomo 11, braço curto, região 15
- H19 expresso no alelo materno. A expressão do H19 nesse alelo inibe a expressão
do IGF2
- No alelo paterno, existe a metilação da citosina, inibindo a expressão do H19, porém
possibilitando a do IGF2
27. Uma das possíveis modificações pós transcricionais do RNA envolve os
microRNAs. O que são e quais as suas duas possíveis vias de biogênese?
O microRNA é um RNA pequeno, não codificante, que regula a expressão gênica por meio
do silenciamento de genes alvo. Tem o formato de grando de cabelo (Hairpin) na sua fase
primária: alças terminais e fitas antiparalelas. Existem duas vias para explicar sua
biogênese:
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- Via clássica / canônica: o gene do microRNA é transcrito pela ação da RNA
polimerase II como um microRNA primário com forma de hairpin. Ainda no núcleo,
algumas endonucleases fragmentam esse microRNA sobrando apenas o hairpin,
para que ele seja exportado para fora do núcleo por um transporte ativo mediado
pela exportina 5 (exp 5). No citoplasma, o pré-microRNA sofre ação do complexo
enzimático Dicer que quebra a alça terminal e transforma o miRNA de hairpin para
duplex. O RISC/Ago deixa apenas a fita principal, virando um microRNA pequeno
fita simples
- Via Mirton: O hairpin está presente no íntron. Ao fazer o splicing de determinado
íntron que contém esse hairpin, obtém-se o microRNA
28. Como ocorre o mecanismo de modulação do microRNA?
O mecanismo de modulação do microRNA ocorre através do complexo RISC, que contém
várias proteínas como a AGO que permite a retirada da fita que não interessa, deixando o
microRNA como fita simples. Esse microRNA imediatamente facilitado pelo complexo RISC
se liga ao RNAm. Dependendo da complementariedade do microRNA com o RNAm, pode
ocorrer:
- Mais compatível: inibe a tradução. Acumula microRNA ancorado na fita de RNAm,
neutralizando esse RNAm que não consegue traduzir a proteína
- Menos compatível: induz a degradação. Pareia o microRNA com RNAm de
maneira a ativar a degradação do RNAm, que fica instável (RNA decay)
→ A rapidez da modulação da expressão gênica pelos microRNAs é explicada pois há
P-bodies, que degradam e armazenam microRNA. É possível pegar esse microRNA e
jogá-lo no citoplasma para ser usado rapidamente
VARIANTES PATOGÊNICAS
29. Diferencie mutação de polimorfismo
→ Alterações que aconteceram em regiões importantes do genoma do indivíduo que podem
acarretar problemas para gerações daquele indivíduo: mutação
→ Alterações que ainda estão na maioria da população não causam "mal" a essa
população, visto que está em grande parte das pessoas: polimorfismo
30. As doenças genéticas podem ser divididas em quatro categorias. Explique
cada uma delas
MONOGÊNICAS: alteração em um único gene. Leva a produção de uma proteína diferente.
Possui padrão de transmissão dominante, recessivo ou ligado ao X
- Anemia falciforme: troca de uma timina por uma adenina
POLIGÊNICAS E MULTIFATORIAIS: alteração em vários genes e vários fatores (no caso
das multifatoriais)
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- Diabetes Mellitus 2: o indivíduo precisa ter a mutação em diversos genes, como
1q21-1q23, 2q, 10q, 11p15.1, 12q e associado a fatores ambientais como
obesidade, dieta e atividade física inadequadas
CROMOSSÔMICAS: alterações nos cromossomos, como número ou forma/ estruturas.
Perda ou ganho de cromossomos, quebra e reorganização da cromátide
MITOCONDRIAIS: alterações na mitocôndria
31. Como são classificadas as mutações gênicas?
→ Deleções: perda de nucleotídeos
→ Inserções: ganho de nucleotídeos
→ Substituições: altera o nucleotídeo de determinadas posição (não muda o número)
- Missense: troca de um nucleotídeo por outro que dera um aminoácido diferentes.
Isso pode alterar o dobramento proteico e sua função
- Nonsense: troca de um nucleotídeo por outro na qual a trinca trocada passa a ser
um stop códon, gerando uma parada prematura da proteína
- Silenciosa: troca de um nucleotídeo por outro que não altera o aminoácido
codificado.
As mutações gênicas em íntron não costumam acarretar prejuízo funcional, exceto em
regiões reguladoras da transcrição ou do processamento do pré RNA
EXEMPLO DE DELEÇÃO: fibrose cística
- Deleção de 3 nucleotídeos CTT que altera proteína de canal responsável pela
secreção do íon cloro. Isso afeta o pâncreas, glândulas sudoríparas, sistema
respiratório, digestório e o trato reprodutivo
EXEMPLO DE MUTAÇÃO NONSENSE: neurofibromatose tipo I
- Mutação no gene NF1 - 17q11. Troca de citosina por timina, gerando um stop códon
e uma proteína truncada
EXEMPLO DE MUTAÇÃO MISSENSE: anemia falciforme
- Troca de adenina por timina que muda o gene beta globina no cromossomo 9
32. O que são mutações em regiões de microssatélites?
Microssatélites são unidades de repetição de pares de base de DNA. Como nessas regiões
há mais repetições, é mais provável que a DNA polimerase se perca e realize
deslocamentos inadequados. Caso ela deslize para trás, irá incorporar uma trinca de bases,
resultando na inserção de um aminoácido na proteína final. Caso ela deslize para frente, irá
"pular" uma trinca, resultando na deleção de um aminoácido na proteína final
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MECANISMOS MOLECULARES DA TUMORIGÊNESE
33. Quais são as propriedades das células neoplásicas In Vitro?
→ Resistência a apoptose
→ Perda do controle do ciclo celular (dos checkpoints)
→ Baixa necessidade de fatores de replicação, para crescimento celular
→ Imortalidade celular
→ Insensibilidade à inibição por contato
→ Alterações na adesividade, ancoragem, matriz extracelular
→ Alterações na membrana celular: vinculados à receptores de membrana
→ Maior capacidade de captação de substrato
34. Quais são as propriedades das células neoplásicas In Vivo?
→ Disfunção de genes de supressão tumoral
→ Padrão anômalo de metilação do DNA
→ Falha de imprinting (dosagem de expressão gênica fica bastante alterada)
→ Alta expressão de oncogenes
→ Alta expressão de fatores de crescimento
→ Expressão de onco antígenos fetais e placentários: proteínas de vida embrionária
importantes para o crescimento fetal rápido estão sendo expressas, sendo que deviam estar
silenciadas
→ Escapes da resposta imune
→ Expressão anômala de microRNAs
35. Explique os aspectos relacionados a tumorigênese
HIPERATIVAÇÃO (proliferação excessiva)
Proto-oncogenes: sequências de origem viral incorporadas pelo DNA humano, que
podem ser modificadas de maneira a serem expressas de forma excessiva nas células.
Para serem ativadas e viraram oncogenes, eles ativam proteínas de membranas,
plasmáticas ou nucleares, as quais regulam a taxa de proliferação celular
Fatores de crescimento: alteram a proliferação celular
- Fosforilação de cadeias, aproximando complexos proteicos que ativam
fosforilações, regulando a proliferação celular e, ao mesmo tempo, ativando BCL2,
um fator inibidor de apoptose (Pl3 regulam a proliferação, crescimento celular e
ativam a BCL2)
→ Via AKT-mTOR: importante na regulação energética e proteica
→ Via RAS-RAF-MAPK (via kinases para aumentar a proliferação celular). Essa via pode
ser ativada por:
- Translocação cromossômica: a porção da tirosina quinase fica hiperativada
- Hiperexpressão da proteína quinase
- Mutações: dimerização do receptor, não possibilitando a separação do receptor,
fazendo com que a parte intracelular fique ativada o tempo todo
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Genes quiméricos: pareamento anômalo de cromossomos diferentes. Ocorre a
formação de genes quiméricos e, consequentemente, de uma proteína quimérica que faz
uma ativação constante do complexo tirosina-quinase
Rearranjo genético: o gene RET é um gene importante na proliferação celular. A sua
região reguladora é fraca e de ativação lenta. Quando ocorre a inversão, o gene RET é
colocado junto de um promotor forte, e passa a ser hiperexpresso
FALHA NA SENESCÊNCIA (proliferação excessiva)
Uma célula normal possui um número máximo de divisões celular crítico. Quando ela
chega nesse número, ela para de se multiplicar (senescência replicativa) e, a partir daí,
o número de células fica fixo. Um fato de imortalização (DV40 LT/HPV E6E7) faz com que
a célula fique imortal e passe a se proliferar continuadamente
- Quando se imortaliza as células com a expressão de genes virais, esse genes
podem induzir a telomerase, que faz com que o telômero seja ressintetizado,
impedindo que a célula chegue no ponto crítico de replicação
COMPLEXOS ENZIMÁTICOS (reparo inadequado)
Reparo inadequado (importante para que mutações derivadas de agressão genotóxicas
sejam impedidas) → complexos enzimáticos
A agressão genotóxica promove uma parada do ciclo celular nos checkpoints e a ativação
do sistema de reparo
- P53: regulação de G1 para S
→ Identificação e reparto da mutação realizado por um complexo enzimático
TOLERÂNCIA (reparo inadequado)
A partir de um dano no DNA, é esperado que ocorra o reparo desse DNA, permitindo uma
estabilidade cromossômica que mantém o ciclo celular normal. Se o dano acontece e o
reparo é incompleto:
- Dano ainda muito grave: ou a célula morre, ou existe risco neoplásico
- Correções parciais: geram variantes mais simples, que não levam a uma
disfunção grave na célula. Esse pool de variações que fornece a variação genética
entre os indivíduos.
O mecanismo que cria uma variabilidade discreta (tolerável) é o de tolerância
APOPTOSE INSUFICIENTE
Mutações em gene supressores: o gene de supressão tumoral é responsável pela
apoptose. Caso exista uma mutação inativadora desse gene, o desenvolvimento de
tumores é favorecido.
- Destaque para o gene APC, BRCA 12, TP53: às vezes age como um mecanismo
amplificador da tumorigênese
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36. No que consta a hipótese de Knudson (two hits)?
O gene de supressão tumoral necessita de pelo menos uma cópia ativa de um dos alelos
para que ele tenha a função normal. Caso ocorra a segunda mutação nesse alelo normal,
ocorre a perda das duas cópias e portanto ele não tem a proteína de supressão tumoral,
levando ao desenvolvimento do tumor.
→ A primeira mutação, em geral, é herdada pela célula germinativa. A mutação somática
em outra célula faz com que ocorra a perda do mecanismo de defesa
- Primeiro HIT: herança germinativa de uma mutação em gene de supressão tumoral
- Segundo HIT: perda do segundo alelo (perda cromossômica; recombinação
meiótica; mutação do segundo alelo; hipermetilação do segundo alelo)
37. No que diz respeito a proteína BCL, explique sua relação com a apoptose
celular
A proteína BCL2, quando hiperexpressa, inibe a apoptose celular. Sua alteração quantitativa
é comum em tumores.
- O dímero BCL2-BAX faz com que a mortalidade da célula esteja equilibrada, O
acúmulo de BCL2 inibe a apoptose; o acúmulo de BAX leva a morte celular
TERAPIA GÊNICA
38. No que consiste as terapias avançadas?
As terapias avançadas consistem de produtos biológicos obtidos a partir de células e
tecidos humanos queforam submetidos a um processo de fabricação, além de produtos de
terapia gênica, que regulam ou alteram uma sequência genética com o objetivo de tratar ou
prevenir uma doença
39. Quais os tipos de vetores possíveis para se expressar um gene
artificialmente?
Virais integrativos: Lenti; retro
Virais não integrativos: AAV; Adeno; HSV-1
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Não virais integrativos
Não virais não integrativos: CRIPS/CAS; plasmídeos
40. Em relação ao vetor não viral PLASMÍDEO, cite suas características
→ Para ser um vetor, deve necessariamente conter um promotor, um sítio de restrição de
enzimas (para que possa clonar o gene de interesse), uma cauda POLI-A e uma origem
de replicação (para se duplicar dentro de bactérias)
→ A expressão do gene vai ter no máximo 10 dias
→ Não é integrativo, ou seja, não é integrado no genoma do paciente
→ Pode ser injetado por:
- Eletrocoração: plasmídeo injetado por meio de um choque
- Injeção hemodinâmica: injeta-se na veia da cauda do animal e a injeção deve ser
rápida e com grande volume
- Transfecção: plasmídeo é carregado por um lipídio
- Nucleofector: um choque na célula faz com que o plasmídeo vá diretamente para
o núcleo
41. O que é plasmídeo de expressão permanente?
→ Se integram ao genoma do paciente
→ Mais específico que os vetores virais
→ Exemplos: PHIC31, transposons, etc.
42. Em relação ao vetor viral RETROVÍRUS, cite suas características
→ Vetor de RNA de fita simples
→ Possuem a transcriptase reversa: o DNA é integrado no genoma das células
→ Integração randômica: pode acabar por integram o gene em outro já existente, ou pode
integrar próximo a um proto-oncogene
→ Comporta genes de até 6 kb
→ Infecta células em replicação
→ Os vetores a base de retrovírus expressam tudo que está entre as sequências LTR (o
LTR a esquerda serve como promotor e o LTR a direita serve como uma sequência de
poliadenilação)
→ Substituem os genes GAG POL ENV pelos genes de interesse
43. Em relação ao vetor viral LENTIVÍRUS, cite suas características
→ Comporta genes de até 9 kb
→ São capazes de se integram no genoma de células quiescentes (células que não estão
em fase de divisão mas possuem metabolismo ativo)
44. Em relação ao vetor viral ADENOVÍRUS, cite suas características
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→ Vetor não envelopado
→ Vetor de DNA com alta taxa de infecção
→ Resposta imune: embora possua uma alta taxa de infeção, é reconhecido pelo sistema
imune
→ Não integrativo
→ Os vetores a base de retrovírus expressam tudo que está entre as sequências ITRs (o
ITR a esquerda serve como promotor e o ITR a direita serve como uma sequência de
poliadenilação)
45. Em relação ao vetor viral ADENO-ASSOCIADOS (AAV), cite suas
características
→ DNA simples fita
→ Não envelopado
→ Infectam células replicantes ou não
→ Episonal: sua expressão pode durar anos se for uma célula não replicante
→ Cada sorotipo do AAV funciona para um tecido específico
46. Em relação a edição gênica do sistema CRIPS/CAS, explique suas
características
CRISPR: conjunto de repetições palindrômicas regularmente espaçadas
- Estão presentes no genoma de bactérias. Lá, temos genes que codificam
proteínas CAS
GENES CAS: genes que codificam as proteínas CAS, que são helicases. As helicases
tem a propriedade desenrolar o DNA e também funcionam como nucleases, capazes de
quebrar ligações fosfodiéster (logo, quebram o DNA)
→ As bactérias possuem sequências CRISPR e nos espaços entre elas existem
sequências que contém DNA de vírus de infecções passadas. Logo, o sistema funciona
como uma memória imunológica de bactérias.
- A quebra do genoma viral era feito por proteínas CAS
→ Existem diversos tipos de CAS hoje em dia, que servem para reconhecer diferentes
sequências no genomas
→ O gene é reconhecido pela CAS
→ A proteína CAS abre a sequência genomica e corta a dupla fita de DNA
→ O corte ativa mecanismos de reparo do DNA
- NHEJ: o organismo insere ou elimina sequências
- HDR: o organismo insere a sequência correta do gene
47. Em relação ao seguinte caso clínico, explique:
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O que leva a deficiência da enzima IDUA
→ Nós possuímos, no cromossomo 4 (em seu braço curto) o gene IDUA
→ O gene IDUA codifica a proteína IDUA, responsável pela glicosilação do
glicosaminoglicanos (GAG), que participam na formação das cartilagens, matriz extracelular
e etc. Eles necessitam de uma reciclagem para serem liberados na urina
→ Um neurônio, cheio de GAGs não degradados, possui suas funções muito prejudicadas.
O acúmulo de GAGs leva ao retardo mental, deficiências cognitivas, deficiências oftálmicas
e de mobilidade, morrendo na infância
Como a terapia gênica poderia beneficiar esses pacientes? Quais vetores poderiam
ser utilizados e que tipo de terapia seria mais adequada
→ In vivo ou ex vivo?
- A terapia de reposição enzimática não funciona pois a enzima não passa a barreira
hemato encefálica. Assim, caso for fazer in vivo, o vetor deveria ser injetado
diretamente no cérebro do paciente (injeção intracerebral) → IN VIVO
- A terapia ex vivo seria utilizada em uma célula tronco da medula óssea. Ela seria
inserida no fígado (que produz muita enzima que vai para o sangue).
→ Existem fármacos que passam a barreira hematoencefálica e a enzima consegue passar
para o cérebro
→ Vetor utilizado: adeno associado
- Não causa terapia mutacional (clivagem) e é episonal (sua expressão pode durar
anos se for uma célula não replicante). Ele não causa uma resposta imunológica
muito forte pois fica "escondido" dentro do núcleo da célula
INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS LABORATORIAIS
48. Caracterize a PCR
A PCR promove a amplificação de uma sequência específica do DNA in vitro, sendo
importante para o estudo de apenas um gene ou de um éxon específico, importante
para se analisar as mutações, diagnóstico de enfermidades genéticas, genética forense e
sexagem fetal. Seu processo ocorre em três etapas:
→ Desnaturação térmica: o DNA é submetido a altas temperaturas (95º durante 1 minuto)
para que suas ligações de hidrogênio sejam rompidas, separando a dupla fita de DNA
→ Anelamento dos primers: os primers ligam-se nas extremidades da sequência a ser
estudada (50-65º durante 1 minuto)
→ Extensão: por fim, ocorre a extensão da fita, a partir do primers, por meio da inserção de
nucleotídeos em solução (DNTPs), criando-se uma cadeia dupla a partir de cada uma das
cadeias simples. Essa inserção de nucleotídeos é feita pela enzima TAQ polimerase, que é
um enzima termo resistente que consegue realizar a replicação do DNA in vitro (72º durante
um minuto)
- São necessários tampões e MgCL2 para garantir estabilidade da reação
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49. Caracterize a PCR RFLP
A PCR RFLP consegue verificar a ocorrência de mutações ou polimorfismos que
modificam apenas os sítios de restrição na região do DNA amplificado pelo PCR. Seu
processo ocorre em três etapas:
→ A primeira é de PCR normal, no qual se amplifica a região de interesse
→ Digestão enzimática: se aplica uma enzima de restrição que cliva o fragmento
amplificado e este produto amplificado será submetido à digestão enzimática
→ Eletroforese: o padrão de fragmentação formados a partir desta ação enzimática pode
ser visualizada no gel
50. Caracterize a PCR ARMS
A PCR ARMS é uma PCR alelo específica que permite genotipar qualquer mutação
conhecida, não necessariamente localizadas em sítios de restrição. Somente o DNA
mutado será amplificado
→ Baseia-se na construção de primers normais e outro com uma alteração na região 3'. A
região do DNA de interesse será amplificado por PCR utilizando esses primers específicos.
51. Caracterize a eletroforese
A eletroforese tem a função de separar macromoléculas de diferentes tamanhos, carga
ou conformação. Quando as moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para
o polo positivo ou negativo
- Proteínas: possuemcarga negativa ou positiva
- DNA: possui carga negativa (fosfato)
→ O DNA é negativamente carregado e é atraído pelo eletrodo positivo através de uma
corrente elétrica. Fragmentos de maior tamanho migram de maneira mais lenta e os de
menor tamanho de maneira mais rápida.
→ A eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel. O gel é submerso em um tampão que
possui íons para a corrente passar e também para manter o pH constante. O gel é um
composto de agarose.
52. Caracterize a MLPA
O MLPA é um método que detecta alterações de material cromossômico e detecta
deleções e duplicações nos genes. Ele NÃO detecta mutações de ponto (troca de
base)
→ São usadas duas sondas adjacentes que apenas quando unidas promovem a
amplificação do genoma e fluorescência. Serão formados STUFFER SEQUENCES de
tamanhos diferentes. A ordem dos picos gerados representa a ordem do tamanho dos
Stuffers de cada gene (definida pela empresa que irá fazer o MLPA), e enfim é analisado a
presença de picos, sendo que:
- Sem pico = sem gene
- Pico alto = gene em carga dobrada (homozigoto)
- Pico médio = tem o gene em carga reduzida (heterozigoto)
- Pico mais alto que o normal = pode indicar duplicação do gene
→ Desnaturação do DNA para ligação das duas sondas adjacentes: 98º em 5 minutos e 25º
na pausa
→ Hibridação das sondas adjacentes à região de afinidade no gene de interesse: 95º em 1
minuto e 60º na pausa
→ Ligação entre as sondas: 54º na pausa e em 15 minutos, 98º em 5 minutos e 20 na
pausa
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→ Amplificação e captação da fluorescência
53. Caracterize o sequenciamento (método de Sanger)
O sequenciamento é usado para determinar em que ordem as bases nitrogenadas estão
- O sequenciamento é realizado com produtos de PCR de regiões de interesse já
amplificadas. Os produtos são purificados para a remoção dos nucleotídeos não
incorporados e demais reagentes. Os nucleotídeos são marcados com 4
fluorocromos diferentes e são submetidos a um sequenciador automático, cujo
princípio é a eletroforese. Cada fragmento emite luz em diferente comprimento de
onda que são transmitidos ao computador para formar o eletroferograma
54. Caracterize a ABI 310
A ABI 310 serve para realizar genotipagem, sequenciamento e MLPA. Para isso,
utiliza-se um DNA molde, primer, big dryes terminator, dNTPs, ddNTP e enzimas. Cada
ddNTP está acoplado a um fluoróforo distinto e assim, irão se formar diversas fitas com
ddNTPs em diferentes lugares e isso será colocado no PCR.
55. O que é genotipagem?
A genotipagem determina diferenças na composição genética de um indivíduo, examinando
a sequência e DNA através de ensaios biológicos e comparando-a com a sequência de
outro indivíduo ou uma sequência de referência.
56. Caracterize o qPCR
O qPCR quantifica a região de interesse em "tempo real". Ele tem o objetivo de
quantificação de amostras com pouco material, a partir da captura de emissões de
sondas fluorescentes (importante para gene constitutivos (genes constitutivos possuem
promotores e outras sequências de DNA reguladoras que asseguram a expressão
constante)
- PCR + fluorescência: durante a amplificação, a quantificação é determinada pela
quantidade de produto amplificado durante cada ciclo, através da fluorescência
emitida.
SISTEMA TAQMAN: sonda TaqMan com fluoróforo, específica, é rompida durante a
extensão (72º), emitindo fluorescência
SISTEMA CYBER GREEN: quantificação de RNA através do DNA complementar
- RNAm → RNAm + transcriptase reversa → enzimas que degradam RNAm,
sobrando seu DNA complementar (sem uracila) → adição de DNA polimerase →
cadeia dupla de DNAc, que é diretamente proporcional ao RNAm
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA: quantificação de expressão gênica de um determinado gene
- Comparação entre a curva do DNAc do gene normalizador e do DNAc do gene de
interesse
- Quanto maior a quantidade de DNAc obtido, maior era a quantidade de tecido ou
células extraídos
QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA: obtenção da quantidade exata de números de moléculas
- Comparação entre a curva padrão e curva da amostra
57. Diferencia qPCR de PCR
O PCR quantifica a região de interesse e necessita de certa quantidade de DNA para dar os
dados brutos. o qPCR quantifica e qualifica a região de interesse em tempo real, sendo que
os dados de quantificação são refinados e passíveis de análise quantitativa (expressão
RNA)
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58. Caracterize cDNA
O DNA complementar é DNA sintetizado a partir de um molde de mRNA maduro (isto é,
molécula só com exons, após terem sido removidos os introns) numa reação catalisada por
duas enzimas, a Transcriptase Reversa e a polimerase do DNA
SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO (eu não assisti essa aula então não sei
muito bem sobre o que se trata, fiz tudo com base em resumo que eu encontrei)
59. O sequenciamento de primeira geração é o sequenciamento de Sanger.
Explique-o
No sequenciamento de Sanger, combinava-se em uma reação o fragmento de DNA a ser
sequenciado, o primer iniciador, a enzima DNA polimerase, grandes quantidades de dNTPs
de cada base nitrogenadas e baixas concentrações de ddNTPs. A polimerase promove o
alongamento da fita complementar até a entrada de um ddNTPs, que consequentemente
vai parar a reação.
- Fragmentos gerados de diferentes tamanhos são separados por eletroforese capilar
e estimulados por um laser com a detecção de cada base terminadora.
→ Este método é útil e eficaz no sequenciamento de fragmentos de DNA de 500-900 pares
de bases. Por isso, o sequenciamento de Sanger é bastante utilizado para sequenciar
organismos que possuem sequências curtas de DNA como plasmídeos bacterianos, ou
também fragmentos de DNA amplificados por PCR
- Fragmentos gerados de diferentes tamanhos são separados por eletroforese capilar
e estimulados por um laser com a detecção de cada base terminadora
- O menor fragmento avança mais, gerando uma sequência de picos de luz distintos,
o que possibilita remontar a sequência de bases (comparação entre o DNA de
indivíduos distintos)
- Utiliza-se o primer sense OU o primer antisense, e não os dois juntos
obs. A diferença entre um nucleotídeo normal (dNTP) e um dideoxinucleotideo (ddNTP) é
a ausência do grupamento hidroxila no ddNTP que faz com que o próximo dNTP não tenha
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onde se ligar e isso faz com que a replicação pare
60. Diferencie cariótipo, microarranjo e sequenciamento de exoma
CARIÓTIPO: estudo cromossômico microscópico de baixa resolução e fácil acesso
→ Estudo citogenético em que se analisa os cromossomos de uma maneira mais macro; é
possível identificar conteúdos inteiros de cromossomos a mais, como trissomias (síndrome
de down);
- RESOLUÇÃO: 5 - 10 milhões pb
- ESTUDO DA SEQ. MOLECULAR: não
- DELEÇÕES E DUPLICAÇÕES: talvez*
- TRANSLOCAÇÕES EQUILIBRADAS: talvez*
MICROARRANJO: suspeita de alteração específica ou inespecífica, submicroscópica ou
microscópica dos cromossomos
→ RESOLUÇÃO: 50 - 100 mil pb
→ ESTUDO DA SEQ. MOLECULAR: não
→ DELEÇÕES E DUPLICAÇÕES: sim
→ TRANSLOCAÇÕES EQUILIBRADAS: não
- Confirma achados do cariótipo e obscuro ao cariótipo
- Estudo de infertilidade
- Delimitação detalhada de uma alteração genômica
- Regiões com perda de heterozigose e isodissomia uniparental (duas cópias do
mesmo gene de origem de um único promotor)
SEQUENCIAMENTO DE EXOMA: conhecimento da sequência de bases de um gene,
fornecendo importantes informações sobre suas estrutura, função e relação evolutiva com
outros genes (de um mesmo organismos ou de organismo diferentes)
- RESOLUÇÃO: 1 pb
- ESTUDO DA SEQ. MOLECULAR: sim
- DELEÇÕES E DUPLICAÇÕES: sim*
- TRANSLOCAÇÕES EQUILIBRADAS: talvez*
61. O sequenciamento de segunda geração é o sequenciamento NGS. Explique-o
O sequenciamento NGS é um sequenciamento massivo em paralelo e de alto rendimento.
- Oferece resolução em nível base (nucleotídeos únicos), tornando possível detectar
genes associados a condições clínicas, transcritosalternativos, variantes alélicas e
polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs)
- Utiliza quantidade menor de DNA/RNA para processamento (nanogramas já são
suficientes)
ETAPAS
1. Extração do DNA ou RNA → fragmentação e amplificação por PCR
2. Preparo da biblioteca (fragmentação randômica)
- Ligação de adaptadores nas pontas dos fragmentos de DNA
- Desnaturação formando fragmentos de fita simples (sequenciamento por síntese de
DNA)
- Filamento de DNA liga-se ao oligo primer e adaptador pareia
- Clusters: reção multiplexadas de PCR
3. Sequenciamento da biblioteca
- dNTPs adicionados contém fluoróforo que emite onda de luz possível de ser
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detectada, porém após isso perde seu efeito terminador, sendo possível a adição de
novos nucleotídeos
4. Análise dos dados (bioinformática)
ILLUMINA
- Grandes números de fragmentos curtos de DNA são sequenciados de uma vez
- Amostra de DNA é quebrada em pequenos fragmentos de mesmo tamanho
- Fragmentos são ligados a adaptadores, que permitem o anelamento com primers
previamente fixos
→ A plataforma Illumina utiliza o método de sequenciamento por síntese. O processo
identifica simultaneamente os nucleotídeos enquanto os incorpora em uma cadeia de
ácido nucléico. Basicamente, nucleotídeos modificados quimicamente se ligam à fita
molde de DNA por complementaridade. Estes nucleotídeos possuem uma etiqueta
fluorescente e um terminador reversível que bloqueia a incorporação de uma próxima
base. O sinal fluorescente indica qual nucleotídeo foi adicionado e o terminador é clivado
para que a próxima base possa se ligar e assim completar o sequenciamento do
fragmento.
454 ROCHE
- Consegue sequenciar fragmentos maiores que os da Illumina
- Adaptadores são ligados à extremidades e os fragmentos são anelados em brads
- Fragmentos são amplificados por PCR usando primers ligados ao adaptador
- Cada bead, coberto por milhares de cópias do mesmo fragmento, é colocado em
uma região específica
- Adiciona-se nessas regiões, DNA polimerase, dNTPs e buffers para que o
processo comece
→ Esta plataforma utiliza o método de pirosequenciamento que é baseado na detecção
de pirofosfato liberado durante a incorporação de um nucleotídeo na fita de DNA
recém-sintetizada.
ION TORRENT
- Ao contrário da Illumina e Roche 454, o sequenciamento por íons de prótons não
utiliza a leitura de sinais ópticos
- Cada dNTP inserido pela DNA polimerase libera um H+, mudando o pH detectado
pelo sensor
→ A adição de nucleotídeos é detectada através da geração de um íon de hidrogênio
durante a incorporação de uma dNTP. A liberação de íons H + durante o processo muda o
pH no ambiente, formando uma alta voltagem positiva que é detectada por um dispositivo.
Este método é capaz de sequenciar reads de 200 a 600 pares de base
62. PacBio e Oxford Nanopore são conhecidos como sequenciamento de terceira
geração. Explique-os
Estas plataformas mais modernas são capazes de contornar problemas encontrados em
outros métodos de sequenciamento como erros de leitura de reads curtos (short reads) ou
até mesmo o trabalho de bancada para preparo das amostras.
PacBio
→ Utiliza uma única molécula de DNA de fita simples que é submetida a replicação por
DNA polimerase imobilizada em um micropoço
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→ Durante a replicação, são utilizados nucleotídeos marcados com fluoróforos de
diferentes cores
→ A medida que os nucleotídeos vão sendo incorporados, os fluoróforos são liberados,
causando emissão de luz em um comprimento de onda específico
→ A luz é detectada e como a adição de cada nucleotídeo resulta em uma fluorescência
diferente, é possível identificar a ordem de adição dos nucleotídeos, e portanto, obter a
sequência da molécula de DNA
→ É considerada uma metodologia de sequenciamento em tempo real de alta eficiência e
exatidão
OXFORD NANOPORE
→ Oferece o sequenciamento direto e em tempo real
→ Permite o sequenciamento de longo fragmentos
→ Não há incorporação de nucleotídeos nessa metodologia e sua praticidade permite que
sequenciamentos sejam realizados de maneira rápida em qualquer ambiente sem a
necessidade de muitos recursos
→ Nessa metodologia, uma única fita da molécula de DNA é induzida a passar por um
nanoporo presente em uma membrana lipídica. A cada base nucleotídica constituinte da
molécula que passa pelo poro, é detectada uma alteração na amperagem, que será
específica de cada base, permitindo o sequenciamento
63. Diferencie sequenciamento do genoma (WGS) de sequenciamento do exoma
(WES)
WGS
O sequenciamento do genoma completo é o sequenciamento de todo o material genético
ou DNA de um indivíduo. Esse sequenciamento irá incluir o DNA codificante e não
codificante
O WGS é mais indicado em estudos científicos visando estudar as consequências de
alterações em regiões ainda não estudadas ou a busca pelas alterações que causam
doenças ainda sem causa elucidada, por exemplo.
WES
O sequenciamento do exoma completo é o sequenciamento da porção codificante do
DNA, ou seja, de todas as sequências de DNA que codificam os aproximadamente
21.000 genes do genoma humano.
O WES é um exame laboratorial eficiente e mais indicado para o diagnóstico clínico
principalmente em casos em que existe hipótese diagnóstica de mais de uma doença
específica, ou ainda, que não se tem hipótese diagnóstica específica
INFORMÁTICA EM MEDICINA MOLECULAR (eu não assisti essa aula então não
sei muito bem sobre o que se trata, fiz tudo com base em resumo que eu encontrei)
64. No que consiste a bioinformática?
A bioinformática consiste no desenvolvimento de métodos computacionais, matemáticos e
estatísticos para organizar e analisar informações biológicas em grande escala e de
maneira integrada
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65. Quais são os critérios de avaliação das variantes genéticas?
→ Variante patogênica: impacto comprovado sobre proteínas e que, consequentemente,
afetam o fenótipo
→ Variante provavelmente patogênica
→ Variante de significado clínico indeterminado (VUS)
→ Variante provavelmente benigna
→ Variante benigna
66. O que são bancos de dados de variantes?
Bancos que armazenam informações sobre milhões de variantes de DNA que foram
identificadas em pacientes com alguma doença ou manifestação clínica, ou em pessoas
clinicamente normais no mundo todo
67. Quais são os tipos de bancos de dados?
CLINVAR
→ Administrado pelo National Institute of Health (EUA)
→ Funciona como um banco de dados públicos central para pesquisadores e
profissionais médicos depositares informações sobre variações de nucleotídeos únicos
clinicamente relevantes
Vantagens
- Público desde 2013
- Dados provenientes de múltiplas fontes (laboratórios clínicos, pesquisadores, etc)
- Razoavelmente atualizado
Desvantagens
- Poucas submissões estruturas com dados sobre os casos
- Qualidade de interpretação variável
HGMD
Vantagens
- Banco de dados de longa existência (desde 1993)
- Melhor fonte de variantes germinativas reportadas na literatura
Desvantagens
- Privado (versão completa é cara)
- Curadores inserem dados de classificação própria
- Literatura muitas vezes equivocada
- Variantes benignas não são inseridas
gnomAD e ExAC
→ Banco de indivíduos assintomáticos
Vantagens
- Público desde 2014
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- Dados de mais de 138000 exomas e genomas
- Frequência alélica confiável
- Multi-étnico
- Casos de câncer exclusivos
Desvantagens
- Dados de fenótipo não estão disponível (não dá pra saber se eram realmente
assintomáticos)
OMMIM
→ Online mendelian Inheritance in Man
- Catálogo de genes associados a doenças humanas, informações sobre genes e
fenótipos associados
- Cruza informações do PubMed e NCBI
Questões da P1, P2 e P3 de 2020 (com correção)
Em azul: correta
Em vermelho: correção
1.Na transcrição gênica, temos os agentes reguladores que podem ser estimuladores
ou silenciadores. É corretodizer que:
a. Eles fazem parte da dupla fita de DNA, podem estar muito distantes dos genes que
eles regulam e controlam o tempo de transcrição iniciado pelos promotores centrais.
b. São compostos por uma fita simples de RNA, pois apresentam a uracila em sua
composição (fita simples de RNA é o primer)
c. Eles regulam a expressão fazendo a conexão entre o promotor basal e o sítio de
controle da expressão de genes específicos. (não existe uma conexão entre a região
promotora e o sítio de controle)
d. São fatores trans atuantes, podendo ou não estar presentes em células ou tecidos
específicos (fatores cis atuantes ligam-se ao elemento responsivo e, portanto, são
específicos)
e. Eles se encontram sempre entre 25 e 35 nucleotídeos a montante do sítio de início
da transcrição. (não necessariamente; a CCAAT box, por exemplo, encontra-se a
cerca de 40 a 100 nucleotídeos a montante)
2. Sobre ciclo celular, assinale a alternativa CORRETA:
a. O objetivo dos pontos de checagem (checkpoints) é impedir o início de eventos
subsequentes, sem que o evento anterior tenha sido realizado com sucesso
b. A interfase corresponde a cerca de 5% de todo período de um ciclo celular. (cerca
de 95%)
c. Durante a mitose, na fase denominada prófase, os cromossomos começam a
descondensar e inicia a formação da membrana nuclear ao redor dos núcleos filhos.
(os cromossomos começam a condensar e ocorre o desaparecimento da membrana
nuclear; a fase descrita na alternativa é a telófase)
d. Os fatores de crescimento não possuem nenhum tipo de especificidade, justamente
por isso podem atuar sobre os mais variados tipos celulares. (possuem
especificidade)
e. As ciclinas são famílias de proteínas, seus membros permanece ativo durante todo o
ciclo celular (elas são degradadas e depois formadas de novo)
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3. Em relação ao risco de aparecimento de tumores podemos afirmar: (QUESTÃO
ABSURDAMENTE MAL ESCRITA, EU REAL NÃO SEI A RESPOSTA)
a. Reduzem o risco: variantes deletérias silenciadoras da via mTOR e variantes
deletérias ativadoras do proto-oncogene RET. (a via mTOR é uma via estimulante da
proliferação celular, logo, se ela for silenciada, o risco de tumor vai diminuir; a
ativação de um gene proc-oncogênico, em contrapartida, vai aumentar o risco de
tumor)
b. Reduzem o risco: variantes deletérias silenciadoras da Telomerase e variantes
deletérias ativadoras em genes que regulam o reparo do DNA. (a telomerase
possibilita que a célula não chegue em seu ponto crítico de multiplicação, logo,
silenciá-la reduziria o risco de tumor; variantes que ativam genes reguladores de
reparo de DNA também diminuiria o risco de tumor kkkkkrying)
c. Aumentam o risco: variantes deletérias silenciadoras do gene AKT e variantes
deletérias ativadoras do P53. (a P53 é um gene de supressão tumoral, logo, se ela
estiver ativada vai diminuir o risco de tumor)
d. Reduzem o risco: variantes deletérias silenciadoras da Bcl-2 e variantes deletérias
ativadoras do P53. (a BCL2 é um gene que inibe a apoptose. Se ela for silenciada, a
apoptose irá ocorrer então vai diminuir o risco de aparecimento de tumor mas
também não é muito legal ficar tendo morte celular)
e. Aumentam o risco: variantes deletérias silenciadoras do gene RB e variantes
deletérias ativadoras da via tirosino-quinase. (o gene RB faz parte do checkpoint em
G1. Se ele está silenciado, aumenta o risco de tumor; a hiperativação da via
tirosina-quinase aumenta a proliferação celular, sendo um risco para o aparecimento
de tumor)
4. Com relação à região TATA box, assinale a correta:
a. É o local onde ocorre a retirada dos introns (sinaliza onde ocorrerá o início da
transcrição)
b. Sinaliza a região de término da transcrição (início da transcrição)
c. É a região promotora mais frequente em eucariontes
d. É onde a DNA polimerase se liga para formar a bolha de transcrição (quem se liga é
a TBP)
e. É onde ocorre a ligação com a subunidade maior do ribossomo para iniciar a
tradução
5. No início do processo de replicação do DNA:
a. A RNA polimerase substitui os RNA primers pelos DNTPs. (RNA polimerase atua na
transcrição)
b. A topoisomerase rompe as pontes de hidrogênio e a helicase adiciona os DNTPs a
nova fita. (a topoisomerase remove as torções do DNA, enquanto a helicase quebra
as ligações de hidrogênio)
c. A topoisomerase desenrola a fita de DNA e a helicase rompe as pontes de
hidrogênio.
d. Temos a primase que recebe esse nome porque é a primeira enzima a interagir no
processo de replicação do DNA. (ela tem esse nome pois sintetiza pequenas regiões
de RNA complementares e anti paralelos, os primers)
e. Os SSBs catalisam uma ligação fosfodiéster unindo os fragmentos de Okasaki. (os
SSBs mantém as fitas de DNA separadas e protegem o DNA das nucleases; quem
une os fragmentos de Okazaki é a DNA ligase)
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6. As modificações que ocorrem após a tradução são importantes para o
funcionamento adequado da proteína recém sintetizada. Assinale a correta
a. Algumas proteínas, como a grelina, podem sofrer o processo de acetilação no
citoplasma, inibindo seu transporte celular e sua função (a acetilação é um processo
importante para a ativação e não inibição)
b. A proteína recém formada pode sofrer clivagens e, ocasionalmente, a metionina
pode ser clivada do produto primário, como ocorre, por exemplo na síntese da beta-
globina
c. A maioria das proteínas recebe uma adição de carboidrato nas suas cadeias
laterais, logo após o término da tradução, o que permite que elas possam adquirir
sua estrutura terciária (a estrutura terciária é resultado das interações entre os
grupos R dos aminoácidos que compõem a proteína)
d. A ubiquitina é uma enzima que é responsável por realizar a clivagem de proteínas
grandes, formando produtos menores, para que possam ser encaminhadas do
citoplasma para a membrana celular (a principal função da ubiquitina é sinalizar
proteínas a serem degradadas com uso de ATP na via proteolítica da ubiquitina
proteassoma)
e. A SUMO é enzima que se liga às proteínas recém sintetizadas para modificar a sua
estrutura terciária, aumentando sua degradação pelo proteassoma (quem marca a
degradação é a ubiquitina)
7. Sobre mutações escolha a alternativa correta:
a. A diabetes mellitus do tipo 2 (resistente a insulina) é considerada uma doença
monogênica, pois é causada por alteração em um único gene (doença poligênica)
b. Polimorfismo é um tipo de mutação presente em uma sequência específica do
genoma, responsável por gerar um alelo que ocorre com frequência igual ou
superior a 1% em determinada população. O polimorfismo diferencia-se dos demais
tipos de mutação por não apresentar um caráter prejudicial ao indivíduo que o porta.
c. Doenças monogênicas são consequência de várias alterações gênicas combinadas
que também sofrem a influência do meio ambiente. (monogênicas é alteração em
um único gene; multifatoriais é alteração em vários genes e vários fatores)
d. Podemos definir mutações como as alterações no código genético que sempre
apresentam um efeito deletério (não necessariamente deletério)
e. As mutações têm como única causa a exposição a agentes mutagênicos (não)
8. Sobre as vias da apoptose, é correto afirmar que:
a. Embora a p53 tenha um papel na apoptose, ele não é um gene de muito importância
para a proteção do genoma. (a p53 é um gene de supressão tumoral e é importante
no controle do ciclo celular, reparo do DNA e indução da apoptose)
b. A via intrínseca é ativada exclusivamente pela ligação de ligantes específicos a
receptores presentes na superfície celular, que geralmente recebem o nome de
receptores de morte celular.
c. O citocromo C é um importante inibidor da apoptose (ativador da apoptose)
d. Apesar de todo o conhecimento sobre as vias da apoptose, a tentativa de utilização
desse conhecimento em protocolos de terapia gênica para o câncer não foram
promissores. (foram promissoras)
e. As principais vias de ativaçãoda apoptose são as extrínseca e a intrínseca, porém
podemos também considerar a via perforina/granzima.
9. Na replicação do DNA, conforme a bolha de replicação aumenta:
a. A primase incorpora os chamados fragmentos de Okazaki que geram os sítios 3’ OH
livre permitindo a ação da Polimerase tipo III somente na fita sense. (fita anti sense;
os fragmentos de Okazaki não geram sítios 3' OH livre, quem gera são as primases)
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b. A Polimerase tipo III só consegue incorporar novos nucleotídeos graças a ação dos
fragmentos de Okazaki que geram os sítios 3’ OH livre em ambas as fitas. (somente
na fita anti sense)
c. Ocorre a síntese dos Fragmentos de Okazaki que são gerados a partir dos primers
em sua extremidade 5’ OH livre que se encontra na direção oposta à forquilha de
replicação. (3' OH livre)
d. Ocorre a síntese dos Fragmentos de Okazaki em uma das fitas, sendo gerados a
partir dos primers em sua extremidade 3’ OH livre que se encontra na direção oposta
à forquilha de replicação.
e. Ocorre a síntese das novas fitas de DNA a partir da adição de um único primer na
fita sense e um único primer na fita antisense. (vários primes na anti sense e
somente um na sense)
10. Com relação a apoptose, assinale a alternativa correta:
a. A apoptose acontece somente com o objetivo de formação de órgãos (mano q?)
b. Durante a apoptose a célula incha o que leva a perda da integridade …., como
consequência disso ocorre a lise o que causa um processo inflamatório (necrose)
c. A apoptose é um processo geneticamente estabelecido, através do estímulo
específico, ativa mecanismos que levarão à sua morte.
d. Durante a apoptose o DNA é fragmentado de forma randômica, que forma um
padrão de rastro não sendo possível mensurar o tamanho (não é de forma
randômica)
e. Nada parecido com a série de eventos bioquímicos que culminam …
11. No processamento após a transcrição, é correto afirmar que:
a. A sequência CCA identifica onde a guaniltransferase deve acionar a guanina.. 5’
(??? pelo que eu pesquisei o terminar CCA é a terminação do tRNA, mas não
entendi nada)
b. A cauda poliA é adicionada logo no início da formação do RNAm (é adicionada só no
final)
c. O capeamento da terminação 5’ ocorre com uma guanina modificada, formando uma
ligação 5’-5’ especial
d. Splicing alternativo ocorre quando há ausência de capeamento da extremidade
e. A poliadenilação tem como principal objetivo permitir o reconhecimento do
ribossomo e iniciar a tradução (a poliadenilação corresponde a uma alteração na
extremidade 3', com o objetivo de proteger o transcrito contra ação de algumas
enzimas, facilitar o transporte e orientar o encaixe da subunidade ribossomal 40s)
12. Sequência de ligação consensual e fatores de transcrição específicos são
respectivamente: (QUESTÃO CONFUSA, NÃO SEI A RESPOSTA)
a. Ativadores que facilitam a montagem dos fatores basais de transcrição. Ilhas CPG
(ilhas CPG é uma região promotora)
b. Também conhecido como TATA BOX. Fatores que se ligam ao TATA BOX para que
seja possível a ação da RNA polimerase
c. Fatores TRANS atuantes que estão presentes em todas as células e/ou tecidos.
Elementos responsáveis que migram até o local específico e exercem uma resposta
a expressão do gene.
d. Fatores CIS atuantes que estão presentes em genes específicos que por sua vez
estão em todas as células e/ou tecidos. Fatores TRANS atuantes estão presentes
em células e/ou tecidos específicos interagindo com as sequências de ligação
consensual
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e. Agentes reguladores (ativadores) que somente em condições específicas exercem
sua função ativadora. São os fatores TFIB, TBID, TFBII, TFIIH
13. Escolha uma (não tinha resposta na prova passada, então foi chute a minha
alternativa)
a. O uso de anticorpos anti-RAS (tipifamib) pode ser útil por inativar a via RAS-MAPK e
consequentemente reduzir a proliferação celular (as proteínas RAS estimulam a
multiplicação celular; a via das kinases aumentam a proliferação celular; anticorpo
anti RAS vai levar a diminuição da proliferação celular, então ACHO que está certa)
b. O uso de moléculas interferentes da mTOR (everolimus) pode ser útil por inativar o
mecanismo de apoptose celular e consequente determinar a senescência e morte
das células tumorais (mTOR é uma proteína com papel central no crescimento,
proliferação e manutenção das células; se ela inativa a apoptose ela não vai
promover a morte de células tumorais, então essa está errada)
c. Uso de anti-PDK1 pode ser útil por aumentar a AKT e consequentemente acelerar a
senescência de células tumorais simultaneamente à redução da apoptose das
células normais. (o uso de anti PDK diminui AKT e consequentemente não haverá
produção de BCL2, que é um inibidor de apoptose, contribuindo para morte celular e
diminuição da multiplicação celular)
d. O uso de inibidores da Bcl2 pode ser útil por sua capacidade de reduzir a
proliferação de células leucêmicas derivadas dos linfócitos B, reduzindo o risco de
metástase (a BCL2 inibe a apoptose. Logo, se você inibir a BCL2, vai ter uma menor
proliferação celular e consequentemente vai ter menor chance de metástase né? na
real que eu não faço a mínima ideia)
14. Com relação à transcrição, assinale a correta.
a. Para que ocorra a transcrição, há necessidade de um primer iniciador (RNA
primase), onde a RNA polimerase tipo 1 vai se ligar (RNA polimerase II e não existe
a necessidade de primer)
b. A RNA polimerase tipo 3 está presente no nucléolo e vai ser importante para
desenrolar a fita de DNA, formando a bolha de transcrição (RNA polimerase II que é
importante para desenrolar a fita de DNA)
c. A TBP se liga ao DNA pelo sulco maior e tem como função manter a fita de DNA
enrolada, inibindo a transcrição de alguns genes. (a TBP gera uma torção em cada
extremidade da TATA box e gera um leve abertura da dupla fita; a TBP liga-se pelo
sulco MENOR)
d. RNA polimerase tipo 2 necessita da TBP e de diversos fatores gerais de transcrição
para localizar o sítio de início da transcrição
e. Após a abertura das fitas de DNA, ambas as fitas são transcritas simultaneamente,
por RNA polimerase diferentes, o que aumenta a velocidade de transcrição de
determinado gene (na transcrição somente uma fita é transcrita)
15. Com relação aos RNAs que atuam na tradução, assinale a correta:
a. Segundo a hipótese de Wobble, a fita de RNA mensageiro é específico para cada
subunidade menor do ribossomo, para que haja maior especificidade de reação
entre o RNA mensageiro e o RNA ribossomal (o fato é que um mesmo RNAt pode
reconhecer, com frequência, mais do que um códon, pois a base na primeira posição
do anticódon pode se emparelhar com mais de um tipo de base na terceira posição
do códon. Essa idéia foi proposta em 1966, e ficou conhecida como hipótese do
emparelhamento incerto ou oscilação (usa-se o termo wobble, em inglês). Segundo
esta hipótese, o emparelhamento da primeira base do anticódon não seria
espacialmente tão restrito como para as outras duas, de modo que a primeira base
de um anticódon poderia fazer pontes de hidrogênio com mais de um tipo de base
na terceira posição do códon. Esse emparelhamento, no entanto, não é irrestrito, ou
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seja, uma primeira base de um anticódon não pode se emparelhar com qualquer tipo
de base na terceira posição do códon)
b. Rna Ribossomal reconhece a extremidade 5’ do RNA transportador para catalisar as
reações entre o RNA transportador e o RNA mensageiro. (o RNAr reconhece a
extremidade 5' do RNAm)
c. RNA transportador tem em sua estrutura 3 alças principais, e a região 3’ termina
sempre com a sequência CCA, que é o sítio de ligação com o aminoácido
d. A região 3’ UTR é importante para que haja início da tradução, sendo o local de
ligação entre o RNA mensageiro e o anticódon do RNA transportador (região UTR
são regiões do RNAm não codificantes. A região 5' UTR se extendeaté o cóndon de
iniciação, ao passo que a região 3' UTR até o códon de terminação)
e. O acoplamento entre o RNA transportador e o aminoácido é feito ao acaso, sendo
que essa ligação é inespecífica e catalisada pela endonuclease (a ligação é
específica e é feita pela aminoacil-RNAt transferase)
16. Sequência de ligação consensual e fatores de transcrição específicos são
respectivamente: (promotores contêm sequências de DNA específicas como sequências
consenso, que fornecem um sítio seguro de ligação para a RNA polimerase e para
proteínas chamadas fatores de transcrição que recrutam a RNA polimerase.)
a. Ativadores que facilitam a montagem dos fatores basais de transcrição. Ilhas CPG
(ilhas CPG é uma região promotora)
b. Também conhecido como TATA BOX. Fatores que se ligam ao TATA BOX para que
seja possível a ação da RNA polimerase (quem atua é a RNA polimerase II, mas pra
mim essa daqui tá certa)
c. Fatores TRANS atuantes que estão presentes em todas as células e/ou tecidos.
Elementos responsivos que migram até o local específico e exercem uma resposta a
expressão do gene (fatores trans são fatores regulatórios codificados por genes.
Eles reconhecem sequências específicas na região de controle do gene, como os
motivos de ligação. Tornam possível a ação da RNA polimerase)
d. Fatores CIS atuantes que estão presentes em genes específicos que por sua vez
estão em todas as células e/ou tecidos. Fatores TRANS atuantes estão presentes
em células e/ou tecidos específicos interagindo com as sequências de ligação
consensual (fatores cis atuantes sequências regulatórias nas quais podem se
ligam os fatores trans. Ou seja, são sequências do DNA, como promotores,
enhancers, silenciadores, elementos responsivos nos quais os trans-atuantes se
ligam)
e. Agentes reguladores (ativadores) que somente em condições específicas exercem
sua função ativadora. São os fatores TFIIB, TBIID, TFBIIF
17. Em relação ao imprinting gênico
a. O imprinting paterno é sempre o mais frequente porque o paciente possui apenas
um Y (o padrão é randômico e não existe imprinting no cromossomo Y)
b. Doenças causadas por falta de imprinting tem um padrão dominante de transmissão,
fazendo com que gerações subsequentes tenham indivíduos acometidos pela
doença (o padrão da doença de metilação)
c. A demetilação dos gametas e remetilação de acordo com o sexo fetal são aspectos
importantes para definir o padrão de imprinting gênico (quando há hipermetilação de
regiões hipometiladas ou hipometilação de regiões hipermetiladas, temos alterações
genéticas que levam a instabilidade ou repressão gênica e, consequentemente,
doenças)
d. O imprinting materno é o padrão mais frequente, pois a presença dos 2 X na mulher
exige o silenciamento de um dos alelos. (o padrão é randômico)
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https://pt.wikipedia.org/wiki/Fator_de_transcri%C3%A7%C3%A3o
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e. Doenças causadas por falha de imprinting tem um padrão recessivo de transmissão,
fazendo com que gerações subsequentes tenham apenas parte dos indivíduos
acometidas pela doença
18. Assinale a alternativa INCORRETA:
a. No sequenciamento do exoma completo, o foco da análise é a região
não-codificante do genoma (é a região codificante o foco)
b. O exoma consiste em 2% de todo o genoma.
c. Para sequenciar um genoma humano, programas computacionais são necessários.
d. Em 2020 é possível sequenciar o genoma humano em 72 horas.
e. O sequenciamento de Sanger (1a geração) foi completamente substituído pelo NGS.
(o Sanger ainda é utilizado, porém a A é bem mais errada)
19. Assinale a alternativa INCORRETA:
a. A doença rara é aquela que afeta 1,3 indivíduos a cada 2.000 habitantes.
b. O exame de sequenciamento direto ao consumidor tem a mesma utilidade clínica do
sequenciamento do exoma completo (o sequenciamento do genoma completo é
mais indicado em estudo científicos, visando estudar as consequências de
alterações em regiões ainda não estudadas ou a busca pela alterações que causam
doenças ainda sem causas elucidadas; o sequenciamento do exoma é mais
indicado para o diagnóstico clínico principalmente em casos em que existe hipótese
de mais de uma doença específica, ou ainda, que não se tem hipótese específica)
c. A doença rara é aquela que afeta 65 indivíduos a cada 100.000 habitantes.
d. Em 2020, já é possível que bebês tenham o seu genoma completo sequenciado ao
nascimento.
e. A síndrome de Down é uma doença rara (mano kkk isso é falso mas a B é "mais
falsa")
20. Qual a aplicabilidade clínica das plataformas de Arrays?
a. Diagnóstico da síndrome de Down (cariótipo)
b. Diagnóstico das deleções e duplicações cromossômicas.
c. Diagnóstico da acondroplasia.
d. Diagnóstico da síndrome do X frágil.
e. Diagnóstico de hipertensão arterial sistêmica.
21. A técnica de PCR consiste na amplificação de milhares de cópias de um
fragmento específico de DNA a partir de um DNA molde. Para tanto, são necessárias
etapas para sua idealização conforme descrito a seguir:
a. Uma fase de desnaturação do DNA a 95°C, uma fase de extensão que pode variar
entre 30°C a 35°C e uma fase de anelamento da TAQ DNA polimerase a 72°C.
Estas etapas são repetidas entre 50 a 65 vezes amplificando milhares de vezes o
fragmento desejado. (a fase da extensão é a terceira e é nela que se utiliza a TAQ
polmerase)
b. É adicionada a amostra de DNA genômico um MIX de Topoisomerase, Helicase,
primers específicos, DNTPs e a enzima TAQ DNA Polimerase. Esta mistura é
submetida às temperaturas desnaturação a 95°C, anelamento dos primers a 60°C e
extensão a 72°C. Estas etapas são repetidas entre 35 a 40 vezes amplificando
milhares de vezes o fragmento desejado.
c. Uma fase de desnaturação do DNA a 95°C, uma fase de anelamento dos primers
onde a temperatura pode variar entre 50°C a 65°C e uma fase que ocorre na
temperatura de 72°C para que a TAQ DNA polimerase realize a extensão a partir
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dos primers anelados. Estas três etapas são repetidas entre 35 a 40 vezes
amplificando o fragmento milhares de vezes.
d. A amostra de DNA é submetida a uma desnaturação por enzimas de restrição que o
fragmentam em sequências menores, tornando assim possível o anelamento dos
primers. Posteriormente ocorre a extensão das novas fitas que é realizada pela TAQ
DNA polimerase a uma temperatura de 72°C. Estas etapas são repetidas entre 35 a
40 vezes amplificando milhares de vezes o fragmento desejado. (não é adicionado
enzimas de restrição no PCR convencional, apenas no PCR/RLFP)
e. Uma fase de desnaturação do DNA a 72°C, uma fase de anelamento dos primers
onde a temperatura pode variar entre 50°C a 65°C e uma fase de extensão das
novas fitas que ocorre na temperatura de 90°C. Estas três etapas são repetidas
entre 35 a 40 vezes amplificando o fragmento milhares de vezes (a fase de
desnaturação ocorre a 95° enquanto a fase de extensão ocorre a 72°)
22. A técnica de PCR/ARMS consiste:
a. Na aplicação de uma corrente elétrica em um gel de agarose devidamente
preparado em uma cuba específica onde os amplificados de DNA de maior peso
molecular migram mais lentamente quando comparados com os de menor tamanho
que por sua vez migram mais rapidamente. Sendo assim, é possível calcular o
tamanho exato de um dado fragmento com base na sua razão de migração.
(eletroforese)
b. Na amplificação de um fragmento de DNA e posterior digestão destes fragmentos
amplificados por uma enzima de restrição. Esta cliva no exato ponto da mutação e
este resultado pode ser visto através de uma eletroforese em gel de agarose. (a
PCR/ARMS não usa enzima de restrição; o que está descrito é PCR/RFLP)
c. Em uma técnica desenvolvida exclusivamente para amplificação de fragmentos de
DNA referentes a regiões que se situam entre o centrômero e os braços dos
cromossomos (a técnica de PCR/ARMS permite que somente o DNA mutado seja
ampliado)
d. Em uma técnica onde uma amostra de RNA é convertida em DNA através da
utilização de uma enzima DNA polimerase (a técnica