Copia de DIAGNA-STICO IMUNOLOGICO E MOLECULAR DAS DOENA-AS INFECCIOSAS

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◤ DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO 
E MOLECULAR DAS DOENÇAS 
INFECCIOSAS
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Diagnóstico Molecular 
▪ Os testes moleculares tem oferecido uma ampla gama de exames que 
auxiliam a:
▪ prever, 
▪ predizer, 
▪ fazer triagem
▪ diagnosticar 
▪ e no prognóstico de diversas doenças.
Importante por sua rapidez e eficácia
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Para que são usados os exames 
diagnósticos moleculares:
▪ mapear doenças de natureza genética, tal como o câncer; 
▪ na triagem pré-natal ou Teste Pré-Natal Não Invasivo (NIPT) que detecta, 
além do sexo do bebê, possíveis alterações cromossômicas e as trissomias 
mais comuns nos bebês.
▪ diagnóstico e prognóstico de doenças infecciosas 
▪ na medicina de precisão para tratamentos personalizados
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Importância 
▪ Precisão 
▪ sensibilidade 
▪ e especificidade de seus resultados.
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Amostras 
▪ saliva, 
▪ sangue, 
▪ plasma, 
▪ medula, 
▪ líquor 
▪ Outros..
▪ Na maior parte dos testes genéticos - sangue ou saliva.
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Aplicações do Diagnóstico molecular
• Identificação de doenças hematológicas como trombofilias, hemocromatose, 
entre outras;
• Identificação de mutações relacionadas à leucemia, 
• Alterações moleculares que indiquem a ocorrência de câncer, como o de 
mama, o de pulmão e o câncer colorretal;
• Nas doenças genéticas raras.
• Identificação e diagnóstico de doenças infecciosas, tais como hepatites, HIV e 
outras;
• Identificação de infecções respiratórias e identificação de agentes, como 
Influenza A, B e C, Coronavírus, entre outros.
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Tipos de testes de diagnóstico 
molecular
▪ Amplificação de DNA pela reação em cadeia da DNA polimerase - A reação em 
cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para 
fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. 
▪ Western blot - Diagnóstico de Doenças: detecta anticorpos contra vírus ou bactérias 
no soro. A técnica de Western blotting é o teste confirmatório para o HIV. Detecta 
anticorpos anti-HIV no soro do paciente. Útil para detectar proteínas defeituosas.
▪ Sequenciamento de ácidos nucleicos - identifica o organismo ao qual pertence uma 
amostra, determina diagnostico uma doença genética e diferencia cepas de 
microrganismos patogênicos.
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Outra técnica associada
▪ Eletroforese - A eletroforese consiste em um método de 
separação de macromoléculas, como DNA, RNA e proteínas e 
enzimas com tamanhos e cargas diferentes, por aplicação de 
corrente elétrica.
▪ Os fragmentos de DNA provenientes das extrações ou 
amplificações com diferença grande de comprimento são 
geralmente visualizados em géis de agarose horizontal e 
sequenciamento de DNA são realizados em géis verticais de 
poliacrilamida.
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Como preparar para realizar essas técnicas:
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Como iniciar os testes de diagnóstico 
molecular:
▪ Para a realização das análises moleculares com eficiência é necessária a 
separação dos ácidos nucleicos do restante dos constituintes das células, 
utilizando técnicas de extração de DNA ou RNA.
▪ Existem vários protocolos de extração de DNA e RNA. O mais adequado 
deve levar em consideração a molécula desejada (DNA e/ou RNA), o tipo 
de amostra, o grau de pureza e o rendimento desejado, além da 
disponibilidade de recursos para a sua realização.
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Acondicionamento das amostras
▪ O acondicionamento adequado das amostras após a coleta é essencial 
para a sua preservação até o momento da extração. 
▪ O DNA apresenta estabilidade maior, enquanto o RNA é rapidamente 
degradado após a coleta. 
▪ Isso pode ser evitado por meio do congelamento das amostras em 
nitrogênio líquido ou do uso de reagentes conservantes.
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Preparação das amostras
▪ Amostras líquidas, como sangue, urina ou líquor, geralmente são 
centrifugadas para a separação de células nucleadas, no precipitado, ou 
de partículas virais, no sobrenadante. 
▪ Já os tecidos sólidos, músculos ou pedaços de outros órgãos, precisam 
passar por uma etapa de quebra das estruturas rígidas, com o objetivo de 
aumentar a superfície de contato para a ação dos reagentes nas etapas 
seguintes
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Lise celular
▪ A lise celular envolve o rompimento das células e deve ser realizada em 
soluções tamponadas, geralmente contendo um detergente e os reagentes 
tris-hidroximetil aminometano (Tris), cloreto de sódio (NaCl) e ácido etileno 
diamino tetra-acético (EDTA).
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Funções dos reagentes
▪ O reagente Tris mantém o pH da solução tampão de lise estável (próximo a 8,0), evitando 
que o DNA, ao ser liberado, sofra o ataque das enzimas desoxirribonucleases (DNases) 
endógenas que o degradam, as quais atuam em pH ótimo de 7,8. 
▪ A adição do agente quelante EDTA também auxilia na inibição da ação das DNases por 
se ligar aos cofatores Ca+2 e Mg+2 da enzima DNase. 
▪ O NaCl contribui rompendo ligações iônicas das cadeias peptídicas, auxiliando na 
desnaturação das proteínas e adicionalmente promove a aglomeração das moléculas de 
DNA.
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Separação dos constituintes:
▪ Os ácidos nucleicos são liberados na solução aquosa juntamente com outros 
constituintes celulares dos quais devem ser isolados. 
▪ Para esse fim, são utilizados solventes orgânicos, como o fenol ou clorofórmio, 
que desnaturam proteínas. Nessa etapa, após a centrifugação, o DNA 
permanecerá solúvel na fase aquosa (sobrenadante). 
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Precipitação do DNA
▪ Em condições de baixa temperatura e elevada concentração salina (devido ao 
NaCl presente no tampão de lise), a adição de etanol absoluto, isopropanol ou 
soluções acetatos de amônio ou sódio resulta na precipitação do DNA.
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Lavagem e ressuspensão do DNA
▪ A lavagem do DNA é realizada com etanol 70% para a remoção dos sais, 
detergentes e de outras impurezas. Após a secagem por evaporação, o DNA é 
solubilizado preferencialmente em solução tampão TE (Tris-HCl e EDTA).
https://core.ac.uk/download/pdf/37451202.pdf
https://core.ac.uk/download/pdf/37451202.pdf
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Depois de feita a extração do DNA ou 
RNA pode seguir para as técnicas:
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Eletroforese
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Eletroforese
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PCR
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PCR e suas etapas:
Os resultados de uma reação PCR são geralmente 
visualizados (tornam-se visíveis) através do uso 
da eletroforese em gel.
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis
◤▪ As três etapas da PCR são repetidas, geralmente, de 20 a 30 ciclos.
▪ A PCR é realizada em um equipamento denominado termociclador, que permite 
variações de temperatura de forma rápida. 
▪ No termociclador são colocados microtubos contendo os reagentes necessários 
para que ocorra a reação enzimática. 
▪ As reações incluem 
▪ água ultrapura, 
▪ moléculas de DNA a serem duplicadas (DNA molde), 
▪ desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs), 
▪ primers, 
▪ enzima DNA polimerase, 
▪ solução de cloreto de magnésio (cofator da enzima DNA polimerase) 
▪ e solução tampão para a DNA polimerase.
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Western blot
▪ Separação das proteínas por peso molecular através de uma 
eletroforese, seguindo-se da transferência para uma 
membrana e a detecção da proteína de interesse com um 
anticorpo específico.
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Etapas
1. extração e quantificação das proteínas
2. eletroforese em gel de poliacrilamida
3. transferência das proteínas para uma membrana
4. incubação da membrana com um anticorpo para detectar a proteína 
específica a ser analisada
5. revelação dessa membrana para análise dos dados
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Western blot
▪ As proteínas e glicoproteínas virais, que atuam 
como antígenos, são separadas por 
eletroforese – em gel de poliacrilamida, 
segundo seus pesos moleculares – e 
transferidas para a membrana de nitrocelulose.
▪ A reação entre o antígeno adsorvido à 
membrana de nitrocelulose e os anticorpos da 
amostra é revelada por um processo 
enzimático. Adiciona-se o conjugado 1, 
composto por uma anti-imunoglobulina humana 
conjugada com biotina. 
▪ Adiciona-se o conjugado 2, que é composto de 
avidina1 ou estreptavidina ligada a uma 
enzima. Notas: 1 - avidina – proteína (obtida da 
clara do ovo) que se ligafortemente à molécula 
de biotina. 
▪ Em seguida, adiciona-se o substrato 
(4-cloro-1-naftol). A degradação do substrato 
origina um produto insolúvel e corado que 
permite, a olho nu, a visualização da reação 
sobre a fita.
Reatividade (presença de 
bandas), em pelo menos duas 
das seguintes proteínas: p24, 
gp41 e/ou gp120/gp160.
Amostra indeterminada: 
qualquer padrão de 
reatividade (presença de 
bandas) diferente do item 
anterior.
Amostra não reagente: 
ausência de reatividade 
(ausência de bandas), 
independentemente da 
proteína viral utilizada no 
ensaio.
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Sequenciamento 
▪ A determinação da sequência nucleotídica é possível graças à técnica desenvolvida por 
Sanger e colaboradores na década de 1970 e se tornou acessível por meio dos avanços 
recentes na fabricação de equipamentos automáticos. 
▪ equipamentos automatizados de sequenciamento utilizam capilares extremamente finos nos 
quais, por meio da migração por eletroforese capilar, os fragmentos são alinhados com 
base no seu tamanho, do menor ao maior, e são detectados por um feixe de laser. 
▪ A marcação de cada um dos quatro ddNTPs (A, T, C ou G) com uma molécula fluorescente 
diferente permite identificar qual foi o nucleotídeo adicionado em cada posição terminal dos 
fragmentos, construindo-se assim a sequência da molécula de DNA alvo
A amostra de DNA a ser sequenciada é combinada em 
um tubo com primer, DNA polimerase e nucleotídeos 
de DNA (dATP, dTTP, dGTP, and dCTP). Os quatro 
nucleotídeos terminadores de cadeia marcados com 
corantes são adicionados também. 
A mistura é primeiro aquecida para a desnaturação do 
DNA molde (separar as fitas), então resfriadas para 
que os primers possam se ligar ao molde de fita 
simples. 
Uma vez que o primer se ligou, a temperatura é 
aumentada novamente, permitindo que a DNA 
polimerase sintetize um novo DNA a partir do primer. 
A DNA polimerase continuará a adicionar 
nucleotídeos à cadeia até que aconteça a adição de um 
dideoxinucleotídeo ao invés de um normal. 
Nesse ponto, os nucleotídeos não podem mais ser 
adicionados, e portanto a fita terminará em um 
dideoxinucleotídeo.
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Diagnósticos Imunológicos 
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Para que sevem os testes 
imunológicos?
▪ Os testes detectam a presença de anticorpos contra parasitas, fungos, 
bactérias ou vírus. 
▪ Podem também detectar a presença dos antígenos desses agentes, 
indicando diretamente a sua presença no hospedeiro. 
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Imunocromatografia
▪ Detecção ANTÍGENO • Para detectar antígeno, emprega-se um anticorpo de 
captura, ligado à matriz e um anticorpo marcado com partículas coloridas 
que é específico para o antígeno pesquisado; 
▪ Detecção ANTICORPO • Para detectar anticorpo, utiliza-se um antígeno 
específico ligado à matriz e um anticorpo antiimunoglobulina marcado com 
partículas coloridas;
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Hemaglutinação
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ELISA
 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
▪ Etapas do ELISA 
▪ sensibilização (ou cobertura) da fase sólida:
▪ adição de Ag ou do Ac 
▪ bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) ∗ 
▪ adição da amostra (em diluente) * 
▪ adição do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) ∗ 
∗ lavagens
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Teste rápido
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Hibridização in situ
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VDRL
Venereal Disease Research Laboratory
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HTLV
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HEPATITE B