Resumo PCR e sequenciamento

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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 
É um processo de síntese de DNA in vitro, é possível fazer cópias de um fragmento 
específico de DNA em laboratório. É fácil, rápida e podem ser usadas pequenas 
quantidades de DNA, porém é preciso ter um conhecimento prévio dá sequência do DNA 
e é um processo caro. 
A cada ciclo o DNA é duplicado de forma exponencial. N= número final de cadeias 
de DNA, n= número de repetição de ciclos e N0= número inicial de DNA molde 
(template). 
 
ETAPAS DE UMA REAÇÃO CLÁSSICA DE PCR: 
1. DESNATURAÇÃO térmica a 94 graus, ocorre a separação das fitas (94°). 
2. ANELAMENTO os primers ou iniciadores se anelam as fitas de DNA onde o 
fragmento será amplificado (35° a 65°). 
3. EXTENSÃO: ação da enzima TAQ DNA POLIMERASE a partir da ponta 3’- 
OH dos primers (72°). 
 
APLICAÇÕES: 
• Screening 
• Sequenciamento 
• Expressões quantitativas e qualitativas de genes específicos 
• Clonagem 
• Síntese química de genes 
• Diagnóstico 
• Exame de vínculo genético (paternidade) 
 
PROTOCOLO PADRÃO: 
Componentes para uma reação: DNA molde (é o dna a ser replicado), enzima Taq 
DNA polimerase (vai sintetizar a fita a partir do primer), dois primers, dNTPs, magnésio 
(ativador dá Taq pol), tampão (para equilibrar o pH) e água miliQ. 
 
Temperatura de anelamento do primer: quanto maior for a temperatura, mais 
específico é o primer. E quanto maior for o primer e quanto mais C e G, maior é a 
temperatura e consequentemente, a especificidade. 
Tm= 4.(G + C) + 2.(A + T) 
 
Tamanho do primer: a partir de 17-mer. Quando maior, menor a chance de anelar no 
lugar errado, ou seja, mais específico ele é. 
 
SEQUENCIAMENTO 
É uma aplicação da técnica de PCR, feita para determinar a sequência das bases 
nitrogenadas de algum DNA. É feita pelo método de Sanger. 
Reagentes necessários: DNA molde a ser conhecido, primer (universal e inespecífico, 
rico em T e A), dNTPs, ddNTPs (nucleotídeos quimicamente modificados para 
interromper a síntese do DNA), DNA polimerase, magnésio e tampão. 
A técnica: 
1. Uma amostra do DNA a ser sequenciado é distribuída igualmente em quatro 
tubos, todos com a mesma quantidade de DNA polimerase, primer, dNTPs e cada 
um com um tipo de ddNTP (A, C, T ou G). 
2. Os tubos são aquecidos para as fitas duplas desnaturarem para o primer se ligar 
em alguma parte dela; 
3. A DNA polimerase vai produzindo uma nova fita adicionando as dNTPs, quando 
alguma ddNTP é colocada, a síntese é interrompida. 
4. Ao final, são formadas várias fitas de tamanhos diferentes, que são colocadas na 
eletroforese em gel 
5. A eletroforese vai separar as fitas pelo tamanho, já que as menores correm mais 
no gel, nos mostrando a sequência das bases do DNA.