TÉCNICAS DE COLORAÇÃO - MICROBIOLOGIA

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Técnica� d� Coloraçã� SOFIA IZABELLA-ODONTO 107
Coloração de Microrganismo: Simples
● Tipos de coloração;
○ Simples:
■ Uso de um único corante base em álcool ou solução aquosa;
■ Possível observar: forma celular e estruturas básicas;
■ Etapas: esfregaço fixo, lavagem e secagem;
■ Mordente: intensifica coloração e estruturas;
■ Colorações usadas: azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta,
safranina;
○ Diferenciais:
■ Reagem de maneira específica a cada tipo de bactéria;
■ Colorações usadas: coloração álcool-ácido e coloração de Gram;
● Preparação da Lâmina:
○ Fixação da lâmina antes de receber o corante:
■ Mata o microrganismo ➠ fixação do microrganismo na lâmina;
■ Impede que a coloração lave o microrganismo;
■ Conservação das partes do microrganismos com menos distorção;
○ Etapas:
■ Preparação de solução salina, retira o excesso com alça de platina;
■ Espalhar um filme delgado desse material (esfregaço) sobre a
superfícies da lâmina ➠ de cima para baixo;
■ Secagem do ar;
■ Passagem da lâmina repetidamente no bico de Bunsen com esfregaço
para cima (fixação pelo calor) ➠ cuidado para não sobreaquecer e
quebrar a lâmina;
● Coloração de Gram:
○ Criado em 1884: Hans Christian Gram;
○ Verifica a composição química da parede da bactéria através do uso de
corantes ( 3) da coloração final;
○ Uso de bactérias crescidas a pouco tempo;
○ Classifica as bactérias em:
■ Gram-positivas;
■ Gram-negativas;
○ Etapas:
■ 1ª Etapa:
● Esfregaço fixado por calor
recoberto por cristal de violeta;
● Tempo: 1 minuto;
● Impregnação de todas as células
por essa coloração;
● Coloração primária;
■ 2ª Etapa:
● Lavagem do corante cristal de
violeta;
● Esfregaço coberto por lugol que
contém o iodo (mordente);
● Lavagem do iodo;
● Gram-positiva: grande afinidade
com lugol pelo peptidoglicano;
● Aparecem bactérias gram-negativas
e gram-positivas em violeta escuro
ou púrpura;
■ 3ª Etapa:
● Uso do agente descorante;
● Lâmina lavada com álcool ou
solução de álcool-acetona;
● Remoção da coloração das
gram-negativas pela diluição
dos seus lipossacarídeos;
● Gram-positiva: rosa ou violeta;
● Diferenciação entre
Gram-negativas e Gram-positivas;
■ 4ª Etapa:
● Lavagem de álcool com água
corrente;
● Lâmina corada com
safranina ou fucsina por 1
minuto;
● Gram-positiva: violeta ou
azul;
● Gram-negativa: vermelha;
● Lâmina lavada novamente e
secada com papel
● Examinação da lâmina no microscópio;
COLORAÇÃO FINAL:
● Importância:
○ Gram-positiva:
■ Mortas com maior facilidade pela penicilinas e
cefalosporinas;
○ Gram-negativa:
■ Mais resistentes ao uso de antibióticos
devido a camada de lipossacarídeos;
Técnica de Ziehl-Neelsen:
● Usada em bactérias que são resistentes à outros tipos de coloração, devido ao o
alto teor de lipídeos estruturais ( bactérias álcool-ácido resistentes- BAAR) na
parede celular - Mycobacterium e Nocardia;
● Baar: característica álcool-ácido-resistente conferida a essas bactérias devido ao
alto teor de lipídeos estruturais na parede celular ➠ provoca uma hidrofobicidade ,
dificultando a ação de corantes aquosos;
○ Essas bactérias são resistentes à coloração, porém quando coradas resistem
fortemente a descoloração - mesmo quando submetidos a ácidos
fortemente diluído e ao álcool absoluto;
● Funcionamento da técnica de Ziehl-Neelsen:
○ Coloração da amostra ➠ fucsina ziehl irá corar todos os elementos celulares
de vermelho;
○ Descoloração com álcool ➠ somente os bacilos álcool-ácido- resistentes
preservarão a coloração vermelha, enquanto os demais elementos
permanecerão descorados;
○ Para visualização dos elementos descorados ➠ azul de metileno ➠
contraste entre os corantes;
○ Resultado- elementos celulares : azul , bacilos álcool-ácido- resistentes :
vermelho;
● Materiais clínicos que se usam a técnica ziehl-neelsen:
○ Escarro, urina e fezes
○ Principal amostra: Escarro- coleta pela manhã ao acordar antes de escovar
os dentes ou de fazer a higiene bucal;
■ Material coletado em menor quantidade possível de saliva ou de
outras secreções do trato aéreo respiratório;
■ Coleta de 3 amostras em diferentes dias- geladeira antes do
encaminhamento ao laboratório- inalação do soro fisiológico para
ajudar na expectoração;
● Procedimento técnico:
1. Preparar o esfregaço conforme o procedimento estipulado pelo laboratório e
seguindo a biossegurança;
2. Colocar as lâminas em suporte apropriado separadamente uma da outra;
3. Cobrir todo o esfregaço com solução de fucsina fenicada, aquecer a lâmina
até a emissão de vapores- não deve deixar ferver ou secar;
4. Aguardar 5 a 8 minutos;
5. Retirar a lâmina do suporte e lavar rapidamente em água corrente sob baixa
pressão ;
6. Descorar os esfregaços usando a solução descorante- gotejando sobre a
lâmina inclinada até que não remova mais corante;
7. Lavar a lâmina em água corrente sob baixa pressão;
8. Cobrir todo o esfregaço com azul de metileno loeffler por 1 minuto;
9. Lavar em água corrente e deixar secar na posição vertical do ar;
● Limitações do método:
○ Os resultados podem ser falsamente aumentados ou diminuídos;
○ Riscos de instabilidade - resultados errôneos;
○ Danos relacionados ao usuário- mais frequência nas situações de;
■ Utilização de reagente vencido ou contaminado
■ Uso da solução descolorante por tempo prolongado - descoloração
de estruturas que deveriam continuar coradas - resultados
imprecisos;
■ Após abertos- componentes suscetíveis a contaminações químicas ou
microbianas - inviabilizam sua utilização;
■ Congelar componentes;
■ Interpretação equivocada de resultados;
■ Tempo de coloração inferior ao recomendado - coloração errônea;
■ Armazenamento ou transporte de amostra inadequado;
● Importante:
○ Manter os frascos dos padrões sempre fechados de maneira a evitar
alterações em concentrações.
○ Deve-se evitar o uso de materiais que possam contaminar os reagentes.
○ Todas as amostras devem ser manipuladas com extrema cautela, pois podem
veicular diversas doenças infectocontagiosas (hepatite, SIDA etc.).