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Oxidações Biológicas Apostila

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compreende etapas sucessivas de 
transferências de elétrons entre diferentes carreadores cujo aceptor final é o O2 molecular. 
A transferência de elétrons através dos carreadores gera um gradiente eletroquímico de H+ através 
da membrana interna mitocondrial (o mecanismo de transferência desses H+ ainda não está bem 
estabelecido). O retorno dos H+, feito através do "fator de acoplamento" (Fo-F1 ATP-sintetase), é 
o que permite a síntese de ATP. 
Em seres procarióticos, como as bactérias, os carreadores estão situados na membrana 
citoplasmática. Nos eucarióticos, como as leveduras, há compartimentalização e a cadeia de 
transporte de elétrons está localizada na membrana interna mitocondrial; portanto, nesses 
organismos, a maioria dos processos relacionados diretamente à síntese de ATP ocorre na 
mitocôndria. 
 
Mitocôndria - É uma organela celular que apresenta dupla membrana. A membrana externa 
mitocondrial atua como barreira protetora sendo permeável a moléculas de PM até 10.000. A 
membrana interna é altamente hidrofóbica e seletiva sendo impermeável a moléculas de PM 
elevado e a íons, mas permeável a moléculas pequenas como O2, NH3 e H2O. 
O transporte de muitas substâncias através da membrana interna mitocondrial ocorre graças à 
presença de carreadores específicos na membrana denominados "translocases". Sabe-se que a 
mitocôndria de leveduras dispõe de carreador ou "translocase" responsável pelo transporte de 
ácidos dicarboxílicos através da membrana interna mitocondrial. Isto permite o uso da organela 
íntegra para a determinação da atividade de desidrogenases localizadas tanto na membrana 
mitocondrial interna, quanto na matriz mitocondrial. 
 
Succinato Desidrogenase 
 
Esta enzima é um componente estrutural da membrana interna mitocondrial, constituindo uma das 
unidades funcionais responsáveis pelo transporte de elétrons. Esta unidade funcional é denominada 
complexo II (C-II). O complexo II ou succinato-CoQ redutase compreende: uma sub-unidade com 
PM de 70.000 que se encontra ligada covalentemente à flavina (FAD) através de His e um centro 
Fe-S; outra sub-unidade de PM 30.000 com outros 2 centros Fe-S. Fazem ainda parte do C-II, o 
citocromo b560 e lipídeos. 
A succinato desidrogenase (SDH) catalisa a oxidação do ácido succínico a ácido fumárico: 
 
HOOC CH2 CH2 COOH
 Succinato
Desidrogenase
E-FAD
COOHHOOC C
H
C
H
E-FADH2
 
Como mostrado no esquema, esta reação ocorre com simultânea redução do FAD a FADH2; os 
elétrons são transferidos posteriormente aos centros Fe-S e destes à CoQ10 ou ubiquinona, um 
outro componente da cadeia de transporte de elétrons. 
A SDH é a única enzima do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs) que faz parte da cadeia 
de transporte de elétrons, constituindo parte inerente da membrana interna mitocondrial. 
 
 
 
A redução da CoQ10 pelo succinato pode ser inibida competitivamente pelo malonato devido à 
semelhança estrutural existente entre estes dois compostos: 
 
HOOC  CH2  CH2  COOH HOOC  CH2  COOH 
Succinato Malonato 
 
Procedimento para obtenção e fracionamento de extratos celulares em Saccharomyces 
cerevisiae 
 
As células são agitadas na presença de abrasivo (pérolas de vidro) ou através de pressão com uso 
da prensa de French, para que haja o rompimento parede celular. Este rompimento deve ser feito 
à baixa temperatura, de modo a minimizar a desnaturação de proteínas. 
Este homogeneizado é centrifugado (por tempo e velocidade pré-fixados) para separação de 
células não rompidas e resíduos celulares; obtém-se, assim o homogeneizado bruto ou extrato 
bruto. Nesta centrifugação poderá haver também precipitação da fração nuclear, caso não sejam 
tomados os devidos cuidados. 
Para que se obtenham organelas íntegras necessita-se utilizar um meio isotônico, tanto durante o 
rompimento das células, como durante o fracionamento. 
A separação das várias frações sub-celulares é possível através de um procedimento denominado 
centrifugação diferencial (vide Técnicas de Fracionamento - Centrifugação) que se baseia no fato 
de que as organelas sedimentam a velocidades diferentes por apresentarem densidades diferentes. 
As velocidades adotadas na centrifugação diferencial dos diversos componentes sub-celulares 
variam para cada organismo. Para as leveduras as condições experimentais normalmente usadas 
estão mostradas no esquema abaixo: 
 
 
 
 
Homogeneizado
Sobrenadante
(extrato bruto)
Resíduo
Resíduo
(fração mitocondrial)
Sobrenadante
Sobrenadante
Sobrenadante
(enzimas solúveis)
Resíduo
(fração lisossomal)
Resíduo
(fração microssomal)
1.000 x g, 10 min
10.000 x g, 20 min
25.000 x g, 20 min
150.000 x g, 60 min
Homogeneizado
Sobrenadante
(extrato bruto)
Resíduo
Resíduo
(fração mitocondrial)
Sobrenadante
Sobrenadante
Sobrenadante
(enzimas solúveis)
Resíduo
(fração lisossomal)
Resíduo
(fração microssomal)
1.000 x g, 10 min
10.000 x g, 20 min
25.000 x g, 20 min
150.000 x g, 60 min
Metabolismo 
 
Instituto de Química • UFRJ 
227
Cada uma dessas frações pode ser caracterizada, através da dosagem da atividade de enzimas que 
lhes são próprias. Por exemplo, a succinato desidrogenase (SDH) é utilizada como marcadora da 
membrana interna mitocondrial. 
 
Determinação de produtos formados por reações redox 
 
Uma vez obtida a fração enzimática purificada ou simplesmente isolada de parte dos conteúdos 
celulares, pode-se usar várias técnicas para medir a formação de produtos. De uma maneira geral, 
reações que envolvem a transferência enzimática de elétrons de um substrato para outro, podem 
ser acompanhadas com uso de espectrofotômetro, na medida em que se adicione indicadores de 
oxi-redução, que são aceptores artificiais de elétrons. Uma das substâncias possíveis é um corante, 
o DCPIP (2,6 diclorofenol indofenol) que apresenta, quando oxidado, cor azul e absorção máxima 
em = 600 nm. Esta substância quando se reduz torna-se incolor com conseqüente decréscimo de 
absorção em = 600 nm. 
 
 
 
Outros tipos de corantes poderiam ser utilizados, como por exemplo PMS (Fenazinametassulfato) 
e [Fe (CN)6 ]3. 
No entanto, a utilização destes compostos torna a reação redox altamente inespecífica, pois um 
aceptor artificial de elétrons é capaz de aceitar prótons e elétrons de qualquer agente redutor que 
tenha potencial redox mais negativo do que o seu. 
No caso da SDH, o par redox succinato/fumarato tem E0’de aproximadamente 0,03 volts e o E0’ 
do par DCPIP/DCPIPH2 é de 0,22 volts, o que favorece o fluxo de elétrons do succinato para o 
DCPIP. 
Como a reação é reversível, a redução de fumarato a succinato também pode ser estudada, na 
medida em que se adicione um corante com potencial redox suficientemente baixo (FMNH2, 
Viologênios etc.) que direcione a reação no sentido inverso. 
 
A
forma oxidada
(azul)
AH
forma reduzida
(incolor)
2
E-FAD E-FADH
2
QQH
2
Succinato Fumarato
 
 
Diclorofenolindofenol (DCPIP)
OH
Cl
O
Cl
N
OH
ClCl
NH
OH
Forma Oxidada
 (azul)
Forma Reduzida
 (incolor)
 
 
Cadeia de transporte de elétrons 
 
A cadeia de transporte de elétrons é constituída de 4 complexos protéicos através dos quais os 
elétrons migram de pares redox com potenciais de redução padrão mais negativos em direção a 
potenciais mais positivos. Os elétrons são carreados do Complexo I e II para o Complexo III pela 
CoQ e deste último até o Complexo IV pelo citocromo c. 
 
NADH N A D 
+ 
 Complexo I 
 G o` 
2 e 
- 
Rotenona 
CoQ 
(-
Succinato 2 e 
- 
Fumarato 
(0,03V
F A D H 2 
Complexo 
 II 
(0,045V
Complexo III 
o` G  
citocromo c (0,235V
 G o` 
Complexo IV 
2 H 
+ + 1/2 O 2 H 2 O 
2 e 
- 
(0,815V
Antimicina A
Cianeto 
 Azida 
= - 69,5 kJ/mol 
= - 36,7 kJ/mol 
= - 112,0 kJ/mol 
 
 
Ação de inibidores do fluxo de elétrons 
 
Muitos carreadores da cadeia respiratória absorvem luz visível, apresentando cores distintas 
quando oxidados ou reduzidos. 
A adição de inibidores do transporte de elétrons leva a uma mudança na proporção