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Oxidações Biológicas Apostila

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de formas 
oxidadas e reduzidas de cada carreador, o que pode ser visualizado pela mudança no espectro de 
absorção. 
 
a b c d e 
- 
O 2 
O 2 e 
- 
d c b a 
Inibidor 
reduzido oxidado 
 
Metabolismo 
 
Instituto de Química • UFRJ 
229
Rotenona 
Inibe especificamente a transferência de elétrons da NADH desidrogenase para a CoQ. 
No entanto, a rotenona não inibe a oxidação do succinato, uma vez que os elétrons provenientes 
deste substrato entram na cadeia de transporte após o bloqueio. 
Antimicina A: 
Inibe o fluxo de elétrons entre o citocromo b e o citocromo c1. 
TTF (2-tenoil-trifluoracetona) 
O transporte de elétrons no complexo II pode ser inibido por TTF, cujo sítio de ação está localizado 
a nível das proteínas Fe-S. 
Cianeto e Azida: 
Bloqueiam o fluxo de elétrons entre o citocromo a-a3 e O2 (complexo IV). 
 
Esquema da cadeia de transporte de elétrons (CTE): 
 
 
Reproduzido de Lehninger – Principles of Biochemistry, Nelson, DL, Cox, MM, Eds, 3a Ed, pag. 672, 2000. 
 
Outros substratos também podem ceder seus elétrons para CoQ, mas não através do Complexo II. 
Por exemplo, a 1a etapa da -oxidação (processo de oxidação sofrido pelos ácidos graxos 
componentes dos triacilglicerídeos), catalisada pela acil-CoA desidrogenase, proteína também 
dependente de FAD, envolve a transferência de elétrons do substrato para o FAD e, após outras 
etapas, até CoQ. Também, o glicerol 3-P (formado a partir do glicerol liberado pela hidrólise dos 
triacilglicerídeos ou pela redução da di-hidroxiacetona-P, oriunda da via glicolítica), devido à 
catálise da enzima dependente de FAD, acaba por reduzir a CoQ. A coenzima Q reduzida (QH2) é 
re-oxidada pelo complexo III, a próxima etapa da cadeia de transporte de elétrons. 
Nas leveduras, a SDH sofre repressão em presença de glicose, isto é, para as células, parece ser 
mais econômico produzir etanol do que oxidar totalmente a glicose através da cadeia respiratória. 
Observou-se que o gene responsável pela síntese de uma das proteínas dos centros Fe-S não é 
transcrito; ademais, o RNA-m, em presença de glicose, é rapidamente hidrolisado (Schiffer, I.M., 
de la Cruz, B.J. e Prieto, S., Control of m RNA turnover as a mechanism of glucose repression in 
Saccharomyces cerevisiae, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 1998, 30, 
1175-1193). 
Na prática, a atividade da SDH será medida, na fração mitocondrial na presença de azida (NaN3), 
inibidor do complexo IV da CTE; o que obriga os elétrons, resultantes da oxidação do succinato, 
a serem “despejados” no DCPIP (aceptor artificial de elétrons). 
 
 
 
 
ROTEIRO DE PRÁTICA 
 
 
O X I D A Ç Õ E S B I O L Ó G I C A S 
 
MATERIAL 
 
 Fermento Fleischmann 
 Tampão fosfato de sódio 0,05 M pH 7,4 
 Tampão fosfato de sódio 0,05 M pH 7,4 com 0,25M de sacarose - GELADO 
 Solução de DCPIP 15 g/mL em tampão fosfato de sódio 0,05 M pH=7,4 
 Solução de succinato 500 mM em tampão 
 Solução de malonato 500 mM em tampão 
 Solução de azida de sódio (NaN3) 500 mM em tampão 
 Solução padrão de Caseína 10 mg/mL 
 NaOH 20% 
 CuSO4 25% 
 Pérolas de vidro 
 Centrífugas 
 Misturador tipo Vortex 
 Espectrofotômetro 
 Aplicador de enzima 
 
OBJETIVO 
 
 Determinação da atividade da SDH, em extrato bruto e na fração mitocondrial, através da redução 
do 2,6 diclorofenol indofenol (DCPIP). 
 Observação do aumento da atividade específica, por comparação entre o extrato bruto e fração 
mitocondrial. 
 Verificação da inibição da enzima pelo malonato. 
 
PROCEDIMENTO 
 
Obtenção do Extrato Bruto: 
 
Uso de prensa de Frensch 
 
As células são ressuspensas em tampão fosfato 0,05 M pH 7,4, contendo KCl 10 mM e MgCl2 5 
mM, na proporção de 45 g de peso úmido para 15 mL do tampão e submetidas à prensa. 
 
Uso de pérolas de vidro: 
 
 Em um tubo de centrífuga de 50 mL adicionar 3 g de Fermento Fleischmann (peso úmido) e 4 
mL de tampão fosfato 0,05 M pH 7,4; agitar em vortex até obter uma suspensão homogênea. 
 Adicionar 8 mL de pérolas de vidro. Vedar bem o tubo com Parafilm. 
 Agitar em misturador (velocidade máxima) por 2 minutos, resfriar por 2 minutos em banho de 
gelo. Repetir esta operação uma vez. 
 Verter o homogeneizado para outro tubo de centrífuga. CUIDADO: NÃO TRANSFERIR AS 
PÉROLAS DE VIDRO. 
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 Lavar as pérolas de vidro duas vezes com 4 mL de tampão fosfato 0,05 M pH = 7,4; transferir as 
águas de lavagem para o tubo com o homogeneizado. 
 Uma vez rompidas as células, o material é submetido à centrifugação a 4.000 rpm/10min. O 
sobrenadante é transferido para o tubo de ensaio e mantido em banho a 0 ºC. Esta preparação 
constitui o EXTRATO BRUTO. 
 
Obtenção da fração mitocondrial(FM) 
 
Parte do volume obtido (cerca de 45 mL) é centrifugado 25.000 g /30 min. e ressuspenso em 15 mL de 
tampão fosfato 0,05 M pH 7,4, gelado, contendo 3 g de sacarose. A solução é homogeneizada em 
“potter” para obter as vesículas da fração mitocondrial. Esta preparação constitui a FRAÇÃO 
MITOCONDRIAL e deve ser mantida em banho a 0 oC 
 
Ensaio de succinato DCPIP redutase com o extrato bruto e com a fração mitocondrial 
 
Método descontínuo: 
A enzima é ensaiada, como mostrado na tabela a seguir, tanto no Extrato Bruto como na Fração 
Mitocondrial. O tempo é contado após a adição do homogeneizado (EB) ou da fração mitocondrial 
(FM) e a Abs a 600 nm deve ser anotada de 15 em 15 segundos até o tempo total de 2 min, zerando 
o aparelho com o conteúdo do tubo 2. A Abs do tubo 1 também deve ser medida a 600 nm, 
empregando água destilada como referência. 
 
TUBO 
DCPIP 
(mL) 
T.Fosfato 
(mL) 
Azida 
(mL) 
succinato 
(mL) 
malonato 
(mL) 
EB ou FM 
(mL) 
Abs 
600 nm 
1 3 1,45 0,05    
2  4,35 0,05   0,1 
3 3 1,35 0,05   0,1 
4 3 1,25 0,05 0,1  0,1 
5 3 1,15 0,05 0,1 0,1 0,1 
6 3 1,25 0,05  0,1 0,1 
 
Método contínuo: 
A enzima é ensaiada, como mostrado na tabela a seguir, tanto no Extrato Bruto como na Fração 
Mitocondrial. A adição do homogeneizado (EB) ou da fração mitocondrial (FM) é feita com 
auxílio de um aplicador acrílico e após esta adição, inicia-se a reação que é acompanhada por 
leitura da Abs a 600 nm de modo contínuo, empregando-se uma interface para acoplar o 
espectrofotômetro ao computador e permitir o registro da reação em gráfico na tela do monitor por 
um tempo total de 2 min. Estes registros devem ser guardados para análise dos resultados. 
 
TUBO 
DCPIP 
(mL) 
T.Fosfato 
(mL) 
Azida 
(mL) 
succinato 
(mL) 
malonato 
(mL) 
EB ou FM 
(mL) 
Abs 
600 nm 
1 3 1,35 0,05   0,1 
2 3 1,25 0,05 0,1  0,1 
3 3 1,15 0,05 0,1 0,1 0,1 
4 3 1,25 0,05  0,1 0,1 
 
 
 
Em ambos os casos, os dados anotados e os registros gravados devem ser convertidos em planilha 
eletrônica com o uso de programa apropriado. 
De acordo com os estudiosos em cinética, a curva de progresso de uma reação enzimática é melhor 
representada por uma equação polinomial de terceiro grau. Portanto os dados e registros devem ser 
submetidos à regressão para obtenção das equações que expressem a atividade enzimática. 
 
Dosagem de proteínas pelo Método de Stickland 
 
Tomar alíquotas de 0,1 mL do extrato bruto e da fração mitocondrial, fazer as diluições apropriadas 
e determinar o teor de proteínas - utilizar como padrão solução de proteínas a solução de caseína 
10 mg /mL 
 
Método de Stickland 
 
Reagentes: Solução 1: NaOH 20% 
 Solucão 2: CuSO4,5H2O 25% 
Sensibilidade: 1 a 10 mg de proteína. 
Roteiro: Usar o volume conveniente de amostra e completar a 5 mL com H2O destilada. 
Adicionar 0,9 mL da solução 1 e 0,15 mL da solução 2 em cada tubo. Fragmentar o precipitado 
com bastão de vidro. Centrifugar a 3500 rpm/5min. Ler a Abs a 550 nm. 
 Determinar as equações obtidas para um dos experimentos. 
 Completar a tabela abaixo: 
Tubo Abs/s Abs/min 
Atividade 
g DCPIP red 
/min 
Atividade 
Específica 
g DCPIP red 
/mg 
Atividade 
Específica 
U/mg 
1