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Metabolismo Apostila

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mL) 
NADP 3,8mM 
(L) 
MgCl2 70 mM 
(L) 
G6P 20 mM 
(L) 
 400 250 100 
* O volume de extrato + tampão Tris = 2,2 ml 
 
O branco desta dosagem será o tampão Tris/HCl. 
A reação será iniciada pela adição do substrato G6P. Portanto este será o último reagente a ser 
adicionado. 
A dosagem da atividade de G6PDH se dará pelo acompanhamento do surgimento de NADPH a 340 
nm. 
Fazer a dosagem de atividade para o extrato sem ou com estresse oxidativo. 
Dado: Coeficiente de extinção () do NADPH a 340nm = 6,2237cm2 / mol 
A partir da curva de progresso de cada ensaio será determinada a velocidade inicial e calculada a 
atividade específica (UI/mg ptn). 
 
IV- Dosagem de Proteína 
 
Método do biureto modificado po Stickland 
Faixa de aplicação:1 a 10 mg de proteína 
 
Em um tubo de centrifuga adicionar a alíquota de extrato a ser dosada e completar o volume a 5 mL 
com água destilada. 
Colocar 0,9 mL de solução de NaOH 20% e em seguida 0,15 mL de solução de CuSO4 25%. 
Centrifugar a 4000 rpm por 5 minutos e ler o sobrenadante em espectrofotômetro a 550 nm. 
Dosar proteína nos extratos (com e sem estresse) em duplicata 
Metabolismo 
 
Instituto de Química • UFRJ 
287 
 
 
Tubo 
H2O 
(mL) 
Volume Amostra 
(mL) 
NaOH 
(mL) 
CuSO4 
(mL) 
Abs 550nm 
Branco 5,0 − 0,9 0,15 
Controle 4,9 0,1 0,9 0,15 
Controle’ 4,9 0,1 0,9 0,15 
H2O2 4,9 0,1 0,9 0,15 
H2O2’ 4,9 0,1 0,9 0,15 
 
 
Fator da curva padrão de proteína = 
 
Tubo 
Abs média 
550nm 
Conc.ptn 
(mg/mL) 
Controle 
H2O2 
 
 
V – Resultados 
 
Tubo 
Velocidade inicial 
(Abs/min) 
Velocidade inicial 
(mol/min) 
Massa de proteína 
no ensaio (mg) 
Atividade específica 
(mol/min.mg) 
Controle 
H2O2