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Metabolismo Apostila

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codificadas pelo DNA mitocondrial. 
Por outro lado, além de sensores para o O2, as células de levedura dispõem de mecanismo sensor 
da concentração de glicose externa. A repressão por glicose ou repressão catabólica significa a 
repressão de expressão de um grande número de genes. Neste caso, a glicose é abundante e 
quase todos os requerimentos energéticos podem ser supridos pela glicólise. Dentre os genes 
sensíveis à repressão catabólica estão os responsáveis pela codificação de proteínas 
mitocondriais necessárias para respiração e fosforilação oxidativa. O fenômeno repressão 
catabólica é conhecido há, pelo menos, trinta anos e, embora muito estudado, ainda não estão 
completamente esclarecidas as etapas envolvidas em todo o processo; parece que 
sensores/receptores produzem um sinal transmembrana que percorre a célula e afeta o nível dos 
transportadores de hexoses. Desta maneira, a concentração de glicose externa regula seu próprio 
transporte, ajustando-o às suas necessidades energéticas. Esta sinalização inicial dispara nova 
série de outros mecanismos e sinais que atingem o núcleo celular, reprimindo ou ativando um 
conjunto de genes. 
 
Metabolismo 
 
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231 
 
 
 
Reproduzido de C.L. Flores e cols. FEMS Microb. Ver. (2000), 24, 507-529. 
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ROTEIRO DE PRÁTICA 
 
 
CRESCIMENTO CELULAR 
CURVA DE PESO SECO 
 
MATERIAL 
 
 Fermento fresco de panificação (Saccharomyces cerevisiae) 
 Placas metálicas 
 Membranas para filtração 
 Bomba de vácuo 
 Kitasato 
 Balança analítica 
 Espectrofotômetro 
 Lâmpada infravermelha 
 Centrífuga 
 
OBJETIVO 
 
 Determinar o fator de correlação entre a massa seca de células e a Absorvância da 
suspensão celular. 
 Acompanhar o crescimento microbiano 
 
PROCEDIMENTO 
 
 Pesar cerca de 5 g de fermento de panificação 
 Lavar exaustivamente com água destilada gelada até obter o sobrenadante 
completamente límpido 
 Preparar uma suspensão de 20 mg de massa úmida/mL em balão volumétrico 
 Pesar o conjunto placa metálica + membrana em balança analítica de quatro casas 
decimais. Anotar o peso P1. ATENÇÃO: Nesta operação utilize sempre uma 
pinça. 
 Filtrar a vácuo, através da membrana previamente pesada, 5 mL da suspensão 
celular 20 mg de massa úmida/mL. ATENÇÃO: Homogeneizar muito bem a 
suspensão antes de pipetá-la. 
 Transferir a membrana com as células para a placa metálica correspondente. 
 Transferir o conjunto para secagem sob lâmpada infravermelha. Aguardar cerca 
de 2 horas. 
 Após a secagem, pesar o conjunto placa metálica + membrana + células secas. 
Anotar o peso P2. 
 Preparar, a partir da suspensão de 20 mg de massa úmida/mL, outras suspensões 
diluídas em água destilada: 100, 70, 50, 30, 25 e 20 vezes. 
 Ler a Absorvância a 570 nm, zerando o aparelho com água destilada. 
 
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CÁLCULOS 
 
 Massa seca de células (mg de massa seca/mL) M= (P2 – P1)/5. 
 Massa seca de células nas soluções diluídas (mg de massa seca/mL) M/fator de 
diluição. 
 Preencher a tabela a seguir : 
 
Tubo Fator de Diluição Abs (570 nm) [células] mg/mL 
1 100 
2 70 
3 50 
4 30 
5 25 
6 20 
 
 
 Traçar o gráfico: Abs (570 nm) versus [células] mg/mL. Calcular o fator. 
 
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ROTEIRO DE PRÁTICA 
 
 
MÉTODOS ANALÍTICOS PARA 
ACOMPANHAMENTO DO CRESCIMENTO 
E VIABILIDADE DAS CÉLULAS 
 
 
QUANTIFICAÇÃO CELULAR 
 
Há diversas técnicas, diretas e indiretas, que permitem o acompanhamento do crescimento 
celular, porém nos deteremos àquelas mais utilizadas. 
 
PESO DE MATÉRIA SECA 
 
Esta técnica, mais conhecida por “peso seco”, consiste em tomar uma alíquota do cultivo de 
células que, após lavagem e filtração, é levada à secagem até ser atingido peso constante. 
 
Procedimento Experimental 
 
 Pesar as placas metálicas (recepiente de apoio para o filtro) com o filtro. P1 
 Transferir o filtro para o equipamento de filtragem a vácuo, lavar o filtro para melhor 
aderí-lo ao equipamento e filtrar 5 mL do cultivo celular. 
 Durante a filtração, lavar as células com igual volume de água destilada. Este 
procedimento deverá ser repetido mais uma vez. 
 Após a filtração, desligar o vácuo, retirar o filtro contendo as células e transferí-lo para a 
placa metálica, levando o conjunto para secagem (através de uma fonte luminosa de 
infra-vermelho), até atingir peso constante. P2 
Observação: Utilize pinça apropriada para manusear as placas e filtros evitando que haja 
aderência de gordura das mãos nas paredes. 
 
Cálculos 
Sejam: P1: peso da placa metálica + filtro 
P2: peso do conjunto placa-filtro-células secas 
P: peso das células secas (P= P2 - P1) 
V: volume da alíquota 
 
A concentração celular média (X’), em mg de matéria seca/ mL de meio, 
para n alíquotas, é dada por: = V
P
n
X
1
´ 
 
Alíquota 
n 
P1 (mg) P2 (mg) P (mg) V (mL) 
X = P/V 
(mg/mL) 
1 
2 
3 
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ABSORVÂNCIA RELACIONADA COM PESO SECO DE CÉLULAS 
 
Esta técnica parte do princípio de que uma suspensão celular, dentro de uma determinada faixa 
de concentração, segue a Lei de Lambert-Beer, sendo possível, desta forma, relacionar a 
concentração com a absorvância. 
 
Preparo da curva padrão 
 
 Determinar a concentração celular de acordo com o método anterior. 
 Do cultivo celular, fazer diluições adequadas e ler a absorvância a 570 nm. 
 Relacionar a concentração celular com a absorvância, dividindo o valor de X (mg/mL) 
pelo fator de diluição de cada ponto. 
 Traçar o gráfico Abs versus X (mg/mL) e calcular o coeficiente angular. 
 
Observação: 
Faça no mínimo 4 diluições diferentes para leitura da absorvância. 
Caso o microrganismo a ser quantificado não seja Saccharomyces cerevisiae, determine o 
comprimento de onda a ser utilizado de acordo com o espectro de absorção. 
Cada fator corresponde a um determinado aparelho. 
 
Tubo Diluição Abs (570 nm) 
Concentração = X’/Diluição 
(mg/mL) 
1 
2 
3 
4 
 
Coeficiente angular (Abs X C) = __________mL/mg 
 
Fator peso-seco = _________mg/mL (para aparelho n° _____) 
 
 
CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO 
 
É um método rápido, mas a precisão depende do técnico e do número de contagens feitas. Pode 
ser utilizado, inclusive, para determinar o número de células vivas (viáveis), como por exemplo, 
através do uso de azul de metileno. 
 
A câmara de Neubauer 
 
Inicialmente era utilizada para a contagem de hemácias, daí os nomes hemacitômetro ou câmara 
hematimétrica. Consiste em uma placa de vidro em cujo centro há dois campos escavados de 
igual profundidade. Sobre estes campos é colocada a lamínula, formando então um 
compartimento de volume conhecido, no qual a suspensão celular é introduzida. 
 
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Na placa cada campo é formado por matrizes de 5 x 5, conforme ilustrado abaixo. 
 
 
 
 
 
Detalhe da área de contagem Diagrama da matriz 5 X 5 
Detalhe de um dos 25 quadrados 
da matriz 5 X 5 
 
 
Na contagem, via de regra, utiliza-se um método estatístico, que consiste em contar 5 quadrados 
(os quatro quadrados dos vértices mais o quadrado central). Sendo assim, faz-se necessário 
adotar um critério que indique com clareza qual linha deve ser considerada para a contagem. 
Um bom critério, é considerar as linhas que delimitam os lados superior e direito do quadrado 
4x4, conforme indicado na figura anterior. Desta forma, são contadas as células que estejam 
dentro deste quadrado (4x4) e sobre as linhas mencionadas, não sendo contadas as células que 
estejam sobre as linhas à esquerda e abaixo. 
 
Aconselha-se fazer, no mínimo, 4 contagens para cada amostra. Para um bom resultado, a 
literatura recomenda

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