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Metabolismo Apostila

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que a diluição seja feita de modo que se tenha entre 40 a 60 células em cada 
um dos 25 quadrados. 
 
Procedimento experimental 
 
 Fazer uma diluição apropriada da suspensão de células. 
 Fixar a lamínula sobre o campo 
 Com o auxílio de uma pipeta Pasteur ou automática, introduzir a suspensão diluída no 
compartimento formado entre a lamínula e a câmara de Neubauer, de modo que todo o 
campo seja preenchido. 
 Proceder à contagem, utilizando um aumento de 400 vezes e luminosidade média. 
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Cálculos 
 
Sejam: N: número de células em cada quadrado 
V: volume de cada quadrado (V= 1/25 . 1 . 1 . 0,1 mm3 = 4 x 10-6 mL) 
N’: média de células para cada contagem 
X’’: concentração celular (células/mL) 
 
= NN
5
1
´ 
V
N
X
´
´́ = Para n contagens: = ´́
1
X
n
Xm 
 
Quadrado N (cel.) 
1 
2 
3 
4 
5 
 N 
 
N’ = 1/5  N = ________ cel. 
 
X’’ = Concentração de células no cultivo = (N’/V) X Dil. = __________ cel./mL 
 
 
ABSORVÂNCIA RELACIONADA À CONTAGEM 
 
É similar ao método da absorvância relacionada com o peso seco e fornece uma idéia 
aproximada da concentração celular em células/mL através da leitura da absorvância. 
 
Tubo Diluição Abs (570 nm) 
Concentração = X’’/Diluição 
(cél./mL) 
1 
2 
3 
4 
 
Coeficiente angular (Abs x C) = __________mL/cél. 
 
Fator célula = _________ cél./mL (para aparelho n° _____) 
 
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DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR 
 
 
CONTAGEM DE CÉLULAS CORADAS COM AZUL DE METILENO 
 
Deve-se proceder como descrito na metodologia de contagem, sendo que no caso da análise do 
número de células viáveis deve-se proceder a uma diluição da suspensão de células na proporção 
de 1 mL de corante azul de metileno 0,1% para 1 mL de cultivo em 20 mL de volume total. As 
células azuis são as não viáveis. 
 
 
DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE POR PLAQUEAMENTO EM MEIO SÓLIDO 
 
Procedimento experimental 
 
 Inocular, assepticamente, uma alíquota de 0,1 mL de suspensão celular diluída em placa 
de Petri contendo meio de crescimento sólido. A diluição deve ser efetuada 
assepticamente, utilizando tubos contendo cada um 10 mL de tampão fosfato de sódio 50 
mM, pH 6,0, e de modo a serem inoculadas cerca de 100 células em cada placa. 
 As placas serão então colocadas em estufa a 28°C/ 48 h para desenvolvimento de 
colônias macroscópicas. 
 Contar o número de colônias que se desenvolveram. 
 
Observação: 
Cada amostra deve ser plaqueada em , pelo menos, triplicata. 
 
Placa Volume plaqueado N° de colônias 
1 0,1 mL P1= 
2 0,1 mL P2= 
3 0,1 mL P3= 
N° médio de colônias em 0,1 mL =
++
=
3
321 PPP
C 
 
N° de células viáveis no cultivo = [C / 0,1 mL] x Diluição = 
 
 
 
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ROTEIRO DE PRÁTICA 
 
 
CRESCIMENTO CELULAR DE UM MICRORGANISMO 
E CONSUMO DE UM NUTRIENTE ESSENCIAL 
 
 
MATERIAL 
 
 Meio de cultura - YED (extrato de levedo 1%, glicose 2%) 
 Material biológico - cultivo de células de levedura (Saccharomyces cerevisiae) em 
meio YED 
 Reagente ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS) em meio alcalino 
 Solução de glicose padrão - 10 mol/mL 
 Agitador a velocidade controlada 
 Espectrofotômetro 
 
 
OBJETIVO 
 
 Acompanhar o aumento de massa e/ou do número de células de um 
microrganismo em um meio de cultura balanceado. 
 Verificar o simultâneo desaparecimento de um nutriente (fonte de carbono) 
presente neste meio. 
 
 
PROCEDIMENTO 
 
 De hora em hora, retirar do meio de cultura com células em suspensão, uma 
alíquota de aproximadamente 4 mL. 
 
 Homogeneizar bem a suspensão obtida, em cada tempo de crescimento e separar 
1,0 mL para outro tubo de ensaio com a finalidade de acompanhar o crescimento 
da cultura. Os 3,0 mL restantes serão utilizados para a dosagem de glicose 
residual. 
 
 Crescimento da cultura - Fazer uma diluição de .... na amostra e avaliar a 
turbidez da suspensão celular em espectrofotômetro no comprimento de onda de 
570 nm. Utilizar água destilada como Branco. 
 
 Glicose residual - Centrifugar os 3 mL da amostra a uma velocidade de 3000 
rpm/5 minutos, após o que verter o sobrenadante para outro tubo. Tomar alíquotas 
de .... mL para dosagem de glicose pelo método do DNS. 
 
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 Preencher o quadro abaixo com os valores obtidos ao longo do crescimento. 
 
Crescimento 
(h) 
Crescimento celular 
Fator: 
Glicose residual 
Fator: 
diluição Abs 570 nm mg/mL diluição alíquota Abs 540 nm 
glicose 
(g/100mL) 
0 
1 
2 
3 
4 
 
Obs: Utilizar o fator da curva-padrão de glicose ou o obtido com duas ou três alíquotas da 
solução padrão de glicose 10 mol/mL. 
O fator de conversão de Abs em [células] é retirado de uma curva de peso seco. 
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ESTUDO DIRIGIDO 
 
 
1) Inoculou-se 48 mg de S.cerevisiae em erlenmeyer contendo 100 mL de meio YED 
1%. De hora em hora retiram-se alíquotas do meio de cultivo para a medida do 
crescimento celular e glicose residual. 
 
CRESCIMENTO CELULAR GLICOSE RESIDUAL 
Tempo 
(h) 
Diluição 
Abs 
(570nm) 
Tempo 
(h) 
Diluição 
Abs 
(540nm) 
1 1:2 0,2 1 1:10 0,55 
2 1:5 0,08 2 1:10 0,55 
3 1:5 0,115 3 1:10 0,47 
4 1:5 0,16 4 1:10 0,37 
5 1:5 0,23 5 1:10 0,21 
6 1:10 0,16 6 ⎯ 0,04 
7 1:10 0,16 7 ⎯ 0,00 
 
Com os dados acima: 
a) construa a curva de crescimento, sabendo-se que o fator de conversão de 
absorvância à 570 nm para mg de células/mL é 1,2. 
b) construa a curva de consumo de glicose, sabendo-se que uma absorvância de 0,4 
corresponde a 4 mol de glicose mL. 
c) a partir do gráfico determine o tempo de LAG e o tempo de geração. 
d) calcule o tempo de LAG e o tempo de geração através da fórmula: 
n = no 2
Z (Z = t/Tg). 
e) por que no tempo de 7 horas as células pararam de crescer? 
 
2) Esquematize uma curva de crescimento típica para um microrganismo capaz de 
crescer seqüencialmente em um nutriente e em um excreta, identificando e 
caracterizando cada uma das fases. 
 
3) Em um erlenmeyer que contém 100 mL de meio, as células crescem com a 
velocidade específica de crescimento igual a 0,345 h-1. A concentração de glicose 
originalmente presente neste meio é tal que diluída 20 vezes fornece, pelo método de 
DNS, uma Abs correspondente a 0,5 mg/mL. 
Calcule a porcentagem de glicose consumida após 4 hs de crescimento sabendo-se 
que a duplicação da massa de células inicial implica em um consumo de 200 mg de 
glicose e que se mantém constante durante todo o crescimento. 
 
4) A relação entre o crescimento total de uma bactéria e a concentração de ácido cítrico, 
em um meio de cultura contendo citrato e sal de amônia, em condições anaeróbicas, 
é linear até uma concentração de citrato igual a 6 x 10-2 M; tal concentração suporta 
uma população de 9,50 x 106 células/mL. Concentrações mais altas de citrato não 
produzem maior número de células. 50 mL de um meio contendo ácido cítrico, em 
quantidade não conhecida foram inoculados com a bactéria em condições de 
anaerobiose fornecendo uma população de 7,25 x 106 células/mL na fase 
estacionária. Quantos mg de ácido cítrico estavam presentes no meio? 
PM do ácido cítrico = 192 
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5) Inocularam-se 7,12 g (massa seca) de células de Saccharomyces cerevisiae em 
erlenmeyer de 500 mL, contendo 100 mL de meio YED 3% (extrato de levedura 1% 
e glicose 3%). Após 18 horas de cultivo, foram retiradas alíquotas para o 
acompanhamento do crescimento microbiano através da medida de absorvância da 
suspensão celular a 570 nm. Os resultados de tais medidas encontram-se na tabela 
abaixo. 
 
tempo de cultivo 
(horas) 
diluição da 
alíquota 
Abs a 570 nm 
18,0 1:2 0,14

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