Buscar

Apostila Processamento de Material Biológico

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes
Você viu 3, do total de 13 páginas

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes
Você viu 6, do total de 13 páginas

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes
Você viu 9, do total de 13 páginas

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você também pode ser Premium ajudando estudantes

Prévia do material em texto

Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
Resumo: Processamento de material biológico para 
inclusão e cortes em parafina. 
 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 
Processamento de Material 
Biológico – Microscopia Óptica 
 
 O objetivo deste texto é oferecer ao estudante da Área III e 
aos participantes do CONIC, o conhecimento da técnica de 
processamento de espécimen biológico, para inclusão e cortes 
em parafina, coloração pela Hematoxilina e Eosina e, montagem 
final permanente, o que denominaremos de “preparação histológica”. 
 
 
Introdução 
 
 
 Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente com o 
aperfeiçoamento dos métodos de investigação. A princípio, o uso do microscópio 
composto possibilitou o descobrimento das células e a elaboração da teoria, 
segundo a qual, todos os seres vivos são constituídos por células (Teoria Celular). 
 Posteriormente, foram descobertas técnicas citoquímicas que possibilitaram 
a identificação e localização de diversas macromoléculas constituintes das células. 
Com o advento do microscópio eletrônico, foram observados pormenores da 
estrutura celular que não eram sequer imaginados pelos estudos feitos com o 
microscópio óptico. 
Embora seja possível o estudo microscópico de células vivas, existem 
muitas vantagens em obter uma preparação permanente, na qual as células ficam 
preservadas, isto é, fixadas e coradas, para melhor demonstração de seus 
componentes. 
 Para processarmos material biológico para inclusão em parafina, 
previamente, elaboramos um plano de trabalho, onde levamos em consideração: a 
escolha do animal (devemos nos preocupar com a preservação da fauna), as 
peças anatômicas a serem coletadas, as etapas da técnica histológica a serem 
utilizadas, listagem do material cirúrgico e dos reagentes, entre outros, para que 
possamos alcançar o objetivo final, que é a preparação histológica. 
 Denomina-se preparação histológica, ao “sanduíche” composto por duas 
superfícies de vidro, uma, medindo 76mm x 25mm x 1mm, denominada de lâmina 
e, outra, de formato, comprimento e largura variáveis, mas de espessura NUNCA 
superior a 0,17 mm, conhecida por lamínula e, como “recheio”, o tecido ou 
esfregaço. As preparações histológicas, de acordo com sua perenidade, são 
classificadas em: 1. Permanente (Mediato) - apresentam tempo de vida útil muito 
longo, e; 2. A Fresco (Imediato) – de vida útil muito limitada. 
O processamento histológico pode ser dividido em várias fases : 
 
 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 
 
Coleta do material 
 
O material para a confecção de preparações histológicas é 
coletado, na maioria das vezes, de animal de laboratório, como por 
exemplo, rato, camundongo, coelho, etc. 
A manipulação de animais, para a obtenção de biópsias 
e/ou peças anatômicas para fixação das mesmas, deve ser 
precedida sempre que possível, de narcose. Esta deve ser lenta e 
gradativa, manipulando-se os animais quando estiverem completamente 
anestesiados. A narcose é recomendável não apenas no sentido de evitar o 
sofrimento do animal, mas também, evitar contrações e distensões anormais das 
peças. 
 A anestesia pode ser por gás, líquido ou sólido. Dependendo do organismo 
e do anestésico, pode ser administrado por via oral, intramuscular, subcutânea, 
intraperitoneal ou endovenosa. 
 O anestésico mais comumente usado é o éter etílico; pequenos mamíferos 
como ratos, camundongos cobaias e mesmo coelhos, são colocados num 
recipiente contendo algodão saturado com éter, até adormecerem profundamente. 
Outro exemplo é o nembutal (pentobarbital sódico), administrado via endovenosa 
ou intraperitoneal, variando-se a dosagem de acordo com o animal. Para o rato, 
administra-se uma dose de 50 mg/Kg de peso corporal, via subcutânea. A 
anestesia dura aproximadamente 1 hora. 
Na prática, usando-se câmara anestésica, produtos farmacêuticos de usos 
anestésicos e meios de aplicação apropriados, promove-se a anestesia do animal. 
Enquanto durar o efeito do anestésico, através de técnicas cirúrgicas indicadas, 
faz-se a coleta das peças anatômicas, iniciando pelas mais sensíveis à autólise. O 
animal anestesiado deve ser mantido vivo durante a coleta e as peças anatômicas 
coletadas no menor tempo possível, a fim de evitar a autólise. Por vezes, 
administramos o fixador via endovenosa, o que propicia uma fixação melhor e 
mais uniforme, das peças anatômicas. Nesses casos, terminadas as coletas dos 
espécimens, os mesmos são colocados em frascos contendo o líquido fixador em 
uso e, o animal é descartado. 
 
 
Fixação 
 
 A fixação é o processo que consiste no uso de substâncias fixadoras, cujo 
objetivo principal é o de estabilizar e preservar os componentes celulares, das 
peças anatômicas, como se estivessem vivos. 
 
 
 
 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 
 
Na fixação, como em qualquer etapa do processamento 
histológico, é muito importante controlar os parâmetros (ou 
variáveis), tais como: concentração, temperatura, pH, 
soluções diluentes (ex: tampões), osmolaridade, agitação 
e tempo, seja da solução fixadora, seja das demais 
soluções utilizadas no decorrer do processamento 
histológico. Particular atenção deve ser dada ao tamanho 
da peça anatômica a ser coletada, ou seja, quanto 
MENOR, melhor será a penetração dos líquidos (fixador, 
desidratante e outros) em seu interior. 
 Fixadores são agentes empregados para manter inalteradas, o quanto 
possível, as estruturas celulares das peças anatômicas, após sua retirada do 
animal. 
 As peças anatômicas, normalmente são coletadas e imersas no líquido 
fixador. Entretanto, recomenda-se que os fixadores sejam perfundidos no animal, 
via subcutânea ou intravenosa e, a peça, após ser removida, seja colocada no 
mesmo fixador em um recipiente. 
 Um bom fixador deve apresentar: 
1. penetração rápida e vigorosa - atuar rapidamente com a mesma eficácia, 
fixando igualmente tanto as camadas superficiais quanto as mais 
profundas; 
2. evitar a autólise e impedir a proliferação bacteriana; 
3. coagular as proteínas, de forma moderada; 
4. conservar os detalhes estruturais tão próximos quanto possíveis 
daqueles que apresentam “in vivo”; 
5. promover o endurecimento relativo das peças anatômicas, dando às 
estruturas uma consistência semi-sólida; 
6. impedir o aparecimento de estruturas artificiais; 
7. aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes. 
 
Classificação - os agentes fixadores podem ser classificados, de acordo com o 
quadro da página seguinte, em Físicos e Químicos. 
 Normalmente, os agentes químicos são preferidos para o estudo das 
células e dos tecidos. Esses agentes são subdivididos em Simples, quando 
constituídos de um só componente e de Misturas fixadoras, quando formados 
por mais de um componente. 
 Dentre os agentes fixadores simples, o mais freqüentemente usado é o 
formaldeído, um gás preparado em solução saturada que recebe o nome de 
formol ou formalina, cuja diluição varia ao redor de 40% (p/v). Nesta diluição, 
denominada de formol comercial, é um líquido incolor, odor picante e sabor 
cáustico. Seus vapores irritam às mucosas nasais e nasofaríngeas. O formol é 
muito miscível com a água e o álcool e não com o éter e clorofórmio. Pela 
presença do aldeído, o formol comercial, espontaneamente, em contato com o ar 
sofre oxidação; isto aumenta o teor de ácido fórmico, que além de perturbar suaNoções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
ação fixadora, forma precipitados nas peças e destrói as 
células mucosas com acentuada deteriorização 
citoplasmática, sendo preferível, por isso, usar-se formol 
neutro. O formol penetra bem, mas de forma lenta, o que 
exige aumento do tempo de fixação e a coleta de peças de 
dimensões as mais reduzidas possíveis. 
 Na prática, utiliza-se rotineiramente, o formol neutro 
a 10%. O tempo de fixação previsto varia de 6 a 24 horas. 
 
 
 
 
 
 
Classificação 
 
Agentes 
Fixadores 
Físicos 
 Calor 
 
 Frio 
 
Químicos 
Simples 
 
Ácidos 
Inorgânicos 
 Tetróxido de Ósmio 
 Tetróxido de Cromo 
 
Sais Metálicos 
Dicromatos de K+, Na+, 
Mg++,Zn++,Ba++,Ca++,Cu++ 
Dicloreto de Mercúrio 
 
 
Ácidos 
Orgânicos 
 
Ácido Acético 
Ácido Tricloroacético 
Ácido Pícrico 
 
Redutores 
Formol-aldeído fórmico 
Álcool Metílico 
Álcool Etílico 
Acetona - Propanona 
 
Misturas 
Fixadoras 
 Bouin 
 Zenker 
 FAA – Formol/Ácido Acético/Álcool 
 
 Com o objetivo de completar a ação de um fixador simples, aumentando 
suas boas qualidades e atenuando seus defeitos, tornou-se freqüente o emprego 
de misturas fixadoras. As misturas mais comumente usadas são: BOUIN, 
ZENKER, ALFAC (ou FAA), etc. 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 A mistura de Bouin possui boa penetração, com um tempo médio de fixação 
variando de 04 a 24 horas; é excelente para uso geral, 
fixando bem proteínas e o glicogênio, precipitando os ácidos 
nucléicos, tornando-os mais evidenciáveis. 
 A solução de Zenker fixa bem o núcleo celular e se 
presta a muitas técnicas de coloração, inclusive aquelas 
seletivas. O tempo médio de fixação para peças pequenas 
varia de 06 a 12 horas e, para as maiores, até 24 horas. 
 A mistura Alfac (ou FAA), que ao contrário de muitas 
outras, não recebe o nome de seu criador, e sim, designado 
pelas inicias de seus componentes, penetra 
satisfatoriamente e com relativa rapidez, mantém a peça 
sob uma consistência adequada, não interfere na coloração 
a ser utilizada e serve como fixador para determinados estudos histoquímicos. 
Utiliza-se um tempo de fixação que varia de 06 a 12 horas. 
 
Desmineralização ou Descalcificação 
 
É a retirada dos sais minerais das peças histológicas normalmente 
mineralizadas, como os ossos e dentes, ou daquelas que, anormalmente, se 
tornaram sedes de depósitos dos mesmos. Para a obtenção de cortes ao 
micrótomo, é necessário a retirada dos sais minerais e utiliza-se para tal, os 
agentes desmineralizadores (ou descalcificadores). 
 Os agentes usados para a desmineralização variam desde os ácidos 
inorgânicos ou orgânicos (exemplo: solução de Perenyil) até os quelantes 
(E.D.T.A). Os primeiros (ácidos) atuam retirando os íons metálicos (cátions) e 
com eles tendem a formar sais solúveis; promovem alterações consideráveis na 
peça histológica. Já os quelantes, promovem a retirada dos íons metálicos das 
estruturas sem se combinarem com eles, formando sais; por conseqüência, 
praticamente não causam alterações no material e, assim, são os preferidos para 
a desmineralização. 
 Após a fixação, o excesso deste líquido deve ser removido, antes da 
desidratação, e assim, minimizar uma possível reação entre o fixador e o agente 
desidratante. É aconselhável lavar a peça com o líquido diluente do fixador. 
 
Desidratação 
 
 A desidratação é necessária porque usualmente, a parafina (ou outros 
meios de emblocagem) não é miscível com a água. Assim, toda a água do fixador 
(se existente) e da lavagem, no espécimen, deve ser substituída por um solvente 
orgânico. A retirada da água, tanto do interior das células quanto das substâncias 
intercelulares é realizada através do uso de uma bateria crescente de álcool 
etílico, miscível com a água e com o agente diafanizante (a ser usado, a seguir); 
dessa forma, evita-se alterações estruturais irreversíveis na peça. A substituição 
da água por álcool torna as peças histológicas resistentes, indeformáveis e 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
macias. Outros agentes desidratantes utilizados são os álcoois metílico, amílico e 
butílico, o clorofórmio, e a acetona. 
 Na prática, utiliza-se a seguinte bateria crescente de álcool etílico: 
 Álcool 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, Absoluto (I, II e III) 
- 30 a 60 minutos cada, trocando a solução, pelo menos, 
três vezes cada. 
 
Diafanização 
 
 Consiste na substituição do álcool pelo agente 
diafanizante, o qual confere a peça histológica seu alto 
índice de refração, tornando-a translúcida, sendo assim, 
esta etapa, chamada diafanização. Como agentes 
diafanizadores utilizam-se o xilol, benzol, toluol, fenol ou o 
clorofórmio. Embora o xilol endureça muito as peças 
histológicas tornando-as friáveis, é universalmente mais usado. Existe a tendência 
de substituí-lo pelo benzol ou pelo toluol, que não apresentam este inconveniente. 
 O diafanizador tem obrigatoriamente, que ser miscível com o agente 
desidratante (álcool) e ser dissolvente da parafina, o que faz com que esta, 
penetre na intimidade dos tecidos, durante a fase seguinte do processamento 
histológico (impregnação). 
 Na prática, utilizamos o seguinte protocolo: 
 Xilol Puro - 3 banhos de 30 a 60 minutos cada. 
 
Impregnação pela Parafina 
 
É a fase na qual a peça histológica é imersa na parafina líquida, que 
penetra nos interstícios da mesma, ocupando completamente, todos os seus 
espaços. 
 À temperatura ambiente, a parafina apresenta-se em estado sólido, de cor 
branca, sendo solúvel nos agentes diafanizantes acima citados. A parafina é 
caracterizada pelos seus pontos de fusão; as denominadas brandas, fundem-se 
entre 40 a 50C e as chamadas duras, apresentam ponto de fusão em torno de 55 
a 65C. 
 Rotineiramente, utilizamos parafina com ponto de fusão intermediário, entre 
52 e 55C. Ela pode ser misturada com cera de abelha (5% cera / 95% parafina), 
carnaúba a 3% ou ainda, estearina, na proporção de 25g / 1000g de parafina. O 
acréscimo destes produtos à parafina, melhora sua plasticidade e facilita a 
microtomia. 
 Na prática, a impregnação de peças histológicas é feita na estufa, onde a 
temperatura está sempre 2 graus centígrados acima daquela do ponto de fusão da 
parafina. Freqüentemente usam-se dois ou três banhos sucessivos de parafina a 
fim de retirar de cada um deles, todos os vestígios do agente diafanizador que 
prejudicaria a qualidade do bloco, bem como, a perfeição dos cortes. 
 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Processador 
Automático 
Histotecnico 200 
(Reichert-Jung) 
 
 
 
 
 
Inclusão definitiva 
 
 A inclusão definitiva da peça na parafina que constituirá o bloco é feita num 
molde apropriado (barras de Leuckart - duas barras de chumbo em forma de L -, 
formas de papel, etc), no qual se despeja a parafina fundida e onde, com o auxílio 
de uma pinça é colocada a peça deixando-a em repouso até que a parafina se 
solidifique, depois de esfriar. Deve-se tomar o cuidado de colocar a superfície da 
peça que se quer cortar, voltada para o fundo do molde. A parafina usada para 
fazer o bloco não deverá ser nem muito mole (temperatura de fusão baixa) - o que 
não permitiria fazer cortes finos - nem muito dura (temperatura de fusão alta), já 
que o aquecimento para fundi-la poderia deteriorar as peças. 
 
Noções básicas do processamento de material biológico ...Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Toalete do Bloco 
 
 A peça histológica, agora incluída na parafina, forma com 
esta o que denominamos de bloco. O toalete do bloco consiste 
em reduzir as dimensões do mesmo, removendo-se o excesso 
de parafina que venha dificultar, posteriormente, a microtomia. 
Em seguida, com o uso de uma espátula aquecida, fundimos a 
parafina da face do bloco contrária àquela que contenha a peça 
histológica incluída e o prendemos a um suporte de madeira, 
plástico ou metal. Através deste suporte, o bloco será preso ao 
porta-objeto do micrótomo. 
 
Microtomia (confecção de cortes) 
 
 A microtomia tem por finalidade cortar a peça histológica em fatias 
finíssimas, com espessura variando de 1 a 7 m, utilizando-se para isto um 
aparelho mecânico denominado micrótomo. 
 
 Histoembedder, 
da Reichert-Jung 
 
 Unidade compacta 
para execução de 
todo o processo de 
inclusão de material 
em parafina. 
Placa Fria 
Reservatório de 
Parafina Material a ser 
emblocado 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para a obtenção dos cortes, devemos proceder da seguinte maneira: 
 
1. uma navalha de aço é presa ao seu suporte no micrótomo; 
2. prender e orientar o suporte do bloco (madeira, plástico ou metal) no porta - 
objeto, do aparelho; inicia-se o movimento do bloco no sentido norte - sul até 
que passe pela navalha, fazendo uma secção ou corte; 
3. após várias secções realizadas e tendo o tecido cortado em toda a sua 
extensão, regula-se a micragem (espessura do corte) desejada; 
4. a cada giro completo (360 o) da manivela (seta negra) do micrótomo, o bloco 
passa pela navalha e novos cortes são confeccionados. 
 
Os cortes ficam ligados uns aos outros, surgindo uma fita 
de parafina com os cortes. 
A fita é transferida para um banho-maria (ou 
cristalizador) contendo água a 40 - 50C, para estiramento da 
parafina e, por conseqüência, dos cortes histológicos, a fim de 
não restarem dobras nos mesmos. 
A pescaria dos cortes é realizada, utilizando-se lâmina 
de vidro limpa, já contendo uma película (albumina / glicerina, 
v/v) na sua face que receberá o mesmo. Os cortes 
isoladamente, ou vários em fita, podem ser montados com o 
auxílio de um pincel sobre as lâminas nas quais ficarão colados. Escorre-se o 
excesso de água e coloca-se a lâmina, numa estufa (ou placa aquecedora) a 37C 
para total evaporação e colagem final do corte. 
Uma vez confeccionados os cortes histológicos e montados nas lâminas de 
vidro, o passo subseqüente será corá-los. Entretanto, os cortes estão imersos em 
parafina e a mesma deve necessariamente, ser removida. 
 
 
 Micrótomo para cortes de 
material emblocado em parafina ou 
plástico, da Reichert-Jung, 
modelo 2035. 
Tecido emblocado em 
parafina preso ao 
porta-espécimen (seta 
cinza) 
Navalha presa ao porta-objeto (seta 
branca) 
Êmbolo para o movimento 
do bloco, no sentido norte 
sul (seta preta) 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 
 
Desparafinização e Hidratação dos Cortes 
 
 A retirada da parafina é feita mergulhando-se a lâmina com o corte 
histológico em dois banhos sucessivos de xilol: 1o. banho - 3 minutos e 2o 
banho - 2 minutos. 
 O xilol, agora ocupando os espaços teciduais, em substituição à parafina, 
não é miscível com a água (normalmente, o diluente dos corantes). Assim, a 
substituição do xilol é realizada, lavando-se os cortes com álcool absoluto. 
A hidratação consiste na substituição paulatina, do álcool pela água, em 
uma bateria decrescente de álcool etílico, a saber: 
 
Prática: 
 
1o. banho de álcool absoluto - 2 minutos; 
 2o. banho de álcool absoluto - 2 minutos; 
 Álcoois 95%, 90%, 80%, 70% e 50% - 2 banhos cada, de 2 minutos; 
 Água corrente 5 a 15 minutos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Coloração pela Hematoxilina e Eosina 
 
A maioria dos elementos que constituem os tecidos é naturalmente incolor 
ou transparente. Para que eles se tornem visíveis no microscópio óptico comum e 
contrastem em relação uns aos outros, os cortes devem ser corados. 
 
 Histostainer Ig 
da Reichert – Jung 
Aparelho para 
coloração 
automática, com 
capacidade para até 
20 lâminas e 
memória para 10 
programas 
independentes. 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
 Coloração é o processo que consiste em submeter o corte histológico, já 
hidratado, à ação de um ou vários corantes. 
 Os corantes, substâncias ou agentes utilizados para corar, são constituídos 
por sais cujos cátions, ânions ou ambos, são coloridos. Quando somente o cátion 
do sal é colorido, diz-se que o corante é básico (ex: azul de metileno, 
hematoxilina). Quando apenas o ânion do sal é colorido, diz-se que o corante é 
ácido (ex: eosina). Quando ambos os íons são coloridos, considera-se que o 
corante seja neutro (ex: eosinato de azul de metileno) 
A maioria dos corantes usados em histologia (ácidos e básicos) tende a 
formar ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos. Os 
componentes dos tecidos que se coram com corantes básicos são chamados 
basófilos, sendo denominados de ácidófilos os que se ligam a corantes ácidos. 
A coloração dupla pela Hematoxilina - Eosina é a mais utilizada na rotina 
em Histologia. Existem várias fórmulas de preparo da hematoxilina, sendo as 
principais: Hematoxilina de Harris, Hematoxilina de Delafield, Hematoxilina de 
Mayer e Hematoxilina de Carazzi. A eosina pode ser preparada em solução 
alcoólica a 1% e solução aquosa a 2,5%. Além destes corantes, muitos outros 
também são utilizados. 
Na prática, o tempo médio de coloração dos cortes, pela Hematoxilina é de 
45 segundos, podendo atingir até 2 minutos (dependendo do tempo de uso do 
corante); em seguida, lava-se os cortes em água corrente 
(torneira) e deixa-os por mais dez minutos, para que ocorra a 
viragem para o azul. A viragem é obtida pela ação dos sais 
alcalinos terrosos existentes na água de torneira. Caso a água 
seja ácida, utiliza-se um pouco de carbonato de lítio para 
alcalinizá-la; passa-se os cortes rapidamente em água 
destilada, duas a três vezes. Submergem-se os cortes em 
solução aquosa de eosina a 1%, por 1 ou 2 minutos, obtendo-
se uma sobre-coloração. Lava-se em água destilada 
rapidamente e diferencia-se em álcool a 70%, até se obter a 
intensidade de coloração desejada. 
(Resultados: núcleos celulares corados em tonalidades 
de azul, roxo ou violeta, pela hematoxilina - e o citoplasma, variando do róseo ao 
alaranjado, pela eosina). 
Uma vez corados, os cortes deverão ser cobertos por uma lamínula, que irá 
protegê-los e preservá-los por longo tempo; este processo é denominado de 
montagem. Usualmente, o meio de montagem permanente mais utilizado, o 
bálsamo do Canadá, não é miscível com a água, presente nos cortes; dessa 
forma, torna-se imprescindível sua retirada. 
 
Desidratação, Diafanização e Montagem Final 
 
 A retirada da água das estruturas inter e intracelulares, é realizada através 
do uso de uma bateria crescente de álcool (70%, 80%, 90%, 95% - 1 minuto 
cada; Absoluto I, II e III – trocar 2 vezes, 10 minutos cada, totalizando 1 hora). 
Entretanto, o álcool também não é miscível com o meio de montagem permanente 
Noções básicas do processamento de material biológico ... Depto. Histologia 
 
Padovan, P.A.; Padovan, I.P.; Tavares, L.A. & Araújo Filho, J.C. 
e, assim, o agente desidratantedeve ser substituído por uma substância, que 
obrigatoriamente, deve ser miscível no álcool e no bálsamo do Canadá; utiliza-se 
como diafanizador, o xilol (álcool+xilol – 5 minutos, Xilol I e II – 15 minutos cada). 
Nestas circunstâncias, procede-se à montagem final dos cortes. 
A montagem final consiste em fechar o material (corte, esfregaço, etc) em 
um tipo de câmara constituída pela própria lâmina de vidro, que suporta o 
espécimen e uma lamínula de vidro. 
 A lamínula é colada sobre o material com o auxílio de uma resina natural 
(ou sintética) solidificável, meio altamente refringente, que 
serve ao mesmo tempo para aumentar a transparência dos 
cortes e conservá-los. O meio anidro de montagem mais 
usado é o bálsamo do Canadá, resina obtida da casca das 
árvores Abies balsamea e Abies canadensis ; dissolvido no 
xilol, seu índice de refração é de 1,532 e, ao secar (n = 1,535) 
é próximo ao do vidro de que é feita a lamínula ( n = 1,518), 
com o que se evita a perda de raios luminosos por refração. 
 O bálsamo do Canadá é um líquido espesso, 
transparente e amarelado. É parcialmente solúvel em álcool e 
completamente solúvel no xilol. A principal desvantagem do 
bálsamo do Canadá é que escurece e torna-se ácido com o 
tempo, devido a oxidação do xilol. Isso resulta em descoloração de corantes 
básicos (ex: hematoxilina). O bálsamo do Canadá não deve ser aquecido para 
fundir. Para evitar acidez, adiciona-se um pedaço de mármore no frasco contendo 
a resina. 
 Outros meios de montagem são utilizados, como por exemplo, o Entelan e 
o Permount; este último é transparente, neutro, seca rapidamente e possui índice 
de refração de 1,53. 
 
 
 
 
OBS: As fotografias dos equipamentos apresentadas neste 
texto foram copiadas dos catálogos dos “produtos 
histológicos Jung” oferecidos pela AOTEC Instrumentos 
Científicos Ltda (rua Afonso Celso, 1244 – 04119-061, São 
Paulo, SP), representante exclusiva para o Brasil da Leica 
Instruments GmbH – Nussloch, Alemanha – Produtos Jung, e 
da LEICA AG – Viena, Áustria, Produtos Reichert. 
	Processador Automático
	Histotecnico 200
	Placa Fria
	Reservatório de Parafina

Outros materiais