Dosagem de proteína pelo método de Biureto

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NUTRIÇÃO, UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA 
@larirodrigues.b 
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Dosagem de proteína pelo método de 
Biureto I 
 Como quantificar proteínas de uma 
amostra biológica? 
Muitos métodos podem ser empregados porém, 
para a escolha da técnica correta, fatores 
importantes devem ser considerados, como: 
 Natureza da proteína (enzima, 
solubilidade, tamanho, localização 
celular); 
 Presença de interferentes (tipos de 
solventes empregados nas etapas 
iniciais); 
 Rapidez; 
 Sensibilidade; 
 Eficiência. 
 
Muitos métodos para determinar proteínas 
utilizam técnicas espectrofotométricas. 
 
 Espectrofotômetro 
O Espectrofotômetro é um instrumento de 
análise capaz de medir e comparar a 
quantidade de luz (radiação eletromagnética) 
absorvida, transmitida ou refletida por uma 
determinada substância em solução. 
*Este equipamento será usado na aula prática. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Em geral, um espectrofotômetro possui uma 
fonte estável de energia radiante 
(normalmente uma lâmpada incandescente), 
um seletor de faixa espectral 
(monocromatizadores como os prismas, que 
seleciona o comprimento de onda da luz que 
passa através da solução de teste), um 
recipiente para colocar a amostra a ser 
analisada (a amostra deve estar em 
recipientes apropriados como as cubetas 
e tubos de ensaio) e, um detector de 
radiação, que permite uma medida relativa 
da intensidade da luz. 
A base da espectrofotometria, portanto é 
passar um feixe de luz através da amostra e 
fazer a medição da intensidade da luz que 
atinge o detector. O espectrofotômetro 
compara quantitativamente a fração de luz 
que passa através de uma solução de 
referência e uma solução de teste. 
 Espectrofotometria 
Técnica que baseia na absorção de luz (P) 
pela amostra a ser analisada (analito). 
A concentração da substância a ser 
quantificada na amostra é proporcional à 
quantidade de luz absorvida (Absorbância). 
Introdução 
A substância 
é colocada na 
cubeta para 
ser analisada 
Amostra 
Fonte 
de luz 
Monocromador 
(prima) 
https://www.infoescola.com/materiais-de-laboratorio/tubos-de-ensaio/
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Parte da luz incidida é absorvida pela 
substância e a outra parte emerge do lado 
oposto (Transmitância). 
A concetração do analito é proporcional à 
quantidade de luz absorvida ou transmitida. 
 
 
 
 
 
Se uma dada substância tem Absorbância 
nula, isso significa que ela possui 100% de 
Transmitância (Observe a escala acima) 
 Trasmitância (T) X Absrorbância (A) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Absorbância X Concentração de 
proteínas 
 
 Determinação Espectrofotométrica 
de Proteínas pelo método de 
Biureto 
Para que as proteínas do leite possam ser 
detectadas no espectrofotômetro, elas serão 
conjugadas com o reagente de Biureto para 
apresentar coloração: 
Método do Biureto se baseia em: 
Compostos contendo duas ou mais ligações 
peptídicas (proteínas) reagem com sais de 
cobre (Cu2+) resultando em uma solução de 
coloração violeta. Forma-se um Complexo 
de Coordenação. 
Sensibilidade do método: 1 a 5 mg/mL 
(mg de proteínas por mL de solução) 
 
 
 
Coloca-se o reagente de Biureto em contato 
com as proteínas em um meio básico e então 
as cadeias polipeptídicas vão interagir com 
os íons cúpricos do reagente. O resultado 
disso é uma solução colorida, na qual quanto 
mais intensa a coloração, mais proteínas 
conseguiram reagir com os íons. O 
espectrofotômetro vai dar uma relação 
numérica da intensidade de cor formada. 
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Ao final da prática, o estudante deverá ser 
capaz de aplicar o método de Biureto para a 
dosagem das proteínas do leite, e de calcular 
as concentrações das Caseínas e 
Lactoproteínas (Lactoalbumina e 
Lactoglobulina) no leite. 
 Definir e interpretar a lei de Lambert-
Beer; 
 Aprender a utilizar o espectrofotômetro 
para quantificar substâncias; 
 Construir o gráfico da absorbância em 
relação à concentração da substância 
(curva-padrão); 
 Utilizar a equação da reta e a curva-
padrão para determinar a concentração 
de proteínas no leite; 
 Aprender e calcular o fator de diluição de 
uma amostra; 
 Expressar o teor de proteínas de uma 
amostra de leite em mg/mL ou g/L; % 
(p/v) e % (p/p). 
 Preparo da Curva de Calibração (ou 
Curva Padrão) 
1. Preparar amostras-padrão para montar a 
Curva de Calibração de Proteína x 
Absorbância (contendo 1, 2, 3, 4 e 5 g/L 
caseína); 
 
 
 
2. Preparar o branco para a Curva de 
calibração (sem caseína, para leitura 
de absorbância do solvente = 0 g/L 
caseína); 
3. Selecionar o comprimento de onda: λ 
= 540 nm; 
4. Fazer a leitura do branco em zero para 
ajustar o equipamento e determinar a 
absorbância de cada amostra-padrão; 
5. Calcular a equação e projetá-la 
graficamente, tendo as 
Concentrações de Proteínas na 
abscissa (x) e as Absorbâncias (540 
nm) na ordenada (y). 
 
Após realizar as leituras das absorbâncias 
das amostras de leite, esta Curva de 
calibração (equação y=a.x+b) será utilizada 
para calcular as concentrações das 
proteínas nas amostras de leite de 
concentrações desconhecidas: 
Determinar A540 e converter em 
[Proteínas] usando a equação. 
 
 
 
 
 
 
 
 Soluções de proteínas de 
concentrações conhecidas 
(amostras-padrão) 
 
 
 
Obejtivo Geral 
Obejtivos Específicos 
Cuidados Necessários 
Procedimentos 
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 Cálculo da equação da reta linear 
 
 Preparo das amostras de leite 
Determinação da concentração de proteínas 
em amostras de leite desconhecidas: 
 
Quantificação das Proteínas do Leite 
 
Separadamente, calcular a concentração da 
amostra 1 e 2 usando os valores de 
absorbância (y = Abs540) obtidos pelas leituras 
no espectrofotômetro. Utilizar curva-padrão 
gerada das 5 soluções-padrão: 
 
 
 
 
Inicialmente enumera-se os tubos de ensaio 
de 0 a 5, sendo que o 0 é o branco e o 
restante diferentes concentraçõoes 
conhecidas de proteína. 
Para pepitar no tubo branco, utiliza-se 4 mL 
do reagente de biureto + 1 mL de água. 
(Coloca água no lugar da concentração 
conhecida de proteínas). Total = 5 mL. 
Adiciona-se 4 mL do reagente de bireto + 
de1g/L da solução-padrão nos outros tubos. 
Na amostra 1, retira-se a caseína para ficar 
apenas as lactoproteínas. Para isso, faz-se a 
precipitação utilizando ácido clorídrico, então 
realiza-se a titulação. 
O primeiro passo é diluir a amostra de leite 
(10 mL) com 10 mL de água. Agora está 
pronto para começar a titulação isoelétrica. A 
ideia é manter o leite sendo homogeneizado 
enquanto o ácido vai sendo gotejado aos 
poucos na amostra. 
Após um tempo a caseína 
fica precipitada e com a 
ajuda de um funil e um 
chumaço de algodão faz-se 
a filtração. 
Quando o filtrado do leite termina, faz-se o 
preparo da amostra 1 e 2. 
Na amostra 1, pipeta-se 1 mL de amostra do 
leite (que foi filtrado e que nela contém as 
lacoproteínas) + 4 mL do reagente de 
biureto. 
Na amostra 2, é preciso proceder com a 
diluição do leite. Pipeta-se 1 mL de leite e 
tranfere-se da proveta (já aferida) 19 mL de 
água. 
Desta amostra diluída pega-se 1 mL e 
coloca-se junto com 4 mL do reagente de 
biureto em dois tubos. 
 
 
Aula Prática 
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Deixa em repouso por um tempo para depois 
prosseguir para a leitura no espectrofotômetro. 
Foi feita a leitura da curva-padrão e os valores 
de absorvância serão apresentados adiante. 
Neste momento, faz-se a leitura das amostras. 
Resultados obtidos das amostras de leite: 
AMOSTRA I 0,172 
AMOSTRA II 0,101 
 
Resultados obtidos dos padrões: 
[CASEÍNA] g.L-1) A540nm 
0 0 
1 0,041 
2 0,084 
3 0,116 
4 0,165 
5 0,205 
 
1. Concentração de proteínas nasamostras 1 e 2 
 
2. Concentração de proteínas no leite: 
corrigir pelo fator de diluição 
 
 
3. Concentração de caseína no leite 
ou [Caseína] 
 
4. Teor de proteínas no leite (em %): 
 
 
 
 
 
 
 
Resultados e Discussão