Pesquisas em câncer

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-----------DESCOBERTA DE NOVOS FÁRMACOS-----------
➔ O processo de pesquisa e desenvolvimento de fármacos
(P&D) é complexo, longo e de alto custo. O impacto do
uso de medicamentos na sociedade tem várias facetas.
➔ A descoberta de novos medicamentos tem suas raízes
profundamente ligadas às inovações científicas e
tecnológicas.
➔ As etapas envolvidas no processo de P&D baseia-se,
simplificadamente, no estudo de compostos para o
tratamento de doenças.
➔ A primeira etapa consiste na descoberta de um
composto com atividade terapêutica.
- O Brasil é pioneiro nesse processo devido ao
isolamento do composto ativo retirado de produtos
naturais.
➔ Na segunda etapa são feitos testes in vitro e in vivo para
avaliação das propriedades biológicas das moléculas
obtidas.
➔ Na terceira e última etapa do processo são realizados
estudos clínicos em humanos, em várias fases, parte
denominada estudo clínico.
➔ Introduzir um novo medicamento na terapêutica é um
processo longo e bastante oneroso como citado
anteriormente. Todo o processo de P&D dura cerca de
doze anos (pode ser maior), com probabilidade de
sucesso muito pequena.
➔ Assim, de cada 30.000 moléculas sintetizadas, 20.000
(66,7%) entram na fase de estudos pré-clínicos, 200
(0,67%) entram na fase I dos estudos clínicos, 40
(0,13%) passam para a fase II, 12 (0,04%) entram na
fase III e somente nove (0,027%) são aprovadas pelos
órgãos regulatórios.
➔ É importante mencionar ainda, que apenas um
medicamento aprovado (0,003%) é incluído nos
protocolos terapêuticos.
------------------------------------------------CADEIA DE INOVAÇÃO EM FÁRMACOS-----------------------------------------------
1. Definição do alvo terapêutico.
2. Planejamento molecular por meio da química medicinal,
para o descobrimento de ligações entre as moléculas.
3. Farmacologia, bioensaios in vitro/in vivo.
4. Ensaios clínicos.
- Fase 1: Avaliação de toxicidade em indivíduos
saudáveis;
- Fase 2: Tratamento de pessoas doentes;
- Fase 3: Tratamento de um grupo maior de pessoas;
doentes;
- Fase 4: Distribuição dos fármacos;
5. Proteção patentária.
---------------------MODELOS IN VITRO---------------------
Cultura de células
➔ No século XIX, Sydney Ringer, ao desenvolver soluções
salinas capazes de assegurar as necessidades vitais de
órgãos isolados do organismo, lançou as bases do que
viria a ser a cultura de células.
➔ Wilhelm Roux quem conseguiu pela primeira vez, em
1885, manter vivas durante vários dias células
embrionárias isoladas de pinto numa solução salina
aquecida.
Princípios básicos
➔ É uma técnica largamente reconhecida e rotineiramente
utilizada no laboratório, particularmente em
investigação. Para o sucesso da cultura de células, o
cumprimento das regras e cuidados de assepsia é
fundamental, uma vez que cerca de 70% dos problemas
que surgem são devido a contaminações.
➔ A obtenção de uma população ou cultura de células é
possível de várias formas, das quais se indicam duas:
- Crescimento ou migração de células de um
fragmento de tecido: A seleção se baseia na
capacidade virtual de as células migrarem da
amostra de tecido;
- Dispersão celular: Cuja seleção resulta da
capacidade de as células sobreviverem à
metodologia aplicada e que pode ser a desagregação
enzimática ou mecânica do tecido.
Cultura de células
A cultura de células pode ser feita de duas formas:
Cultura em monocamada:
As células vão aderir a um substrato e propagam -se. É o
método mais usado e tem como condição essencial a adesão
ao substrato, “ancoragem”.
Esta dependência da “ancoragem” é um pré -requisito
indispensável à proliferação celular, nesta metodologia.
A cultura em suspensão é usada para células que sobrevivem
e proliferam sem necessidade de adesão (independente da
“ancoragem”).
Cultura 3D:
É utilizado um gel nutritivo onde as células vão crescer.
Ela serve para demonstrar como realmente acontece a
dispersão farmacológica em um animal.
➔ Descobrir como as células se movem e aderem à
superfícies é fundamental para nossa compreensão do
câncer e de outras doenças, porém, a maior parte do que
sabemos sobre esses comportamentos foi aprendido no
ambiente 2D.
➔ Fraley et al, (2011) demonstraram pela primeira vez, que
as células cancerígenas se comportam no organismo de
maneira tridimensional, e é fundamentalmente diferente
do comportamento que vemos nos modelos 2D de
cultivo.
Ensaios
Citotoxicidade in vitro em células tumorais
➔ É um teste de viabilidade mitocondrial.
Técnica do MTT
➔ Adição do sal tetrazólio na mitocôndria, se ela estiver
viável o sal será reduzido a formazan tornando-se roxo.
➔ Quanto mais roxo menos o fármaco surtiu efeito, as
células continuam vivas.
➔ A enzima responsável pela conversão é a dehidrogenase.
Processo
1. É feita a contagem das células, estas são colocadas em
uma placa e precisam estar em uma concentração de
0,3 x 106.
2. Elas ficarão em cuba dependendo do protocolo (24h,
48h e 72h), em contato com o fármaco.
3. É adicionado o MTT e após 3 horas as placas são lidas
em espectrofotômetro de absorbância colorimétrica
(leitor de Elisa).
4. Quanto mais claro, mais o fármaco matou.
Resultados
➔ A doxorrubicina (DOX) é o fármaco clássico, ela é usada
como métrica para a comparação com os outros
fármacos.
➔ É possível ver qual dos fármacos utilizados matou 50%
das células no tempo estipulado (24h, 48h e 72h).
➔ O instituto nacional de câncer dos EUA determina que
em 72h a concentração dos fármacos de estar abaixo de
4 microgramas/ml.
Viabilidade celular
➔ São selecionados aqueles com concentração abaixo de 4
e vão para o segundo teste, que é o de viabilidade
celular, onde é usado um corante de exclusão chamado
azul de tripan.
Corante de exclusão: É cuspido por bombas de efluxo, ou
seja as células saudáveis não vão ficar coradas ao contrário
das que estão morrendo.
Análise morfológica - Coloração por May Grunwald
Giemsa
Coloração diferencial: hematóxilileuzina, onde é feito uma
coloração ácida e uma básica para analisar a morfologia na
célula e possíveis vias de morte (corpos apoptóticos, inchaço
e corpos autofágicos).
Citometria de fluxo
É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar
partículas microscópicas suspensas e meio líquido em fluxo.
Vê tamanho, granulosidade e marcações por meio de
marcadores fluorescentes.
Marcadores de necrose (vermelho) e apoptose (verde)
Análise molecular - RT-PCR
➔ Transcriptase reversa - Reação da cadeia polimerase:
Quais genes estão envolvidos neste processo.
➔ São usados primers para a sinalização do local onde a
polimerase deve copiar.
➔ Dependendo de como o fármaco irá promover a morte
celular ele deverá aumentar a expressão dos genes
responsáveis por essas vias.
- Bax: apoptose.
- BCLxl: Antiapoptótica.
Western Blot
➔ Depois da análise de expressão genética, será avaliado
se após essa expressão há a ativação do gene.
➔ Detecta proteínas específicas que foram ativadas ou
clivadas em um homogenato de tecido ou extrato.
---------------------MODELOS IN VIVO----------------------
Por que pesquisar em animais?
➔ Encontrar melhores formas de detectar cânceres em
estágios iniciais.
➔ Descobrir e testar novas terapias para melhorar os
resultados dos pacientes.
➔ Avaliar novas abordagens para a prevenção do câncer.
Diferentes tipos de modelos
Categorias
➔ Animais em que o câncer ocorre espontaneamente, sem
qualquer alteração dos genes ou a iniciação de câncer no
animal por meio de tratamentos químicos.
➔ Animais (transgênicos) cujos genes são alterados de
modo que o tumor se desenvolve de forma espontânea,
com mesmos tipos e com propriedades semelhantes aos
dos tumores que esses genes alterados causam nos
seres humanos.
➔ Animais que desenvolvem tumores espontâneos, se
forem expostos a fatores ambientais, tais como produtos
químicos ou radiação.
➔ Animais cujo a composição genética natural inalterada
permite aos pesquisadores identificar os genes que
geram suscetibilidade ao desenvolvimento de câncer.
Relação autogênica: É retirado um tumor do animal e
reimplantado nele.
Relaçãosinogênica: O tumor é retirado e transplantado a
um indivíduo da mesma espécie.
Relação alogênica: O tumor é retirado e transplantado a
um indivíduo de mesma espécie mas de linhagem diferente.
Relação xenogênica: O tumor é retirado e transplantado a
um indivíduo de outra espécie.
Escolha do modelo
➔ Delineamento de pesquisa: Presença de uma hipótese.
➔ Ferramentas disponíveis para apoiar os estudos.
Benefícios da pesquisa
➔ Semelhança com a situação humana.
Bioética e Bem-estar Animal
➔ Qual espécie eu vou trabalhar?
➔ Quantos animais eu vou utilizar?
➔ Como vai ser a metodologia?
➔ Vai provocar dor?
➔ Vai precisar realizar eutanásia?
➔ Como será o descarte?
Lei Arouca
➔ Utilizar métodos alternativos como processos de
simulação por computador de modelos biológicos.
➔ Obedecer aos 3 R’s:
- Replace (substituição): substituição do método
científico, empregando materiais alternativos.
- Refine (Redução): Utilização do menor número
de animais.
- Reduce (Refinamento): Modificações em
procedimentos visando o aprimoramento de técnicas
e escolha correta da espécie a ser utilizada.
CONCEA: Conselho nacional de controle de
experimentação animal.
I – Formular e zelar pelo cumprimento das normas relativas à
utilização humanitária de animais com finalidade de ensino e
pesquisa científica;
II – Credenciar instituições para criação ou utilização de
animais em ensino e pesquisa científica;
III – Monitorar e avaliar a introdução de técnicas alternativas
que substituam a utilização de animais em ensino e pesquisa;
IV – Estabelecer e rever, periodicamente, as normas para uso
e cuidados com animais para ensino e pesquisa, em
consonância com as convenções internacionais das quais o
Brasil seja signatário;
V – Estabelecer e rever, periodicamente, normas técnicas
para instalação e funcionamento de centros de criação, de
biotérios e de laboratórios de experimentação animal, bem
como sobre as condições de trabalho em tais instalações;
VI – Estabelecer e rever, periodicamente, normas
para credenciamento de instituições que criem
ou utilizem animais para ensino e pesquisa;
VII – manter cadastro atualizado dos procedimentos de
ensino e pesquisa realizados ou em andamento no País, assim
como dos pesquisadores, a partir de informações remetidas
pelas Comissões de Ética no Uso de Animais – CEUAs;
VIII – apreciar e decidir recursos interpostos contra decisões
das CEUAs.
CEUA: Comissão de ética no uso de animais
Filiação aos comitês de ética:
I – cumprir e fazer cumprir, no âmbito de suas atribuições, o
disposto nesta Lei e nas demais normas aplicáveis à utilização
de animais para ensino e pesquisa, especialmente nas
resoluções do CONCEA;
II – Examinar previamente os procedimentos de ensino e
pesquisa a serem realizados na instituição à qual esteja
vinculada, para determinar sua compatibilidade com a
legislação aplicável;
III – Manter cadastro atualizado dos procedimentos de ensino
e pesquisa realizados, ou em andamento, na instituição,
enviando cópia ao CONCEA;
IV – Manter cadastro dos pesquisadores que realizem
procedimentos de ensino e pesquisa, enviando cópia ao
CONCEA;
V – Expedir, no âmbito de suas atribuições, certificados que
se fizerem necessários perante órgãos de financiamento de
pesquisa, periódicos científicos ou outros;
VI – Notificar imediatamente ao CONCEA e às autoridades
sanitárias a ocorrência de qualquer acidente com os animais
nas instituições credenciadas, fornecendo informações que
permitam ações saneadoras.
Novo Ciuca
Cadastro das instituições de uso científico de animais.
Destinado ao registro:
I - Das instituições para criação ou utilização de animais com
finalidade de ensino e pesquisa científica;
II - Dos protocolos experimentais ou pedagógicos, aplicáveis
aos procedimentos de ensino e projetos de pesquisa
científicos realizados ou em andamento no País, assim como
dos pesquisadores, a partir de informações remetidas pelas
CEUAs;
III - Das solicitações de credenciamento no CONCEA.