TEMA 4 MICROSCOPIA DA LUZ

Prévia do material em texto

MICROSCOPIA DA LUZ
DESCRIÇÃO
Princípios e características da microscopia de luz. Componentes mecânicos e ópticos do microscópio. Características da objetiva, diferença entre poder de ampliação e poder de resolução. Utilização correta do microscópio e os tipos de microscopia de luz existentes.
PROPÓSITO
Compreender os princípios que regem a microscopia de luz e os componentes do microscópio, bem como suas funções e as diversas modalidades de observação. Obter conhecimentos suficientes para a correta utilização deste equipamento e o esclarecimento sobre as possibilidades de aplicação da microscopia na pesquisa e no diagnóstico.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Descrever conceitos gerais da microscopia de luz e seus componentes ópticos
MÓDULO 2
Identificar as diferentes modalidades de observação em microscopia de luz
INTRODUÇÃO
A palavra microscópio vem da junção das palavras gregas mikrós, que significa pequeno, e skoppéoo, que significa observar. A maioria dos conhecimentos atuais sobre a Microbiologia e a Biologia Celular é resultado do desenvolvimento das técnicas de microscopia, que utiliza a luz (visível ou não) para gerar uma imagem.
Inicialmente, vamos conhecer os princípios e conceitos gerais da microscopia de luz, bem como os principais componentes do microscópio convencional. Além disso, vamos descobrir se há diferença entre aumento e resolução, além de aprendermos como garantir uma correta iluminação na nossa imagem e como manusear adequadamente um microscópio.
Por fim, vamos conhecer um pouco sobre os principais tipos de microscopia de luz, seus princípios de funcionamento e suas principais aplicações. Vamos começar?
MÓDULO 1
Descrever conceitos gerais da microscopia de luz e seus componentes ópticos
HISTÓRICO DOS MICROSCÓPIOS
Vamos começar nossa jornada pelo mundo da microscopia falando um pouco da história dos microscópios. Com a invenção desse instrumento, descobriu-se um novo e fascinante mundo, cheio de possibilidades e aplicações. Desde a utilização dos equipamentos mais simples até as modernas técnicas de reconstrução de tecidos em 3D. A microscopia fascina e desperta a curiosidade.
A partir do século XVII, a invenção do microscópio revolucionou a Biologia Celular, trazendo novos conhecimentos e interpretações sobre o mundo que nos rodeia.
Porém, o nome do inventor e a data exata da criação do primeiro microscópio ainda é motivo de dúvida. Alguns historiadores sugerem que o primeiro microscópio tenha surgido no final do século XVI com o trabalho do fabricante de óculos Zacharias Janssen, que, ao unir duas lentes em um mesmo eixo, conseguiu visualizar estruturas pequenas e simples. Outras teorias históricas apontam que Galileu observava, já em 1623, minúsculas partículas com um telescópio rudimentar.
Fonte: Wikimedia/Domínio PúblicoMicroscópio de Zacharias Janssen.
Porém, foi em 1665 que Robert Hooke construiu o equipamento que mais se assemelha aos microscópios de luz utilizados atualmente. No seu livro, Micrographia, Hooke apresentou a descrição de suas observações a partir de um microscópio que se baseava na ampliação da imagem pela combinação de uma lente ocular com uma objetiva. Nesse documento, há o relato da observação de cortes de cortiça e a primeira citação do termo “células”. Paralelamente, o holandês Anton van Leeuwenhoek construiu um microscópio e fez observações a partir da análise de uma cortiça e de microrganismos coletados na água da chuva.
Ao longo dos séculos, a microscopia se aperfeiçoou e hoje nos permite observar os detalhes mais profundos da estrutura celular nas diferentes formas de vida. Realmente, os microscópios atuais são muito mais complexos do que os do século XVI, mas seguem o mesmo princípio ao associarem lentes a fim de gerar uma imagem ampliada.
Muitas são as aplicações dos diversos tipos de microscopia. Talvez nenhuma invenção tenha revolucionado tanto a ciência como o microscópio, que permitiu a quebra de paradigmas científicos e impulsionou o campo da Biologia Celular.
Fonte: Konstantin Kolosov/Shutterstock.Microscópio de luz.
PRINCÍPIOS DA MICROSCOPIA FOTÔNICA: CARACTERÍSTICAS DA LUZ
A microscopia de luz também pode ser chamada de microscopia fotônica, pois os fótons são partículas de luz. Portanto, para entender o funcionamento dos microscópios, precisamos conhecer as propriedades e características da luz.
A luz pode ser descrita como uma onda ou um fluxo de fótons, dependendo do fenômeno que desejamos descrever. Dentro da microscopia de luz, um conceito importante é o espectro da luz, ou seja, os comprimentos de onda. Esse espectro não se limita ao domínio visível, indo desde ondas de rádio à radiação gama. A luz que enxergamos está dentro de uma faixa pequena desse espectro, a região visível, que varia do vermelho ao violeta.
Quando observamos a luz branca, por exemplo, vemos na verdade a soma de todos os comprimentos de onda que fazem parte da região visível do espectro. A microscopia de luz se interessa justamente por essa região. Porém, em alguns microscópios, a fonte de luz é dada por lâmpadas de mercúrio, as quais emitem luz que ultrapassa o espectro visível.
FÓTONS
Partícula de energia na forma de radiação eletromagnética.
Fonte: Fonte: Wikimedia commons/licença(CC BY-SA 3.0)Espectro eletromagnético, demonstrando que apenas uma pequena faixa é visível aos nossos olhos.
Além das características da luz, precisamos conhecer dois fenômenos físicos de interferência na luz que são importantes na formação da imagem final: a refração e a difração. Estudando esses dois fenômenos vamos entender, por exemplo, a capacidade de resolução de uma lente e a utilização dos meios de imersão.
Fonte: Fouad A. Saad/Shutterstock.Fenômenos da luz.
Você sabe o que é difração e refração?
Em materiais transparentes, como o vidro ou a água, os raios luminosos ou ondas luminosas são absorvidas e reemitidas por moléculas do material até atravessá-lo inteiramente. Por isso, pode-se enxergar através deles. Entretanto, essa passagem ocasiona um pequeno atraso na propagação e, consequentemente, a velocidade da onda no material é menor que no ar, resultando em um leve desvio ao mudar de meio. Como isso funciona na prática?
Por exemplo, um lápis dentro de um copo com água parece estar torto ou distorcido. O que ocorre, na realidade, é um desvio da luz ao mudar de um meio para outro (do ar para a água), pois os índices de refração desses dois meios são diferentes. Na microscopia, o conhecimento do fenômeno da refração é importante para entender por que utilizamos meios de imersão para lentes objetivas e qual o impacto deles na geração e qualidade da imagem.
REFRAÇÃO
Refração é a mudança na velocidade de uma onda ao atravessar dois meios com índices de refração diferentes. Por sua vez, o índice de refração mede a razão entre a velocidade da luz no vácuo, onde não há nenhuma perturbação, e a velocidade da luz em um determinado meio.
Fonte: Kuki Ladron de Guevara e CRStocker/Shutterstock.Ilustrações representativas do fenômeno da refração.
Já a difração é o fenômeno que está diretamente relacionado ao processo de formação da imagem e à capacidade de resolução de uma lente.
As ondas de luz, emitidas a partir de uma fonte luminosa, tendem a seguir uma trajetória em linha reta. No entanto, conforme vemos na figura a seguir, a existência de uma parede com fendas faz com que a luz se espalhe formando cones de iluminação que, na realidade, representam a luz difratada. Logo, difração é a capacidade das ondas de desviar ou contornar os obstáculos que encontram durante sua propagação, bem como seu espalhamento ou alargamento após atravessar fendas ou orifícios.
Figura 1: Esquema representando o fenômeno de difração da luz.
Esse fenômeno parece complicado e longe da prática da microscopia, não é? Mas vamos trazer para a nossa realidade para entendê-lo melhor.
Podemos comparar a “parede com fendas” com uma lâmina contendo algum corte de tecido biológico, onde diferentes estruturas celulares terão maior e menor capacidade de interferir na penetração da luz. Em geral, a fonte de luz dos microscópiosfica na base do aparelho, logo, o feixe de luz atravessa a amostra e permite a formação da imagem desta. A resolução de uma lente, portanto, é dada pela sua capacidade de captar os raios que foram difratados.
Fonte: Chokniti Khongchum/Shutterstock.No microscópio óptico, o feixe luminoso atravessa a amostra e permite a geração da imagem que visualizamos.
APRESENTAÇÃO DO MICROSCÓPIO
Um microscópio pode ser dividido em dois principais sistemas: o mecânico e o óptico. Conhecer o nome de cada parte e a sua respectiva função é importante para manusear de maneira adequada esse equipamento tão essencial para as ciências biomédicas.
O sistema mecânico é composto por diferentes partes que têm funções específicas e distintas.
1. Pé ou base - confere suporte e apoio para sustentar o microscópio sobre uma superfície.
2. Coluna - sustenta as demais peças e articulações do microscópio, além de ajudar no transporte do aparelho.
3. Platina e charriot - a platina é o local onde se coloca o material para observação. Já o charriot possibilita a movimentação da lâmina (esquerda e direita) conforme o operador desejar, auxiliando na mudança do campo visual.
4. Pinças - ficam presas na platina e servem para fixar a lâmina com o material de estudo.
5. Tubo ou canhão - estrutura que une os sistemas de lente objetivas e oculares.
6. Revólver – fica localizado logo abaixo do canhão e sustenta as objetivas. É possível rodá-lo no próprio eixo para trocar a objetiva.
7. Parafusos micrométrico e macrométricos - permitem mover a platina na vertical para focar a imagem. O micrométrico movimenta a platina delicadamente e é usado para o ajuste fino do foco. Já o macrométrico permite o ajuste inicial do foco, com movimentos mais grosseiros.
Veremos agora quais elementos compõem a parte óptica de um microscópio. Essa talvez seja a parte mais interessante do aparelho, pois é nela que os mistérios envolvidos na formação e aumento da imagem são descobertos.
8. Condensador – concentra os raios luminosos na amostra.
9. Diafragma do condensador – regula a quantidade de luz que entra no condensador, possibilitando o ajuste do contraste. Existe ainda o diafragma de campo, próximo à fonte de luz, para controlar a intensidade luminosa.
10. Fonte luminosa – geralmente, é uma lâmpada de halogênio que fornece a luz do sistema.
11. Lentes objetivas – localizadas no revólver, têm a função de ampliar inicialmente e com resolução a imagem.
12. Lentes oculares – também ampliam com resolução a imagem gerada pela objetiva.
VOCÊ SABIA
Ajuste dioptria refere-se ao ajuste da ocular para promover acomodação para as diferenças de visão do observador.
Fonte: O autor.Figura 2: Apresentação dos componentes básicos de um microscópio de luz convencional.
Você deve estar se perguntando como observar uma garrafa de cultura de célula, já que algumas não cabem no espaço entre a platina e a objetiva, pois são muito altas. Nesses casos, nós utilizamos os chamados microscópios invertidos, nos quais a fonte de iluminação fica acima da platina e, as objetivas, abaixo dela.
Fonte: Catalin Rusnac/Shutterstock.Microscópio invertido
OBJETIVAS
As lentes objetivas são talvez o componente mais importante de um microscópio e, geralmente, estão presentes no revólver quatro objetivas. Veremos que as objetivas são fundamentais, atuando no ganho em resolução, no contraste e no tamanho do campo analisado. Os outros elementos do sistema óptico são importantes para corrigir ou modificar o padrão da luz, mas sua função primordial é atuar na ampliação e manutenção da imagem gerada pelas objetivas.
Fonte: Have a nice day Photo/Shutterstock.Revólver contendo as 4 objetivas do microscópio de luz convencional.
Ao contrário do que se imagina, uma lente é composta por um complexo sistema óptico que, através da convergência e divergência dos raios luminosos, consegue ampliar a imagem. Uma objetiva contém em sua parte externa diferentes códigos e números que indicam todas as suas características e especificações. É importante que você aprenda a identificar essas informações, pois elas darão dicas de como você deve utilizar o microscópio e observar sua amostra.
Tudo pronto? Então vamos lá!
Fonte: Adaptado de Wikimedia.Figura 3: À esquerda, uma lente objetiva com as informações técnicas gravadas em seu exterior. À direita, o seu interior, demostrando um conjunto de lentes e a complexidade do sistema óptico.
VOCÊ SABIA
No momento da análise do material no microscópio, a escolha das objetivas abrange diversas variáveis, como o tipo de amostra, a abertura numérica e o tipo de microscopia utilizada.
Talvez você não saiba o significado de algumas dessas informações, mas vamos ver uma por uma:
FABRICANTE (1)
Nome da empresa responsável pela produção da lente objetiva. No caso do nosso exemplo, a empresa é a Zeiss.
DENOMINAÇÃO (2)
Compreende a classe e o tipo de correção da lente. É interessante saber que ocorrem dois tipos de aberrações nas objetivas: esférica e cromática. Alguns recursos são utilizados para corrigir essas aberrações e melhorar a qualidade da imagem gerada. De modo geral, os fabricantes adotam uma nomenclatura única, facilitando o entendimento do operador do microscópio. Vejamos a seguir as principais especificações encontradas no campo da denominação (Quadro 1).
ESFÉRICA
Ocorre quando os raios luminosos focam em uma distância diferente da lente dependendo da distância entre o centro e o ponto de incidência do raio nesta última.
CROMÁTICA
Surge do fato de que os raios luminosos de diferentes comprimentos de onda não estão focados no mesmo ponto do eixo óptico.
Quadro 1: Principais especificações da denominação.
	DENOMINAÇÃO
	ESPECIFICAÇÃO
	Achromat
	Utilizada para correção esférica e cromática para duas cores.
	Apochromat
	Utilizada para correção esférica e cromática para quatro cores.
	Fluar, FL ou Fluor
	Utilizada, principalmente, em microscopia de fluorescência e possui correção cromática de três ou quatro cores.
	Plan
	Utilizada somente para correção esférica. Achroplan são as recomendadas para luz transmitida e Epiplan são para luz refletida.
Fonte: O autor.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Ainda em denominação, encontramos as informações da classe da objetiva, que se refere ao tipo de aplicação da lente. As principais aplicações são: microscópios invertidos, que requerem certa distância do objeto de análise (LC – long working distance); microscópios de fluorescência (EC – enhanced contrast); visualização de organismos vivos (LCI – live cell imaging); microscópios confocais (‘C’ – C-Aprochromat).
Ao observamos a Figura 3, vemos que a objetiva é uma EC, própria para microscópios de fluorescência. Epiplan indica que é utilizada para luz refletida e Apochromat significa que essa objetiva corrige tanto aberrações esféricas quanto cromáticas para quatro cores.
MAGNIFICAÇÃO/ABERTURA NUMÉRICA (3)
A palavra magnificação pode assustar à primeira vista, mas significa apenas a quantidade de vezes que a objetiva consegue ampliar a imagem da amostra de estudo. No nosso exemplo dado (Figura 3), a objetiva amplia 50 vezes (50x) a imagem. A abertura numérica (AN) determina a eficiência de resolução da objetiva, ou seja, sua capacidade de captar os raios luminosos, já considerando a difração sofrida, e fornece detalhes da amostra. No caso da objetiva do exemplo dado (Figura 3), a abertura numérica é de 0,95.
ATENÇÃO
Você não precisará calcular a AN, pois o valor está escrito na lente. Entretanto, deve entender os fundamentos do cálculo. A AN é dada pela fórmula:
AN = n (sen µ)
Onde: n é o índice de refração do meio entre a objetiva e a amostra; µ é a metade do ângulo máximo de abertura da objetiva; sen é seno de µ.
Então, quanto maior o valor de AN, maior também o poder de resolução e a necessidade de uso de um meio de imersão, pois menor será o espaço entre a lente e a lamínula (distância de trabalho).
Como saber se a abertura numérica é alta?
RESPOSTA
A escolha da abertura numérica para melhorar a resolução da objetiva está muito ligada à magnificaçãodesta. Em uma objetiva de 40x, por exemplo, uma AN de 0,75 é baixa, sendo ótimo o intervalo entre 1,2 e 1,4. Por outro lado, AN de 0,25 em uma objetiva de 10x é baixa, sendo recomendada uma 0,45. Não existe, por exemplo, uma objetiva de 10x com uma AN de 1,2. Desse modo, por uma questão física e trigonométrica, o intervalo de AN ideal para suas análises terá que ser analisado juntamente com a magnificação dada pela sua objetiva.
MÉTODO DE CONTRASTE (4)
Algumas situações específicas exigirão conhecimentos adicionais, como é o caso da visualização de organismos vivos e de tecidos não corados. Você precisa estar atento, pois esse tipo de amostra necessita da aplicação de um método de contraste para melhor definição das estruturas da amostra. A microscopia de contraste de fase transforma diferenças de fase em diferenças de intensidade luminosa. As lentes empregadas nesse tipo de microscopia são indicadas com “Ph” e contêm um anel de fase na sua estrutura óptica. Se a indicação for “DIC” ou “Pol” significa que essa objetiva é adequada para a microscopia de contraste de interferência e microscopia de polarização, respectivamente.
POLARIZAÇÃO
Polarização é um processo de seleção de ondas de acordo com a sua direção de vibração, após passarem por um material que atua como filtro, chamado de polarizador.
Esse é um fenômeno exclusivo das ondas transversais, que possuem a propagação perpendicular à vibração, como as ondas eletromagnéticas. As ondas longitudinais, como o som, que possuem direção de propagação paralela à direção de vibração, não podem ser polarizadas.
MEIO DE IMERSÃO (5)
Como vimos quando estudamos o fenômeno de refração, as diferenças de meio interferem na velocidade da luz e, consequentemente, na qualidade e percepção da imagem. A luz sofre refração ao passar do vidro da lâmina e da lamínula para o ar e ainda depois para a objetiva. Por exemplo, o índice de refração do ar é de, aproximadamente, 1, já o do vidro utilizado em lâminas de 1,5. Existem diversos meios de imersão utilizados na microscopia e sua utilização busca corrigir essas diferenças de índice de refração, entre os diferentes meios que a luz ultrapassa no momento da leitura de uma lâmina (Figura 4).
Fonte: Adaptado de The Biology Primer.Figura 4: Demonstração da refração sofrida pela luz ao passar por diferentes meios no microscópio.
As objetivas que necessitam de algum tipo de meio de imersão terão a indicação através de uma faixa de cores que representarão um meio específico. Vejamos os principais (Quadro 2):
Quadro 2: Faixa de cor da objetiva e tipo de substância utilizada como meio de imersão.
	COR
	TIPO DE SUBSTÂNCIA
	
	Óleo de imersão (oil)
	
	Glicerina
	
	Água
	
	Óleo, glicerol ou água
Fonte: O autor.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal
Fique atento à indicação de cor na objetiva, pois o uso do meio de imersão incorreto pode resultar na perda significativa de qualidade na imagem ou até mesmo danificar a objetiva.
ATENÇÃO
O código de cor encontrado em algumas objetivas indica o meio de imersão que deve ser utilizado, como as cores preta, laranja, branca e vermelha. Outras cores podem ser encontradas, mas essas estão relacionadas ao tamanho da ampliação. Isso é muito útil quando você tem um revólver contendo várias objetivas e deve selecionar rapidamente uma ampliação específica. Como no exemplo dado (figura 3), o código de cor azul presente na objetiva indica que a ampliação é de 60x.
COMPRIMENTO OU EXTENSÃO DO TUBO (6)
Essa informação vem gravada na parte externa da objetiva e indica se ela foi fabricada para ser utilizada a uma distância fixa (160 mm, correspondente à distância da base da objetiva até as oculares) ou corrigida para óptica infinita (sinalizada por ∞). Os microscópios mais modernos geralmente utilizam objetivas de óptica infinita.
ESPESSURA MÁXIMA DA LAMÍNULA (7)
Algumas objetivas exigem o uso de lamínulas de espessuras específicas para se ganhar o máximo de qualidade de imagem possível (Figura 5). O sinal negativo ( - ) indica que não há interferência de acordo com a espessura, podendo ser utilizadas lamínulas diversas. Por outro lado, o número zero (0) aponta que a lamínula não deve ser utilizada. Isso mesmo que você leu, a preparação deve ser feita sem lamínula! Neste caso, o cuidado deve ser redobrado para que a objetiva não encoste na amostra. Na maioria dos casos, a espessura das lamínulas padrão varia de 0,15 a 0,19 mm. No nosso exemplo (Figura 3), a objetiva apresenta o número zero!
Fonte: Adaptado de Soleil Nordic/Shutterstock.Figura 5: Esquema da montagem lâmina – amostra – lamínula.
AUMENTO E RESOLUÇÃO: QUAL A DIFERENÇA?
Você sabia que os microscópios não apenas nos auxiliam ampliando as estruturas observadas, como também aumentam a resolução da nossa visão? Você imagina como?
O olho humano tem um poder de resolução de aproximadamente 0,2 micrômetros, que equivalem à milésima parte de 1 milímetro. Isso significa dizer que, se olharmos dois pontos separados por uma distância menor que 0,2 micrômetros, vamos enxergar apenas um único ponto ao invés de dois. Para que consigamos visualizar estruturas separadas umas das outras, é necessário o auxílio de instrumentos ópticos que aumentem o poder de resolução. Então, resolução é a capacidade de distinguir dois pontos próximos (Figura 6).
Fonte: O autor.Figura 6: O aumento da resolução permite a distinção de dois pontos com maior clareza.
Poder de resolução não é a mesma coisa que poder de aumento. Se você ampliar uma foto várias vezes, as estruturas separadas por menos de 0,2 micrômetros vão continuar aparecendo como um ponto só, como se fossem um único borrão. Nesse caso, haverá um aumento do poder de ampliação, mas não de resolução. O surgimento dos microscópios permitiu ao ser humano aumentar tanto o poder de ampliação quanto o de resolução das imagens.
COMENTÁRIO
No microscópio, o aumento obtido é resultado da multiplicação entre o aumento da objetiva e o da ocular. Por exemplo, se o aumento de uma objetiva for de 100x e o de uma ocular for de 10x, a ampliação total será de 1000x.
ILUMINAÇÃO DE KOHLER
A chamada iluminação de Kohler foi desenvolvida no final do século XIX pelo professor alemão August Köhler e até hoje é usada quase exclusivamente como o método de iluminação nos microscópios. Ela funciona pelo ajuste dos componentes do sistema óptico, para que cada um contribua garantindo a intensidade e a estabilidade da iluminação na amostra. O professor Köhler sabia que, assim como o uso de boas lentes, o controle da iluminação é essencial na microscopia.
A iluminação de Kohler é muito importante e fácil de fazer. Observe a Figura 7 e acompanhe o passo a passo.
IMAGEM A
IMAGEM B
IMAGEM C
IMAGEM D
IMAGEM E
IMAGEM A
Primeiramente, é preciso ligar o microscópio. Em seguida, coloque uma lâmina qualquer na platina e focalize. Feche o diafragma de campo. Você deve enxergar um círculo ou um hexágono.
IMAGEM B
Cuidadosamente, mexa nos parafusos do condensador para centralizar essa imagem no campo.
IMAGEM C
Agora, mexendo no foco do condensador, deixe as bordas do círculo ou do hexágono bem nítidas.
IMAGEM D
Quase terminando, abra o diafragma de campo até que a luz ocupe o seu campo visual, mas sem ultrapassar muito.
IMAGEM E
Por fim, retire com muito cuidado uma das oculares para a correta observação do diafragma do condensador, que deve estar aberto em cerca de 80% do campo.
Agora sim, tudo pronto! A imagem resultante terá contraste e iluminação excelentes.
Fonte: O autor.Figura 7: Algumas etapas da iluminação de Kohler.
COMO UTILIZAR UM MICROSCÓPIO?
Como você deve saber, o microscópio é um equipamento muito utilizado em diversos laboratórios, auxiliando tanto na pesquisa quanto no diagnóstico e na educação. Apesar disso, ele é um equipamento sensível e caro.
Você foi apresentado aos principais componentes e aprendeu suas respectivas funções. Esse conhecimento é importante para que você manuseie um microscópio da maneira adequada. Apenas com o domínio dos procedimentos básicos de operação, você poderáalcançar todos os recursos do equipamento, além de mantê-lo funcionando por mais tempo.
Nunca se deve manusear um microscópio com as mãos sujas ou molhadas e nem forçar nenhuma das partes, pois todas devem funcionar suavemente. A lente da objetiva, seja de maior ou de menor aumento, nunca deve encostar na lâmina ou lamínula. Ou seja, você não pode focalizar a imagem levantando a platina com o macrométrico e olhando na ocular ao mesmo tempo.
As lentes devem ser limpas com uma solução de álcool-éter (proporção 9:1) e um papel absorvente bem macio. Não toque nelas diretamente com as mãos. Enquanto não estiver observando sua amostra, evite deixar a fonte de luz ligada.
Com essas recomendações básicas, agora vamos aprender como observar corretamente uma amostra no microscópio.
Fonte: O autor.Figura 8: Etapas para a utilização de um microscópio óptico.
Lembre-se de que, para algumas atividades, você vai utilizar as objetivas que necessitam de um meio de imersão. Nesses casos, alguns cuidados adicionais devem ser adotados. Com auxílio de um papel bem macio, delicadamente, seque o óleo de imersão da objetiva. Seja muito delicado, pois você pode acabar arranhando a lente. Em seguida, utilize a solução de álcool-éter comentada anteriormente para retirar os resquícios do óleo.
INTRODUÇÃO À MICROSCOPIA DE LUZ: CONHECENDO O MICROSCÓPIO NA PRÁTICA
VERIFICANDO O APRENDIZADO
Parte superior do formulário
1. APRENDEMOS QUE AS LENTES OBJETIVAS SÃO TALVEZ O COMPONENTE MAIS IMPORTANTE DE UM MICROSCÓPIO. QUAL O OBJETIVO DA UTILIZAÇÃO DO MEIO DE IMERSÃO NA PRÁTICA DA MICROSCOPIA?
Melhorar a iluminação da amostra, permitindo o aumento da magnificação.
Diminuir a diferença de velocidade da luz ao passar de um meio para o outro, suavizando o efeito da refração dos raios luminosos.
Evitar que a lamínula encoste na lente, o que pode danificá-la.
Aumentar a abertura numérica, possibilitando o encurtamento da distância de trabalho.
Parte inferior do formulário
Parte superior do formulário
2. VIMOS QUE O MICROSCÓPIO É DIVIDO DIDATICAMENTE EM DOIS PRINCIPAIS SISTEMAS: O MECÂNICO E O ÓPTICO. ASSINALE A ALTERNATIVA QUE APRESENTA APENAS ELEMENTOS DO SISTEMA ÓPTICO DE UM MICROSCÓPIO.
Coluna, lentes objetivas, charriot e diafragma do condensador
Diafragma de campo, condensador, lentes objetivas e parafuso micrométrico
Condensador, diafragma do condensador, lâmpada e lentes oculares
Lentes oculares, lentes objetivas, diafragma do condensador e revólver
Parte inferior do formulário
GABARITO
1. Aprendemos que as lentes objetivas são talvez o componente mais importante de um microscópio. Qual o objetivo da utilização do meio de imersão na prática da microscopia?
A alternativa "B " está correta.
Os meios de imersão são utilizados para diminuir a diferença de velocidade da luz entre dois meios, aproximando os seus índices de refração (IR). Dependendo do IR de alguns meios, a luz pode passar mais rapidamente ou lentamente, desviando os raios de luz. Essa diferença diminui a qualidade da imagem.
2. Vimos que o microscópio é divido didaticamente em dois principais sistemas: o mecânico e o óptico. Assinale a alternativa que apresenta apenas elementos do sistema óptico de um microscópio.
A alternativa "C " está correta.
Um microscópio é dividido esquematicamente em dois principais sistemas: mecânico e óptico. O condensador, o diafragma do condensador, a lâmpada e as lentes oculares, assim como as lentes objetivas, são elementos exclusivos do sistema óptico.
MÓDULO 2
Identificar as diferentes modalidades de observação em microscopia de luz
MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO
Em nosso caminho pelas diferentes modalidades de microscopia de luz, conversamos sobre a microscopia de campo claro. Na verdade, a microscopia de campo claro é o tipo mais comum de microscopia e é o mais utilizado pela maioria dos estudantes e pesquisadores do mundo.
Legal, mas você sabe como ela funciona?
Na microscopia de campo claro, temos uma fonte luminosa de onde parte a luz. Essa luz é concentrada pelo condensador, que aumenta a intensidade luminosa e a tornará uniforme na amostra. Saindo do condensador, a luz interage com a nosso espécime e é coletada pela objetiva, que forma uma imagem ampliada. Essa imagem é novamente ampliada, agora, pelas lentes oculares e, finalmente, chega aos nossos olhos.
Fonte: O autor.Figura 9: Mecanismo simplificado de funcionamento do microscópio de campo claro.
A partir da utilização das lentes objetivas e oculares que aumentam a imagem com resolução, observamos estruturas mais detalhadas que não conseguiríamos enxergar a olho nu. O fundo da imagem que vemos é branco, daí o nome campo claro.
Fonte: O autor.Figura 10: Tecidos biológicos corados com diferentes corantes.
Você consegue notar que as imagens anteriores possuem cor? Como isso foi possível?
Isso acontece porque, para observarmos alguma amostra nesse tipo de microscopia, é necessário que ela possua cor própria... ou que adicionemos algum corante a ela. Por quê?
As amostras que costumam ser submetidas à visualização por microscopia de campo claro são muito finas, delgadas, para permitir a interação com a luz. Assim, o contraste que elas oferecem é muito baixo. A adição de corantes oferece um maior contraste entre as estruturas, possibilitando sua correta observação.
Fonte: O autor.Figura 11: Corte de fígado sem corante (à esquerda) e corado com hematoxilina e eosina (à direita).
A microscopia de campo claro é muito utilizada em laboratórios de análises clínicas e de pesquisa, contribuindo enormemente para os estudos de parasitologia, microbiologia, histologia e biologia celular de modo geral.
VOCÊ SABIA
Dependendo da estrutura a ser analisada, existe uma coloração específica? A lista é bem grande, mas vamos ver duas delas:
1. Hematoxilina e eosina: É a combinação de corantes mais utilizada na histologia. Basicamente, os ácidos nucleicos presentes no núcleo são corados pela hematoxilina, ficando roxo azulados. Já a eosina cora de rosa as proteínas do citoplasma, fibras e organelas, como as mitocôndrias.
2. Coloração de Giemsa: A partir dessa coloração, podemos observar células sanguíneas, como plaquetas e eritrócitos. Pode ser utilizada para a visualização de protozoários, como o Plasmodium sp. e o Trypanosoma cruzi.
Fonte: Andy Frith/Shutterstock, Alan R Walker/Wikimedia/licença(CC BY-SA 3.0) e Paulo Abrahamsohn/Wikimedia/licença(CC BY-SA 4.0).Imagens representativas das colorações de Giemsa e Hematoxilina e Eosina.
Na Imagem 1, vemos Trypanosoma cruzi em meio a eritrócitos humanos, corados por Giemsa. Na imagem 2, vemos Hepatócitos, células do fígado, corados por Hematoxilina e Eosina. Note o núcleo arroxeado, enquanto o citoplasma é visto em rosa.
MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO
MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO
Você já observou o que acontece quando um raio de luz passa através de certas substâncias, como um cristal? Esse raio é dividido, gerando outros. A microscopia de polarização permite que essas substâncias com capacidade de desviar a direção da luz, chamadas de birrefringentes, possam ser analisadas.
Fonte: Mila Drumeva/Shutterstock.Raio de luz incidindo sobre o cristal.
Mas por que isso acontece?
RESPOSTA
Porque esses materiais birrefringentes possuem dois diferentes índices de refração para direções de propagação da luz distintas. As substâncias birrefringentes podem estar naturalmente presentes nos tecidos biológicos ou podem ser adicionadas às amostras através de métodos tintoriais.
VOCÊ SABIA
Além dos lindos cristais, podemos encontrar a birrefringência em materiais que estão presentes no nosso dia a dia? O papel celofane, alguns itens plásticos, a fita adesiva e até fios de cabelo podem ser úteis para observar essa característica óptica!
Fonte: Nevit Dilmen/Wikimedia.Birrefringência visualizada através de um transferidor de plástico.
O microscópio de polarização funciona de modo semelhante ao de campo claro comum, possuindo somente duas diferenças principais: nesse tipo de microscópio, a luz é polarizada através de um prisma chamado de polarizador, localizado entre a fontede luz e o espécime. A função do polarizador é selecionar apenas um plano da luz incidente, então, o que passa pela nossa amostra é uma luz polarizada.
EXEMPLO
A luz do sol, por exemplo, é uma luz não polarizada, que possui várias direções.
Fonte: Adaptado de Kirill Borisenko/Wikimedia/licença(CC BY-SA 3.0).Esquema do fenômeno de polarização da luz.
Essa luz polarizada, então, incide na nossa amostra com características birrefringentes e é dividida em dois feixes, que são desviados. Dentro do tubo do microscópio, entre a lente objetiva e a ocular, encontramos um segundo prisma, que é chamado de analisador. A função dele é bloquear a passagem da luz incidente que não foi desviada e selecionar apenas a luz desviada pela amostra birrefringente (Figura 12).
Fonte: O autor.Figura 12: Mecanismo simplificado do funcionamento do microscópio de polarização.
É importante destacar que, para a realização da microscopia de polarização, é necessário que o polarizador e o analisador estejam alinhados, formando um ângulo reto que resulta em um fundo escuro.
COMENTÁRIO
Caso eles não estejam alinhados, permitindo a passagem seletiva dos raios desviados, não conseguimos ver absolutamente nada.
Mas como isso funciona na prática?
Vamos imaginar que estamos em um laboratório e queremos analisar uma fatia de borracha e uma amostra biológica com características birrefringentes. Para isso, será utilizada a microscopia de luz polarizada.
Quando a amostra é a fatia de borracha, não vamos conseguir observar nada. Isso ocorre porque a borracha não é refringente, assim os raios de luz não foram divididos pelo objeto, mesmo quando colocamos a amostra na platina do microscópio, com os prismas alinhados formando o fundo escuro. O mesmo ocorre quando as amostras não são refringentes.
Porém, ao analisarmos uma amostra biológica, que seja cristalina ou birrefringente, como fibras musculares, gotículas de gordura ou espermatozoides, teremos uma imagem sensacional! A partir do ajuste dos prismas e sob o efeito da luz polarizada, os componentes birrefringentes dessa amostra desviarão a luz e a imagem final terá um brilho incrível, onde nós conseguiremos ver com detalhes os realces, em detrimento dos que não são birrefringentes.
Fonte: Lebendkulturen.de/Shutterstock.Músculos da Daphnia pulex (Piolho D`água).
Desenvolvida em 1828 pelo físico W. Nicol, a microscopia de luz polarizada é utilizada na análise de macromoléculas, como DNA, fibras de colágeno, amido e celulose, no estudo de células que possuem organização de macromoléculas cristalinas, como a célula muscular esquelética e os espermatozoides, e na análise de tecidos biológicos, como o dente, o tecido ósseo e o cartilaginoso. E ela não é usada somente na Biologia!
Também é utilizada na Mineralogia, sendo aplicada na análise de componentes cristalinos dos minerais.
Fonte: ChWeiss/Shutterstock.Células de batata, com amido de milho, que é birrefringente, sob luz polarizada.
VOCÊ SABIA
A birrefringência de algumas amostras pode ser intensificada através do uso de corantes, como é o caso das fibras de colágeno, que podem ser mais evidenciadas se coradas por Picrosírius. Outro exemplo é o Azul de Toluidina, que evidencia a cromatina e a matriz extracelular.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE
Para visualizarmos amostras biológicas no microscópio de campo claro, precisamos fixá-las e corá-las. Esses procedimentos são realizados, na maioria das vezes, por substâncias químicas tóxicas que acabam matando as células. Por isso, na microscopia de campo claro comum, só conseguimos ver a estrutura da nossa amostra no instante em que ela for fixada ou corada.
Durante muito tempo, a maioria dos detalhes de células vivas não pôde ser observada pelo microscópio de campo claro comum. Isso porque, as estruturas celulares são transparentes e não apresentam contraste suficiente para serem visualizadas.
Para resolver esse problema, o físico holandês Zernike inventou o microscópio de contraste de fase e, por conta da sua importância, recebeu o prêmio Nobel de física, no ano de 1953.
Fonte: Adaptada de Pixnio.Endosporos de Bacilus antrachis, observadas por microscopia de campo claro (à esquerda) e microscopia de contraste de fase (à direita).
A microscopia de contraste de fase permite que possamos visualizar, com detalhes, amostras vivas, não fixadas e não coradas. Mas antes de entendermos o mecanismo de funcionamento desse microscópio, precisamos conhecer seus principais componentes.
Assim como o microscópio de campo claro comum, o microscópio de contraste de fase também possui uma fonte iluminadora, um condensador, lentes objetivas e oculares. A grande diferença é que, no microscópio de contraste de fase, existe um anel de fase no condensador e na lente objetiva, que serve para receber a luz difratada.
Parece complexo, não é? Mas você vai ver que é mais simples do que você imagina!
Fonte: Adaptado de CNX OpenStax/Wikimedia/licença(CC BY 4.0).Figura 13: Componentes do microscópio de contraste de fase.
A microscopia de contraste de fase baseia-se no fato de que a luz difratada (desviada) possui um atraso em relação à luz não difratada. Então, quando passam pela nossa amostra, os raios difratados apresentam uma diferença de velocidade (cerca de ¼) em relação aos raios não difratados.
Imagina que você tem uma amostra biológica viva, bem delgada, e liga o microscópio de campo claro comum para emitir luz nessa amostra. Você vai ver uma imagem com um contraste muito baixo, pois boa parte da luz vai difratar, sem atingir a amostra.
Mas como esse problema de velocidade pode ser resolvido?
RESPOSTA
Atrasando ou acelerando esses raios que não foram difratados! E é justamente aí que entram os anéis de fase, tanto do condensador quanto da objetiva: eles basicamente aceleram ou retardam esses raios, gerando diferenças de intensidade luminosa e aumentando a interação entre eles, resultando na melhoria considerável no contraste da imagem. Para alcançar esse objetivo, primeiro, devemos regular o microscópio, selecionando os anéis de fase (no condensador e na objetiva).
Para que a fase seja ajustada, retiramos cuidadosamente uma das oculares e alinhamos um anel de fase com o outro, a área sombreada de um com a do outro. Na imagem final, as partes mais escuras correspondem a áreas mais densas da amostra, e as partes mais claras correspondem a áreas menos densas.
A microscopia de contraste de fase possibilita a observação de células e tecidos vivos não corados, além de processos celulares, sendo muito utilizada em pesquisa e análise de microrganismos, secções de tecidos finos, fibras e partículas subcelulares (como o núcleo). Por conta da sua alta aplicabilidade, pode ser facilmente incluída nas áreas de hematologia, virologia, bacteriologia e parasitologia.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERÊNCIA
A microscopia de contraste diferencial de interferência (DIC) foi desenvolvida pelo físico Georges Nomarsky em 1952, um ano antes do cientista que inventou a microscopia de contraste de fase ganhar o Prêmio Nobel.
Utilizando o microscópio de DIC, podemos observar amostras não coradas, vivas, com um alto contraste e com um diferencial: uma sensação de profundidade! Se tivermos amostras mais grossas, que não conseguiríamos visualizar no microscópio de contraste de fase, podemos utilizar a microscopia de DIC.
Mas no que é baseada essa microscopia?
RESPOSTA
A microscopia de DIC baseia-se no princípio de que as possíveis diferenças de composição ou espessura entre regiões de amostra apresentam índices de refração variados. Por conta disso, a velocidade com que a luz atravessa essas regiões é diferente.
Vamos agora entender como isso é usado para gerar a imagem final:
O microscópio de DIC possui um polarizador parecido com o da microscopia de polarização, que vai selecionar a luz em uma direção única. Depois disso, essa luz é separada em dois feixes por um prisma, chamado de prisma de Wollaston. O resultado dessa separação é uma região da amostra iluminada por um feixe e outra região pelo outro feixe.
Depois que interagiramcom a nossa amostra, é hora de juntarmos novamente esses feixes. Quem faz isso é um segundo prisma situado próximo da objetiva. Em seguida, um analisador seleciona os feixes que sofreram mudança de angulação, por conta dos diferentes índices de refração. Juntando tudo, a combinação e a interação de todos esses feixes, que alcançaram áreas diferentes da nossa amostra, criam uma imagem de alto contraste.
Fonte: O autor.Figura 14: Esquema simplificado do microscópio de contraste diferencial de interferência.
Dependendo da nossa amostra, a imagem gerada nos dá uma sensação de textura e profundidade, diferente da microscopia de contraste de fase. Além disso, vemos regiões de sombra, que é resultado justamente dos diferentes índices de refração. Embora nos dê imagens lindas, a microscopia de DIC evidência apenas os contornos de grandes organelas celulares, como núcleos e vacúolos. Então é muito importante saber o que precisa analisar.
Fonte: Masur/Wikimedia.Células de Saccharomyces cerevisiae visualizadas por microscopia de DIC.
Observe as imagens abaixo. Você consegue perceber as principais diferenças entre elas? Conseguimos ter uma sensação de textura e profundidade na microscopia de DIC e não vemos o halo de fase (indicado pela seta), característico da microscopia de contraste de fase.
Fonte: Modificado de Medmyco/Wikimedia/licença(CC BY-SA 4.0) e Lebendkulturen.de/Shutterstock.Figura 15: Hifa de Cladophialophora carrionii vista por microscopia de contraste de fase (à esquerda) e Paramécio observado por DIC (à direita).
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Você sabia que algumas substâncias apresentam naturalmente característica fluorescente? Isso acontece porque, quando elas são excitadas por uma determinada fonte de energia, emitem luz. Como assim?
Vamos tentar entender melhor com o esquema abaixo, mas antes precisamos nos lembrar de um conceito da física: o comprimento de uma onda é inversamente proporcional à sua energia, ou seja, quanto maior o comprimento de onda, menor a energia.
O fenômeno da fluorescência acontece quando os elétrons presentes em uma determinada molécula são excitados por uma fonte de energia, como a luz UV. Uma vez estimulados por essa energia, eles pulam de camada eletrônica, migrando para uma camada superior mais energética. Isso dura apenas algum tempo, e esses elétrons retornam para a sua camada original emitindo luz. Essa luz possui um comprimento de onda maior (e de menos energia) que a fonte de luz inicial, pois há uma perda energética na forma de calor nesse processo de mudança de camada eletrônica (Figura 16).
Fonte: O autor.Figura 16: Representação do diagrama de Jablonski, esquematizando o fenômeno da fluorescência.
O primeiro microscópio de fluorescência foi construído por August Köhler no início do século XX.
Porém, foi somente meio século depois, com o desenvolvimento de anticorpos ligados a moléculas fluorescentes (os chamados Fluorocromos ou Fluoróforos), que a microscopia de fluorescência pode ser amplamente aplicada nos laboratórios.
Fonte: D. Kucharski K. Kucharska/Shutterstock.Células vegetais vistas por microscopia de fluorescência.
ATENÇÃO
Fluorocromos ou Fluoróforos são um grupo de moléculas capazes de absorver energia na forma de luz de um comprimento de onda específico e emitir luz em um comprimento maior (com menos energia). A luz de excitação pode ser dada por lâmpadas de mercúrio de 120 watts (recomendada), que precisam ser trocadas regularmente para que a intensidade do sinal fluorescente não diminua.
Os Fluoróforos acoplados aos anticorpos utilizados nesse tipo de microscopia apresentam um espectro de excitação e emissão conhecidos. A luz é utilizada como fonte de excitação e, como ela apresenta um comprimento de onda diferente do que é necessário para excitar a molécula fluorescente, são utilizados filtros que separam esses comprimentos de onda e limitar apenas a passagem de determinados comprimentos. Desse modo, vemos somente as regiões onde houve a ligação do anticorpo conjugado a essa molécula fluorescente.
Agora que entendemos como ocorre a excitação dos Fluorocromos e posterior emissão de luz, vamos conversar um pouco mais sobre como funciona a microscopia de fluorescência.
No microscópio de fluorescência, vamos notar que o caminho óptico, aquele feito pela luz, é diferente do que vimos nos tipos anteriores de microscópio. Aqui, os raios luminosos passam pelo condensador e pela objetiva, antes de chegarem à amostra. Logo, o caminho que a luz faz para chegar à amostra é o mesmo da luz que é emitida pela amostra.
A luz sai de uma lâmpada policromática e passa pelo condensador, que concentra os raios luminosos. Em seguida, esses raios passam por um filtro de excitação, que seleciona e deixa passar apenas o comprimento de onda ideal (feixe azul) para excitar o Fluorocromo utilizado na amostra. A luz é refletida pelo espelho dicroico, cuja função é transmitir (deixar passar) comprimentos de ondas específicos e refletir outros.
Somente então o feixe azul atravessa a objetiva, sendo concentrado na região da amostra que é iluminada naquele momento. Os anticorpos conjugados a Fluorocromos presentes na amostra são excitados pelo feixe e emitem luz que possui comprimento de onda distinto do feixe azul (feixe verde), que volta ao espelho dicroico, e é transmitida ao filtro de emissão. O filtro de emissão seleciona o comprimento de onda específico e a imagem final pode ser visualizada diretamente na ocular ou por câmeras específicas. Os filtros de emissão e excitação, bem como o espelho dicroico, ficam no interior de um cubo, o chamado cubo de fluorescência, localizado acima da objetiva (Figura 17).
Fonte: O autor.Figura 17: Esquema simplificado do mecanismo de funcionamento do microscópio de fluorescência.
A microscopia de fluorescência também é extremamente útil nas ciências biomédicas e em diagnósticos, como por exemplo o do câncer. A partir da utilização de Fluoróforos, podemos localizar estruturas e moléculas específicas no interior das células ou em tecidos, como também realizar estudos de colocalização de estruturas e moléculas em uma mesma amostra, usando Fluoróforos diferentes.
Fonte: Vshivkova/Shutterstock.Fibroblastos marcados com anticorpos conjugados a Fluorocromos.
Além disso, moléculas fluorescentes específicas podem ser injetadas inclusive em animais vivos e culturas celulares viáveis, funcionando como rastreadores. Tais métodos são úteis para estudar junções intercelulares, detectar marcadores de crescimento celular e rastrear a via de fibras nervosas, por exemplo.
ATENÇÃO
Na microscopia de fluorescência, é necessário que utilizemos um óleo de imersão especial que evita a autofluorescência. Além disso, as lâminas e lamínulas também precisam ser adequadas para essa microscopia.
A escolha do conjunto de filtros é extremamente importante, pois estes devem ser compatíveis com o espectro de excitação e emissão do Fluorocromo utilizado.
MICROSCOPIA CONFOCAL
Durante nosso percurso pelos tipos de microscopia de luz, vimos que, para observar uma amostra biológica, é necessário que ela esteja bem delgada, permitindo a passagem da luz. Além disso, essa amostra normalmente possui espessuras diferentes em variadas áreas, o que resulta em imagens que estão no foco e fora dele. Amostras muito espessas criam uma imagem borrada justamente por possuírem muitos planos fora de foco. Além disso, mesmo em uma amostra delgada, a focalização da imagem ocorre em todos os planos ao mesmo tempo.
Assim, vamos sempre observar todas as nossas estruturas em um único plano, sem conseguirmos juntar todos esses planos de foco para montar uma imagem tridimensional. E não é novidade para ninguém que todos os organismos são tridimensionais. Então, como resolver esse problema?
A microscopia confocal, que é uma espécie aperfeiçoada de microscopia de fluorescência, nos permite ver detalhes de diversos planos de focalização da amostra, um de cada vez, e juntá-los no final, formando uma imagem tridimensional.
Fonte: Vshivkova/Shutterstock.Cultura de fibroblastos humanos observadapor microscopia confocal. O núcleo está em vermelho, enquanto verde marca filamentos de actina e azul os filamentos de tubulina.
Para entender melhor como isso funciona, precisamos conversar um pouco sobre a confocalidade.
O princípio da confocalidade é a base da microscopia confocal e foi descrito pela primeira vez em 1955. No microscópio confocal, encontraremos duas barreiras físicas, com uma distância entre si do tamanho de uma cabeça de alfinete (o chamado pinhole).
O pinhole encontra-se no mesmo plano focal da amostra e impede a passagem de luz das regiões que não estão no foco. Além disso, funciona como um divisor de feixes luminosos, que vão incidir em diferentes planos da nossa amostra.
PINHOLE
O pinhole, que significa “cabeça de alfinete” é o espaço que os dois anteparos possuem entre si. Os dois anteparos são a barreira física, o pinhole é a distância entre os dois anteparos.
Fonte: O autor.Figura 18: Representação esquemática dos anteparos físicos e do pinhole.
A maioria dos microscópios confocais utilizam lasers como fontes de iluminação. Após deixar a fonte, o feixe luminoso é dividido pelo pinhole em outros feixes, que caminham até o espelho dicroico. Lá, serão refletidos de diversas maneiras, por conta dos diferentes ângulos que encontram esse espelho. Uma vez refletidos, os feixes incidem em diferentes pontos da amostra marcada com Fluoróforos, assim como na microscopia de fluorescência.
Após esses feixes luminosos serem absorvidos pelas moléculas fluorescentes, são emitidos outros raios em outros comprimentos de onda, que passam pelo espelho dicroico e são captados por detectores especiais chamados de fotomultiplicadores.
A função dos fotomultiplicadores é captar os fótons emitidos e gerar sinais elétricos com intensidade proporcional à quantidade de sinal captado. Perceba que apenas a fluorescência emitida pelo plano que está em foco será captada pelo detector, enquanto todos os outros planos que não estão em foco são eliminados pelo pinhole.
Confuso? Calma que, vendo a imagem, entendemos melhor o mecanismo de funcionamento desse microscópio.
Fonte: O autor.Figura 19: Mecanismo simplificado do funcionamento do microscópio confocal.
Ao aproximarmos e afastarmos a amostra da objetiva, conseguiremos variar o plano em foco. Com o uso da computação, as imagens geradas nos diferentes planos focais podem ser agrupadas e utilizadas para formar uma única imagem da nossa amostra, com características tridimensionais.
Fonte: Heiti Paves/Shutterstock.Figura 20: Antera de agrião, observada por microscopia confocal a laser.
A vantagem da utilização da microscopia confocal é, sem dúvida, a aquisição de imagens com maior detalhamento das estruturas e possibilidade de reconstrução tridimensional das amostras. Além disso, como os planos fora de foco são eliminados pelo pinhole, podemos analisar amostras mais espessas, como biofilmes bacterianos e estruturas fúngicas, pois somente o plano em foco será observado. Ou seja, podemos analisar e estudar espécimes tanto viáveis quanto fixados, sem a necessidade de cortá-los em fatias finas.
ATENÇÃO
Por se tratar de uma iluminação a laser, que é uma luz contínua em forma de ponto, não conseguimos formar uma imagem completa do campo. A imagem final, na verdade, é uma montagem feita pelo computador a partir da aquisição de todos os pontos focais. Por esse motivo, não conseguimos observar a imagem diretamente nas oculares do microscópio.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
Parte superior do formulário
1. VOCÊ É O RESPONSÁVEL POR UM GRANDE CENTRO DE MICROSCOPIA MULTIUSUÁRIO E RECEBE DE UM ALUNO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA UMA LÂMINA DE FÍGADO DE PACIENTE, MARCADO COM DIFERENTES FLUORÓFOROS. ELE PEDE SUA AJUDA PARA OBSERVAR AS ESTRUTURAS MARCADAS COM GRANDES DETALHES. PELAS CONDIÇÕES DA AMOSTRA APRESENTADA, QUAL SERIA A MICROSCOPIA QUE VOCÊ INDICARIA PARA ESSE USUÁRIO?
Microscopia de contraste de fase
Microscopia confocal
Microscopia de campo claro
Microscopia de fluorescência
Parte inferior do formulário
Parte superior do formulário
2. (INMETRO 2010 -TECNOLOGISTA EM METROLOGIA E QUALIDADE – MODIFICADA) NOS MICROSCÓPIOS DE FLUORESCÊNCIA, TEMOS ALGUNS COMPONENTES ESSENCIAIS, COMO OS FILTROS DE EXCITAÇÃO E EMISSÃO E O ESPELHO DICROICO. SOBRE ESSE ASSUNTO, ASSINALE A OPÇÃO CORRETA:
Os filtros de emissão são lentes associadas à fonte luminosa do microscópio de fluorescência que regula a intensidade de emissão de luz sobre as amostras.
Os filtros de excitação são lentes transparentes colocadas após as lentes objetivas de forma a intensificar a emissão da imagem luminosa para as lentes objetivas, contribuindo, dessa forma, com a ampliação final da imagem adquirida.
A escolha dos filtros a partir dos Fluoróforos utilizados nas amostras não interfere na visualização da imagem, já que todos os Fluoróforos podem ser excitados por qualquer comprimento de onda.
A função básica do espelho dicroico na microscopia de fluorescência, situado dentro do chamado cubo de fluorescência, é refletir os raios luminosos de comprimento de onda para excitação do Fluoróforo e transmitir os raios de comprimento de onda de emissão do mesmo.
Parte inferior do formulário
GABARITO
1. Você é o responsável por um grande centro de microscopia multiusuário e recebe de um aluno de iniciação científica uma lâmina de fígado de paciente, marcado com diferentes Fluoróforos. Ele pede sua ajuda para observar as estruturas marcadas com grandes detalhes. Pelas condições da amostra apresentada, qual seria a microscopia que você indicaria para esse usuário?
A alternativa "B " está correta.
A microscopia cofocal permite a visualização de amostras (viáveis ou não), marcadas com Fluoróforos, em diferentes planos focais, proporcionando uma imagem com alto ganho de resolução.
2. (INMETRO 2010 -Tecnologista em Metrologia e Qualidade – MODIFICADA) Nos microscópios de fluorescência, temos alguns componentes essenciais, como os filtros de excitação e emissão e o espelho dicroico. Sobre esse assunto, assinale a opção correta:
A alternativa "D " está correta.
No caminho óptico do microscópio de fluorescência, o raio luminoso de comprimento de onda específico para excitar o Fluoróforo presente na amostra é selecionado pelo filtro de excitação. Uma vez selecionado, esse raio é refletido pelo espelho dicroico, atravessa a objetiva e alcança a amostra. Os comprimentos de onda dos raios emitidos pela amostra são transmitidos pelo espelho dicroico e direcionados ao filtro de emissão. O filtro de emissão selecionará o comprimento de onda específico e a imagem final poderá ser visualizada diretamente na ocular ou por câmeras específicas.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Durante nossa jornada, vimos os princípios e as características principais da luz, que são a base para o estudo da microscopia. Conversamos sobre os principais componentes do microscópio e suas funções, a importância das objetivas e a diferença entre ampliação e resolução. Também aprendemos a fazer o correto ajuste de iluminação para obter uma imagem com qualidade. Para encerrar, vimos as principais modalidades de observação em microscopia de luz, suas diferenças e múltiplas aplicações nas ciências biomédicas.
Gostamos muito de acompanhá-lo nesse aprendizado da microscopia de luz e esperamos que você utilize esse conhecimento em seu caminho profissional. Até breve!