DNA Mitocondrial

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA
LABORATÓRIO DE GENÉTICA HUMANA E MÉDICA
CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM GENÉTICA FORENSE
SEMINÁRIO
DNA MITOCONDRIAL
Docente: 	Ândrea Kely Campos Ribeiro dos Santos
Discentes: 	Andrea Cristina Sant’Ana
		Alessandra Paiva Puertas Alves
Outubro/2005
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DNA MITOCONDRIAL
	
Dentre as organelas presentes no citossol da célula dos organismos superiores encontram-se as mitocôndrias. São responsáveis pelo processo de respiração celular, possuindo um tamanho variando de 0,5 a 1,0 µm de diâmetro e 5,0 a 10 µm de comprimento. São consideradas autênticas fábricas de produção da energia necessária para o bom funcionamento da célula. Pode-se acrescentar ainda que são em si, providas de uma carga genética própria, o DNA mitocondrial (mtDNA) (DE ROBERTIS, 2003).
Diferente do DNA nuclear que forma longas fitas, constituídas cada uma por dupla hélice e que codificam aproximadamente 100.000 genes, o mtDNA representa de 1 a 2% do DNA celular, em duplo filamento circular, codificando 37 genes. Ele codifica aproximadamente 10% das proteínas constitutivas das mitocôndrias, como conseqüência, para um bom funcionamento destas, é necessária uma boa cooperação entre o DNA nuclear e o DNA mitocondrial.
O mtDNA não tem nada de especial em sua composição química que o diferencie do DNA nuclear, entretanto, possui um código genético próprio. Por outro lado sua organização é grandemente econômica, já que somente 10% de sua totalidade é não codificante. Seu genoma é haplóide devido sua herança ser estritamente materna, por isso não está submetido a processos de recombinação. O mecanismo pelo qual a mitocôndria paterna é excluída do embrião logo após a fertilização ainda não está bem esclarecida, tendo permanecido obscuro o mecanismo de eliminação (GILES et al, 1980; CANN et al, 1987).
Este DNA se encontra entre as menores moléculas de DNA, é circular com um tamanho de 16.569 pares de base (Figura 1), tendo sido completamente seqüenciado por Anderson et al. (1981). O mesmo autor ainda assinalou a todos os genes mitocondriais suas funções e seus produtos gênicos, incluindo 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 genes tRNA.
As fitas de DNA mitocondrial tem uma distribuição assimétrica de guaninas e citosinas, o que gera uma cadeia pesada (H) e outra leve (L). Cada fita é transcrita a partir de um promotor PL e PH1, localizados na região controle, na qual se inclui o D-Loop (Figura 2), que é uma região gerada pela síntese de um segmento curto da cadeia pesada H denominado 7SDNA, onde se encontra a origem da replicação da cadeia H. Esta região é muito importante do ponto de vista forense, devido ser uma região hipervariável e suficientemente pequena para ser abordada por meio de seqüenciamento por PCR (GÓES, 2003).
	
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Figura 01- Dupla cadeia de DNA mitocondrial, cadeia pesada (H) e cadeia leve (L)
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Figura 02 – Duplicação do mtDNA, formando alça D-Loop na cadeia pesada.
Devido sua grande variabilidade, a região controle é a que normalmente se analisa. Mede aproximadamente 1.100 pares de base e se subdivide em duas regiões maiores: a região hipervariável 1 (HVI), que compreende as posições 16.024 à 16.035, e a região hipervariável II (HVII), que compreende as posições 73 a 340 e uma região hipervariável menor (HVIII) . Convencionou-se iniciar a numeração nucleotídica da mitocôndria na região controle, de modo que esta região compreende as posições finais (16.024 à 16.569) e iniciais ( 1 à 576).
Figura 03: Divisão da Região Controle Mitocondrial
A região controle é responsável pela regulação da replicação e da transcrição de todo o mtDNA. A replicação tendo início nesta região é realizada por deslocamento de uma fita em relação à outra, formando uma alça, denominada D-Loop (displacemente loop). Na região controle, são verificados os polimorfismos do mDNA (UPHOLT e DAWID, 1977).
A grande variação desta região é devida a vários fatores:
i) o mtDNA é muito sensível ao dano oxidativo causado principalmente por um grande número de radicais livres proporcionado um ambiente favorável a mutação do DNA.
ii) o mtDNA não possui histonas, que exerce um papel protetor no DNA nuclear (YAKES e van OUTEN,1997);
iii) a mtDNA polimerase possui uma pobre atividade reparadora se comparada a polimerase nuclear.
iv) a reparação do DNA dependente de excisão de nucleotídeos não está presente em mitocôndrias (CONTREAU et al, 1999).
v) a típica estrutura D-Loop, onde há formação momentânea de fitas simples pode influenciar o padrão de mutação pontual (Reyes et al, 1998), já que a taxa de depurinação de DNA fita-simples é quatro vezes maior que a do DNA fita-dupla (LINDAHL e NYBERG, 1972).
Todos estes fatores fazem com que o DNA mitocondrial tenha uma taxa de evolução 5 a 10 vezes maior que o DNA nuclear, o que implica em uma hipervariabilidade entre a população humana. A alta taxa de substituição de bases possibilita que seja observada uma ou mais diferenças na seqüência nucleotídica das regiões hipervariáveis do mtDNA, quando indivíduos da linhagem materna de uma mesma família são comparados (JARRETA, 1999).
Por outro lado, o mtDNA está presente em grande quantidade em todas as células (entre 1.000 e 10.000 moléculas de mtDNA por célula), o que lhe confere um menor risco de degradação em relação ao DNA nuclear. Por ele estar protegido por uma membrana, o torna extremamente importante quando do estudo de espécimes biológicas antigas, cujo DNA nuclear, em cópia única, em geral, encontra-se degradado. 
A ocorrência de heteroplasmia é outro fator que se deve levar em conta ao analisar o mtDNA. Esta se caracteriza pela presença, em um mesmo indivíduo de mais um genótipo de DNA mitocondrial (BUTLER e LEVIN, 1998). O fenômeno pode decorrer da mutação do genoma de uma ou mais mitocôndrias, gerando uma mistura de moléculas mutantes e normais. Quando uma célula heteroplasmática se divide, a herança mitocondrial nas células filhas ocorre ao acaso. Depois de vários ciclos de divisão celular, é possível que prevaleça, dentro de uma célula, somente uma das formas de mtDNA, ou o normal ou o mutante. Esse processo pode ocorrer em uma célula somática quanto em células germinativas femininas (GÓES, 2003). 
 
Especial relevância adquire a heteroplasmia quando se compara DNAs mitocondriais de familiares, principalmente, quando vestígios em análise podem ser provenientes de amostras biológicas de diferentes tecidos do mesmo indivíduo. Quando a mesma heteroplasmia é observada na amostra em questão e na referência, interpreta-se como reforço para a vinculação entre as mesmas. É mais provável que a heteroplasmia seja uma herança materna quando é detectada em todos os tecidos estudados. Por outro lado, a ocorrência de heterplasmia em um único tecido de um indivíduo parece ser proveniente de mutação somática (CALLOWAY et al, 2000). É mais freqüente o encontro de heteroplasmia em indivíduos com idade mais avançada (GÓES, 2003; MARINHO, 2003).
Análise do DNA mitocondrial
O método mais utilizado no estudo do polimorfismo do mtDNA consiste em amplificar a região controle, por meio da técnica de PCR e seqüênciar o produto amplificado. Então, são verificadas mutações pontuais, inserções e deleções em relação à seqüência padrão, descrita por Anderson (1981).
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Com relação ao DNA mitocondrial antigo, deve-se estar atento ao fato de que este se apresenta em baixas concentrações, e a presença de um DNA externo à preparação pode facilmente provocar uma contaminação.
As regiões hipervariáveis contem um sitio rico em citosina, denominado poli C, apresentando uma timina localizada aproximadamente no centro da seqüência. Estes sítios são altamente susceptíveis a mutação, e, usualmente, é verificada a substituição de timina por citosina. (CANN e WILSON, 1983). Também pode ocorrer o acréscimo de uma ou duas citosinas àquela região em algumas populaçõesde mitocôndria, gerando heteroplasmia. Este tipo de mutação pode promover o surgimento de cópias mais curtas em 10pb, quando na amplificação in vitro por PCR, considerando que o sítio poli C encontra-se localizado na região finalizadora HVII. O sítio poli C estando no centro da região HVI promove o abortamento precoce da reação de PCR (GÓES, 2003).
	A substituição do tipo transição é o polimorfismo dominante e a troca entre as bases T e C são mais freqüentes. Em estudo sobre o padrão de substituição de nucleotídeos nas regiões HVI e HVII, observou-se uma taxa de substituição em HVI duas vezes maior que HVII. Esta diferença é devida, principalmente, à alta freqüência de transições de pirimidina em HVI (MEYER, et al, 1999).
Emprego da análise de mtDNA 
Para fins forenses, a análise do mtDNA deve se restringir a situações em que não é possível a análise do DNA nuclear (fios de cabelo sem bulbo), isto é, quando não há material genético adequado e/ou suficiente para tipagem de regiões STR do DNA genômico, ou quando o material apresenta alta grau de degradação (ossos antigos). 
Por meio do conhecimento adquirido sobre a estrutura do mtDNA, o estudo da evolução humana experimentou enormes avanços, tendo em vista a possibilidade de se analisar com êxito, restos humanos antigos, como tecido cerebral de 7.000 anos de idade e ossos de até 5.500 anos. Como exemplo de estudos de evolução, a análise das variações do mtDNA permitiu a reconstrução de eventos migratórios de mulheres ancestrais e a conseqüente divisão de haplotipos, tendo sido proposto que a espécie humana surgiu na África a aproximadamente 150.000 anos (VIGILANT, et al, 1991). 
Para identificar os haplogrupos mais antigos, os haplotipos humanos foram comparados ao mtDNA de chipanzé. Os haplotipos africanos apresentam a maior variação, e a raiz mais profunda da árvore filogenética, consiste na origem, na África da espécie humana. A árvore filogenética consiste nos seguintes grupos: Africano, com 3 haplotipos (L1, L2, e L3); Europeu com 9 haplotipos (H, T, U, V, W, Y, I, J, K); Asiático, com 2 macrohaplogrupos, divididos em vários haplotipos e, Americano, com 5 haplotipos (A, B, C, D e X). Uma vez que os haplotipos A, B, C e D são características do grupo Asiático, especula-se que o grupo Americano teria se originado deste por meio de migrações a partir da Sibéria (WALLACE et al, 1999)
Diferenças Básicas entre o DNA Nuclear e o DNA Mitocondrial
Conforme descrito anteriormente, existem inúmeras diferenças entre o Dna Nuclear e o DNA Mitocondrial. As principais diferenças estão listadas no quadro 1, abaixo demonstrado:
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Quadro 1- Diferenças Básicas entre o DNA Nuclear e o DNA Mitocondrial
	PARÂMETRO
	DNA NUCLEAR
	DNA MITOCONDRIAL
	Localização
	No núcleo da célula, protegido pela membrana nuclear
	Nas mitocôndrias, protegidas pela membrana mitocondrial – influência de radicais livres
	Conformação
	Dupla hélice
	Dupla fita circular
	Mecanismo de proteção
	Protegido por histonas
	Desprovido de histonas
	N° de Genes
	100.000 genes
	37 genes
	Funcionamento
	Autônomo
	Necesita da cooperação do DNA nuclear
	Composição
	Regiões codificantes (éxons) e não codificantes (íntrons)
	90% DNA codificante
	Característica do genoma
	Genoma diploide (materno/ paterno) – sofre recombinação
	Genoma haploide (herança materna) – não sofre recombinação
	
	
	Formação momentânes de fita simples
	N° de pares de bases
	Bilhões de pares de bases 
	16.569 pares de bases
	Atividade da Polimerase
	Grande
	Fraca
	Sistema de reparo
	Presente
	Ausente
	Taxa de evolução
	Pequena
	5 a 10 x maior que a nuclear
	N° de DNA por célula
	1
	1.000 a 10.000
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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