Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS - CCE DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA - DBQ BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL- 4965/003 CONSUMO DE CARBOIDRATO POR LEVEDURAS (Saccharomyces cerevisae) Acadêmicos: Denys Marcel de Moraes Fertonani R.A.: 115213 Gabriella Pereira Furio R.A.: 109383 Guilherme Hannoun Giudai R.A.: 104890 Isabela Batistella Regodanso R.A.: 109568 Docente: Paulo Sérgio Alves Bueno Maringá-PR Abril de 2022 1. INTRODUÇÃO As leveduras são microorganismos unicelulares eucariontes, que contém um núcleo no qual reside seu código genético (16 cromossomos). São fungos que têm o objetivo de decompor a matéria não viva. Tem importância na biotecnologias pois são capazes de produzir enzimas. Podem ser encontradas em superfícies de folhas, frutas, ou raízes na natureza onde contém quantidades elevadas de aminoácidos e açúcares. Em certas leveduras, podem contêm duas fases. Estas podem causar diversas doenças. Porém, apesar de culturalmente acreditar que os fungos trazem somente malefícios para o ser humano. Há importância na natureza, pois podem ser úteis como para a fermentação em indústrias de pão e cerveja, pela capacidade de fermentação, acompanhado álcool e gás carbônico [1]. A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura que é muito estudada e essencial às pesquisas de organismos eucariontes por sua natureza unicelular. A mesma tem papel importante por seu estilo de vida que se baseia em “criar-acumular-consumir”. Mesmo em condições aeróbias não utiliza seu maquinário de respiração para metabolizar sacarídeos. Produzirá pelo piruvato: 2 compostos carbonicos e etanol, promovendo o seu próprio crescimento [2]. É importante citar que as enzimas, diferente das bactérias, são utilizadas mais para reações anabólicas de compostos complexos [3]. A glicólise, também chamada de via glicolítica, vem da reação de quebra da glicose (de 6 carbonos), que formará 2 piruvatos (de 3 carbonos), haverá 2 etapas, a fase preparatória e a fase de pagamento, liberando energia em forma das coenzimas ATP. A etapa de pagamento terá 10 enzimas a qual pode ser mostrada na Figura 1. Para interromper a glicólise, é necessário inibir apenas uma delas. Comumente em estudos, a mais fácil sendo a inibição da enzima enolase, a penúltima etapa da via glicolítica, pois para inibir o processo, basta adicionar o fluoreto [4]. Figura 1. Processo de glicólise contendo 10 enzimas em azul. Fonte: [4]. O anticoagulante fluoreto é a formação de flúor associado com magnésio. Tem ação de inibidor principal para a enzima enolase, de forma que impede que sejam consumidas a glicose nas hemácias na solução do soro, e é necessário que o magnésio se complexe com a enolase para que a inibição aconteça. A inibição poderá ser desfeita com alteração do pH, porém terá o risco de contaminar a bactéria, por isso quando em uso experimentalmente, é ideal o uso de uma solução tampão [5]. Figura 2. Ação do reagente cloreto (magnésio) na enolase. (Fonte: Slides Prof. Paulo Sérgio Alves Bueno). 2. OBJETIVOS Aferir o consumo da glicose por leveduras do tipo Saccharomyces cerevisiae na presença e ausência do fluoreto. 3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Primeiramente, identificou-se 2 erlenmeyers, sendo o primeiro, o frasco destinado à análise da ação do fluoreto no sistema e o segundo, o destinado para a análise de controle. Na vidraria 1, adicionou-se, então, 10 mL de leveduras 1,5% ; 4 mL de fluoreto de sódio 1M e 10 mL da solução de glicose 24 mM. Já o conjunto 2 foi constituído pela adição de 10 mL de leveduras 1,5% ; 4 mL de água destilada e 10 mL da solução de glicose 24 mM. Com as soluções prontas, os sistemas foram incubados a 37ºC e retirou-se alíquotas de 0,1 mL das amostras de controle e com fluoreto, em intervalos de coleta de 20 minutos, para os tempos 0; 20; 40 e 60 min. Após a incubação, adicionou-se 0,9 mL de água destilada e 0,5 mL de DNS em cada um dos 8 tubos de ensaio e preparou-se, também, a solução denominada branco, com a adição de 1 mL de leveduras 1,5% ; 1 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0 e 0,4 mL de água. Transferiu-se uma alíquota de 0,1 mL do branco para outro tubo de ensaio, inseriu-se 0,9 mL de água destilada e 0,5 mL de DNS e ferveu-se a mistura por 5 min para posterior leitura no espectrofotômetro. O aquecimento também foi realizado com as 8 amostras coletadas e observou-se os resultados referentes às divergências de coloração. Cuidadosamente, transferiu-se parte do sobrenadante para a cubeta e se procedeu às leituras em 540 nm, anotando os valores das absorbâncias em duas tabelas diferentes, uma para os sistemas de controle e outra para o conjunto com fluoreto. 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES A observação do processo de consumo da glicose na presença ou ausência do fluoreto foi mais eficaz devido a utilização do método do DNS - método baseado na reação de redução apresentada pela molécula de ácido 3,5-dinitrosalicílico na presença de açúcares redutores, caracterizada pela mudança de coloração de amarelo para alaranjado- vermelho- marrom, como esquematizado na relação subsequente. Figura 1. Reação envolvida no método do DNS. (Fonte: Slides Prof. Paulo Sérgio Alves Bueno). Os resultados obtidos na prática foram evidenciados abaixo. Figura 2. Amostras obtidas para o processo de Figura 3. Amostras obtidas para o processo de consumo de glicose na presença de fluoreto consumo de glicose na ausência de fluoreto (Fonte: Autoral). Os resultados quantitativos de absorbância, lidos no espectrofotômetro foram anotados nas tabelas abaixo, orientadas mediante a presença ou ausência de fluoreto. Com base na absorbância e no fator de calibração pré-estabelecido, cujo valor foi 6,72, calculou-se, também, a concentração de glicose em cada amostra com base na equação: (Equação 1. Cálculo da concentração de glicose)[𝐺𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒] = 𝐴 𝑥 𝐹𝐶 (1.1)[𝐺𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒] = 𝐴 𝑥 6, 72 Tabela 1. Dados coletados para o consumo de glicose por leveduras na presença de fluoreto. COM FLUORETO Tempo (min) Absorbância (nm) [Glicose] (mM) 0 0,175 1,176 20 0,185 1,2432 40 0,126 0,84672 60 0,173 1,16256 (Fonte: Autoral). Tabela 2. Dados coletados para o consumo de glicose para o conjunto de controle. CONTROLE Tempo (min) Absorbância (nm) [Glicose] (mM) 0 0,110 0,7392 20 0,081 0,54432 40 0,062 0,41664 60 0,066 0,44352 (Fonte: Autoral). Figura 4. Gráfico da concentração de glicose em função do tempo na ausência de fluoreto. (Fonte: Autoral). Figura 5. Gráfico da concentração de glicose em função do tempo na presença de fluoreto. (Fonte: Autoral). 5. CONCLUSÃO Por intermédio de uma prática relativamente simples, foi possível constatar a influência do componente de fluoreto no processo do consumo de carboidratos pela levedura Saccharomyces cerevisiae. De forma geral, observou-se que comparado aos valores teóricos da reação, o último dado obtido na ausência de fluoreto deve ser descartado pois, não deveria ocorrer crescimento do consumo de glicose. Apesar disso, nota-se que na Figura 5. o gráfico apresenta o crescimento da quantidade de glicose neste sistema na presença de fluoreto. Isto indica que há algo utilizando o piruvato na produção de glicose, indicando qual o melhor tempo para a adição de DNS quando deseja-se inibir a bactéria. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Yeast Archives. Disponível em <http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/yeast.htm> Acesso dia 11 de abril de 2022 [2] Saccharomyces cerevisiae and its industrial applications. Disponível em <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7099199/>. Acesso dia 11 de abril de 2022 [3] Bacterial, enzymes and chemical differences. Disponível em <https://www.tlc-products.com/downloads/what-are-bacteria-vs-enzymes-vs-chemicals.pdf>. Acesso dia 11 de abril de 2022 [4] Glicólise (via glicolítica). Disponivel em <https://medpri.me/upload/texto/texto-aula-995.html>. Acesso dia 11 de abril de 2022 [5] Identification of crucial yeast inhibitors in bio-ethanoland improvement of fermentation at high pH and high total solids. Disponível em <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21624827/>. Acesso dia 11 de abril de 2022
Compartilhar