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Relatório 6 BQI exp - Consumo de glicose por leveduras

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS - CCE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA - DBQ
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL- 4965/003
CONSUMO DE CARBOIDRATO POR LEVEDURAS (Saccharomyces cerevisae)
Acadêmicos: 
Denys Marcel de Moraes Fertonani R.A.: 115213
Gabriella Pereira Furio R.A.: 109383
Guilherme Hannoun Giudai R.A.: 104890
Isabela Batistella Regodanso R.A.: 109568
 
Docente:
Paulo Sérgio Alves Bueno
Maringá-PR
Abril de 2022
1. INTRODUÇÃO
As leveduras são microorganismos unicelulares eucariontes, que contém um núcleo no qual
reside seu código genético (16 cromossomos). São fungos que têm o objetivo de decompor a matéria
não viva. Tem importância na biotecnologias pois são capazes de produzir enzimas. Podem ser
encontradas em superfícies de folhas, frutas, ou raízes na natureza onde contém quantidades elevadas
de aminoácidos e açúcares. Em certas leveduras, podem contêm duas fases. Estas podem causar
diversas doenças. Porém, apesar de culturalmente acreditar que os fungos trazem somente malefícios
para o ser humano. Há importância na natureza, pois podem ser úteis como para a fermentação em
indústrias de pão e cerveja, pela capacidade de fermentação, acompanhado álcool e gás carbônico [1].
A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura que é muito estudada e essencial às pesquisas de
organismos eucariontes por sua natureza unicelular. A mesma tem papel importante por seu estilo de
vida que se baseia em “criar-acumular-consumir”. Mesmo em condições aeróbias não utiliza seu
maquinário de respiração para metabolizar sacarídeos. Produzirá pelo piruvato: 2 compostos
carbonicos e etanol, promovendo o seu próprio crescimento [2]. É importante citar que as enzimas,
diferente das bactérias, são utilizadas mais para reações anabólicas de compostos complexos [3].
A glicólise, também chamada de via glicolítica, vem da reação de quebra da glicose (de 6
carbonos), que formará 2 piruvatos (de 3 carbonos), haverá 2 etapas, a fase preparatória e a fase de
pagamento, liberando energia em forma das coenzimas ATP. A etapa de pagamento terá 10 enzimas a
qual pode ser mostrada na Figura 1. Para interromper a glicólise, é necessário inibir apenas uma
delas. Comumente em estudos, a mais fácil sendo a inibição da enzima enolase, a penúltima etapa da
via glicolítica, pois para inibir o processo, basta adicionar o fluoreto [4].
Figura 1. Processo de glicólise contendo 10 enzimas em azul.
Fonte: [4].
O anticoagulante fluoreto é a formação de flúor associado com magnésio. Tem ação
de inibidor principal para a enzima enolase, de forma que impede que sejam consumidas a
glicose nas hemácias na solução do soro, e é necessário que o magnésio se complexe com a
enolase para que a inibição aconteça. A inibição poderá ser desfeita com alteração do pH,
porém terá o risco de contaminar a bactéria, por isso quando em uso experimentalmente, é
ideal o uso de uma solução tampão [5].
Figura 2. Ação do reagente cloreto (magnésio) na enolase.
(Fonte: Slides Prof. Paulo Sérgio Alves Bueno).
2. OBJETIVOS
Aferir o consumo da glicose por leveduras do tipo Saccharomyces cerevisiae na
presença e ausência do fluoreto.
3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Primeiramente, identificou-se 2 erlenmeyers, sendo o primeiro, o frasco destinado à
análise da ação do fluoreto no sistema e o segundo, o destinado para a análise de controle. Na
vidraria 1, adicionou-se, então, 10 mL de leveduras 1,5% ; 4 mL de fluoreto de sódio 1M e 10
mL da solução de glicose 24 mM. Já o conjunto 2 foi constituído pela adição de 10 mL de
leveduras 1,5% ; 4 mL de água destilada e 10 mL da solução de glicose 24 mM. Com as
soluções prontas, os sistemas foram incubados a 37ºC e retirou-se alíquotas de 0,1 mL das
amostras de controle e com fluoreto, em intervalos de coleta de 20 minutos, para os tempos 0;
20; 40 e 60 min.
Após a incubação, adicionou-se 0,9 mL de água destilada e 0,5 mL de DNS em cada
um dos 8 tubos de ensaio e preparou-se, também, a solução denominada branco, com a adição
de 1 mL de leveduras 1,5% ; 1 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0 e 0,4 mL de água.
Transferiu-se uma alíquota de 0,1 mL do branco para outro tubo de ensaio, inseriu-se 0,9 mL
de água destilada e 0,5 mL de DNS e ferveu-se a mistura por 5 min para posterior leitura no
espectrofotômetro. O aquecimento também foi realizado com as 8 amostras coletadas e
observou-se os resultados referentes às divergências de coloração. Cuidadosamente,
transferiu-se parte do sobrenadante para a cubeta e se procedeu às leituras em 540 nm,
anotando os valores das absorbâncias em duas tabelas diferentes, uma para os sistemas de
controle e outra para o conjunto com fluoreto.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A observação do processo de consumo da glicose na presença ou ausência do fluoreto
foi mais eficaz devido a utilização do método do DNS - método baseado na reação de
redução apresentada pela molécula de ácido 3,5-dinitrosalicílico na presença de açúcares
redutores, caracterizada pela mudança de coloração de amarelo para alaranjado- vermelho-
marrom, como esquematizado na relação subsequente.
Figura 1. Reação envolvida no método do DNS.
(Fonte: Slides Prof. Paulo Sérgio Alves Bueno).
Os resultados obtidos na prática foram evidenciados abaixo.
Figura 2. Amostras obtidas para o processo de Figura 3. Amostras obtidas para o processo de
consumo de glicose na presença de fluoreto consumo de glicose na ausência de fluoreto
(Fonte: Autoral).
Os resultados quantitativos de absorbância, lidos no espectrofotômetro foram
anotados nas tabelas abaixo, orientadas mediante a presença ou ausência de fluoreto. Com
base na absorbância e no fator de calibração pré-estabelecido, cujo valor foi 6,72,
calculou-se, também, a concentração de glicose em cada amostra com base na equação:
(Equação 1. Cálculo da concentração de glicose)[𝐺𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒] = 𝐴 𝑥 𝐹𝐶
(1.1)[𝐺𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒] = 𝐴 𝑥 6, 72
Tabela 1. Dados coletados para o consumo de glicose por leveduras na presença de fluoreto.
COM FLUORETO
Tempo (min) Absorbância (nm) [Glicose] (mM)
0 0,175 1,176
20 0,185 1,2432
40 0,126 0,84672
60 0,173 1,16256
(Fonte: Autoral).
Tabela 2. Dados coletados para o consumo de glicose para o conjunto de controle.
CONTROLE
Tempo (min) Absorbância (nm) [Glicose] (mM)
0 0,110 0,7392
20 0,081 0,54432
40 0,062 0,41664
60 0,066 0,44352
(Fonte: Autoral).
Figura 4. Gráfico da concentração de glicose em função do tempo na ausência de fluoreto.
(Fonte: Autoral).
Figura 5. Gráfico da concentração de glicose em função do tempo na presença de fluoreto.
(Fonte: Autoral).
5. CONCLUSÃO
Por intermédio de uma prática relativamente simples, foi possível constatar a
influência do componente de fluoreto no processo do consumo de carboidratos pela levedura
Saccharomyces cerevisiae. De forma geral, observou-se que comparado aos valores teóricos
da reação, o último dado obtido na ausência de fluoreto deve ser descartado pois, não deveria
ocorrer crescimento do consumo de glicose. Apesar disso, nota-se que na Figura 5. o gráfico
apresenta o crescimento da quantidade de glicose neste sistema na presença de fluoreto. Isto
indica que há algo utilizando o piruvato na produção de glicose, indicando qual o melhor
tempo para a adição de DNS quando deseja-se inibir a bactéria.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Yeast Archives. Disponível em <http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/yeast.htm>
Acesso dia 11 de abril de 2022
[2] Saccharomyces cerevisiae and its industrial applications. Disponível em
<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7099199/>. Acesso dia 11 de abril de 2022
[3] Bacterial, enzymes and chemical differences. Disponível em
<https://www.tlc-products.com/downloads/what-are-bacteria-vs-enzymes-vs-chemicals.pdf>.
Acesso dia 11 de abril de 2022
[4] Glicólise (via glicolítica). Disponivel em
<https://medpri.me/upload/texto/texto-aula-995.html>. Acesso dia 11 de abril de 2022
[5] Identification of crucial yeast inhibitors in bio-ethanoland improvement of
fermentation at high pH and high total solids. Disponível em
<https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21624827/>. Acesso dia 11 de abril de 2022

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