Introdução à Imunologia

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IMUNOLOGIA
Imunidade: reação a substâncias estranhas incluindo micro-organismos e macromoléculas como proteínas e polissacarídeos, independente das consequências fisiológicas ou patológicas de tal reação.
Funções da resposta imune: Reconhecimento imunológico (reconhece o patógeno); 
Funções imunes efetoras (elimina o patógeno); 
Regulação imune; 
Memória imunológica (evita que tenhamos uma doença novamente)
Patógenos: podem ser intracelulares, extracelulares, pluricelulares e unicelulares e para cada um há um mecanismo de defesa diferente.
Os principais componentes do sistema imunológico natural são as barreiras (mecânicas, químicas, e microbiológicas) que impedem que os patógenos cruzem os epitélios e colonizem os tecidos. As barreiras mecânicas são as lagrimas, cílios basais, e movimento do muco pelos cílios. As barreiras químicas são os ácidos graxos, baixo pH e enzimas. Já a principal barreira microbiológica é a microbiota.
A defesa contra o patógeno invasor é media por IMUNIDADE ADAPTATIVA e IMUNIDADE INATA.
A imunidade inata é uma resposta imediata (em torno de algumas horas), invariável, e não especifica, é constante durante a resposta. A imunidade inata reconhece um fator (determinantes estruturais) que estão distribuídos em vários patógenos.
A imunidade adaptativa ou adquirida é uma resposta lenta (demora dias ou semanas), variável, muito especifico altamente seletivo e há melhoras durante a resposta. A resposta adaptativa reconhece determinantes estruturais exclusivos de um único patógeno. A imunidade adaptativa depende da imunidade inata porque a inata é a primeira a ser estimulada. 
No corpo humano existem diversos locais onde há produção de células linfoides maduras que vão agir no combate de agressores internos. 
Os órgãos linfoides primário representam o local onde ocorrem as principais fases de amadurecimento dos linfócitos. São tecidos primários o timo e a medula óssea, pois é o local onde amadurecem os linfócitos T e B respectivamente, estes não formam células ativas na resposta imune, formam até o estágio de pró-linfócitos.
Os órgãos linfoides secundários são os que efetivamente participam da resposta imune, seja ela humoral ou celular. As células presentes nesses tecidos secundários tiveram origem nos tecidos primários, que migraram pela circulação e atingiram o tecido. Neles estão presentes os nodos linfáticos difusos, ou encapsulados como os linfonodos, as placas de Peyer, tonsilas, baço e medula óssea.
 Portanto, conclui–se que os órgãos linfóides primários, onde os linfócitos primeiramente expressam os receptores de antígenos e atingem a maturidade fenotípica e funcional. Órgãos linfóides secundários, onde as respostas dos linfócitos aos antígenos estranhos são iniciadas e se desenvolvem.
O sistema linfático: drena fluidos extracelulares periféricos ou seja dos tecidos para o sistema circulatório. 
PROCESSO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA
Com a agressão tecidual há a liberação de citocinas e quimiocinas pela bactéria ou patógeno que ativam os macrófagos ( fazem a fagocitose), que são atraídos para o foco da lesão. O órgão linfoide secundário capta tudo que esta na inflamação e então há a resposta mediada pelos linfócitos que se desenvolveram por causa da presença do patógeno. Os sinais do processo de inflamação são: Dor (causado pelo aumento de líquido e da compressão dos terminais sensitivos) Calor (causado pelo aumento do fluxo sanguíneo), Rubor (vasodilatação e também é causado pelo aumento do fluxo sanguíneo) e Tumor (inchaço por aumento de líquido). 
As células dendriticas iniciam a resposta imune adaptativa, sua maturação ocorre durante o transporte do patógeno, e quando maduras ativam células T virgens nos órgãos linfoides.
Seleção clonal → uma linhagem germinativa codifica muitos receptores de antígenos diferentes, um para cada determinante antigênico para o qual o indivíduo será capaz de montar uma resposta imune. O antígeno seleciona aqueles clones de células que tem o receptor apropriado. Os 4 princípios básicos da hipótese de seleção clonal são:
Cada linfócito carrega um único tipo de receptor com uma especificidade única.
A interação entre uma molécula estranha e um receptor de linfócito capaz de se ligar a esta molécula com alta afinidade leva a ativação do linfócito.
As células efetoras diferenciadas de um linfócito ativado ira carregar receptores de especificidade idêntica aquela da célula parental da qual o linfócito foi derivado.
 Linfócitos carregando receptores para moléculas próprias são deletadas nos estágios iniciais de desenvolvimento da célula linfoide e estão, portanto ausentes no repertório de linfócitos maduro. 
Reconhecimento dos antígenos por células B
Os linfócitos são as únicas células do sistema imune que apresentam receptores específicos para os antígenos. No caso dos linfócitos B os receptores de antígenos são moléculas de imunoglobulinas, que se encontram imersas na parede da célula. Quando os receptores de células B (BCR) são ativados, eles produzem e liberam um anticorpo especifico (ampla variedade de especificidade, mas cada célula com especificidade única).
Os receptores de células T (TCR) são receptores antígenos-específicos essenciais para a resposta imune, existem somente como proteínas ancoradas na superfície externa dos linfócitos T e reconhecem antígenos que tenham sido previamente processados em peptídeos. Não há libera de nada, o receptor sempre fica ligado na membrana. Tem fragmentos semelhantes dos anticorpos ligados à membrana, são duas cadeias glicosiladas (α eβ) com região variável e constante em cada cadeia. 
 
A diversidade dos receptores de antígenos dos linfócitos é gerado pelo rearranjo dos segmentos gênicos somáticos. Um anticorpo (célula B) se liga diretamente a um antígeno ao passo que um receptor de célula T se liga a um complexo de fragmento antigênico e a uma molécula própria.
Os linfócitos T só reconhecem proteínas. 
Dois sinais são necessários para a ativação do antígeno nos linfócitos T: ocorre a ligação antígeno-receptor e co-estimulação da célula T por uma célula dendrítica. Nos linfócitos B ocorre a ligação antígeno-anticorpo e ativação da célula B por uma célula T. 
Anticorpos lidam com formar extracelulares de patógenos e seus produtos tóxicos. O anticorpo pode ser de neutralização, ativação do complemento e opsonização, 
As células T fazem eliminação de patógenos intracelulares e ativação de linfócitos B conta a maioria dos antígenos. 
Anticorpos → estrutura e geração de sua diversidade
A resposta imune humoral é mediada por moléculas de anticorpos secretados por células plasmáticas. A imunidade humoral é o principal mecanismo de defesa contra micro-organismos extracelulares e suas toxinas pois os anticorpos podem se ligar a eles e ajudar na sua eliminação.
A principal função do anticorpo é neutralização de micro-organismos e toxinas. Opsonização é o processo pelo qual os micro-organismos ou partículas são recobertas pelo anticorpo (permitindo a fagocitose), os anticorpos também são responsáveis pela ativação do sistema complemento. 
Os anticorpos servem como ponte entre o patógeno e os mecanismos efetores, o anticorpo tem uma região variável (Fab – faz ligação com o antígeno especificoe é constituído de uma cadeia leve e uma cadeia pesada, ambas constituindo uma cadeia constante –C – e outra variável –V)e uma porção constante (Fc – promove a ação efetora do anticorpo, pois interage com outras células e/ou proteínas do sistema imunológico). 
Os anticorpos possuem açúcar em sua estrutura (são glicoproteínas), esses açucares impedem que proteases plasmáticas lizem os anticorpos e aumenta também a solubilidade deles.
Os anticorpos são moléculas flexíveis e permitem que vário antígenos se liguem ao anticorpo, pois cada anticorpo tem pelo menos 2 sítios de ligação. Tanto na cadeia leve como na cadeia pesada existem regiões de domínios variáveis(V) ou constante (C). As regiões de domínios variáveis é a região mais exposta e apresenta hipervariabilidade queé responsável por ligar o anticorpo. Essas regiões de hipervariabilidade formam uma estrutura tridimensional que se liga ao antígeno de forma complementar por isso são chamads de regiões determinantes de complementariedade (CDR’s) . Existem 3 regiões CDR na cadeia leve e 3 na cadeia pesada ou seja há 6 regiões CDR.
	 
As moléculas de anticorpos podem ser divididas em classes e subsclasses distintas com base nas diferenças nas estruturas das regiões C das cadeias pesadas. As classes das moléculas de anticorpos também são chamadas de isotipos e são denominadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Função: 
IgA : imunidade das mucosas
IgD : presente em poucas quantidades no sangue, serve como receptor de antígenos nas células B inativas
IgE : causa reações alérgicas
IgG: Opsonização e ativação do complemento, citoxicidade celular dependente de anticorpo, imunidade neonatal, inibição por feed back das células B. É o anticorpo mais prevalente.
IgM: receptor de antígenos das células B inativas, ativação do complemento.
Antígenos: qualquer molécula que pode estimular o sistema imune.
Epítopos: regiões do antígeno onde o anticorpo se liga.
As interações antígenos e anticorpos são ligações fortes, resultado de várias ligações fracas (forças não covalentes são o que mantem o complexo unido) e pode ser chamado de efeito velcro.
DIVERSIDADE DAS IMUNIGLOBULINAS
Rearranjo gênico → seleção de alguns genes que unidos pelo DNA, são responsáveis pela diversidade dos receptores de antígenos.
O controle genético da produção da cadeia leve é feito por dois genes no domínio variável e um gene para o domínio constante. Então: 
Na cadeia leve cada domínio V é codificado por 2 segmentos de DNA separados. O primeiro segmento codifica aminoácidos e é chamado de segmento gênico variável (V) e o segundo segmento codifica o restante do domínio V e é chamando de segmento gênico de junção (J). as junções dos segmentos V e J criam um pedado de DNA contínuo que codifica para toda a região de cadeia leve.
As regiões V da cadeia pesada são codificadas por 3 segmentos gênicos: V, J e pelo semento gênico de diversidade (D). 
Há a possibilidade de ter 320 tipos diferentes de cadeia leve e 10530 possibilidades de cadeia pesada, ou seja, há 3,4 milhões de combinações diferentes possíveis para cada individuo devido ao rearranjo gênico. 
RSS – sequência sinal de recombinação 
A RSS são sequências heptoméricas e nanoméricas, que permitem o perfeito ajuste entre os segmentos de V,D, J ou V e J de forma que o DNA pode ser cortado ‘rente’ logo após um V e emendado em um J.
Enzima RAG1 e RAG2 – enzimas que tem a capacidade de clivar segmentos de DNA e fazer a sinalização para outras enzimas que irão unir esses segmentos, produzindo formas funcionais de imunoglobulinas através do rearranjo gênico.
Adição de nucleotídeos N e P – feita pelas TdT’s, aumenta a diversidade pois são adicionadas nas junções dos segmentos. Ocorrendo também deleção de alguns nucleotídeos das extremidades de alguns segmentos. 
O repertório primário de anticorpos é diversificado por 3 processos que modificam os genes de imunoglobulinas rearranjadas: 
Hipermutação somática
Convenção gênica 
Troca de classe
A hipermutação somática introduz mutações nas regiões variáveis das imunoglobulinas rearranjadas que aprimora a ligação do antígeno. 
A troca de classe envolve recombinação entre sinal de trocas específicas.
Reconhecimento dos antígenos pelos linfócitos T e apresentação de antígenos
Ao contrário das imunoglobulinas as quais interagem com patógenos e seu produtos tóxicos no espaço extracelular do organismo, as células T somente reconhecem antígenos estranhos que são apresentado na superfície das próprias células do organismo. 
As células T podem detectar a presença de patógenos intracelulares, porque as células infectadas expõem em sua superfície fragmentos peptídicos oriundos das proteínas dos patógenos. Esses peptídeos estranhos são liberados para a superfície das células por glicoproteínas especializadas das células hospedeiras chamadas de MHC. O reconhecimento do antígeno peptídico ligado a uma molécula de MHC e exposto na superfície celular é uma das características distintas das células T.
Os receptores de células T diferem dos de células B por duas coisas: O receptor T possui apena um sítio de ligação e o receptor de célula B possui dois. Os receptores de células T nunca são secretados ao passo que as imunoglobulinas são secretadas em forma de anticorpo.
As moléculas de MHC
MHC de classe I : É expressa por células nucleares. Transporte ativo de peptídeo do citosol para o RE para a apresenta às células TCD8 efetoras que matam as células infectadas.
-Patógenos citosólicos são degradados no citosol, os peptídeos ligam-se a ao MHC de classe I que são apresentados as células TCD8, e esta então morre.
MHC de classe II: É expressa por células apresentadoras de antígenos profissionais: linfócitos B, macrófagos e células dendriticas. Apresenta um sulco criado pela flexibilidade pelas duas cadeias α e β e é nesse sulco que os peptídeos do antígeno irão se ligar, para a degradação e formação de vesículas lisossomais que irão se fundir com vesículas do golgi.
A MHCII tem possui um peptídeo de proteção chamado CLIP que deve ser retirado do sulco pela HLA – DM para permitir a ligação do peptídeo. 
- patógenos intracelulares tem suas vesículas sendo degradadas em baixo pH, os peptídeos residuais ligam-se ao MHCII e são apresentados as células T CD4 efetoras que vão ativar os linfócitos B para a secreção de Ig e destruindo a bactérias e toxinas intracelulares. 
Moléculas de MHCI não deixam o reticulo endoplasmático a menos que estejam ligados a peptídeos TAP1 e TAP2 que são um portão que liga a luz do citossol a luz do RE. TAP1 e TAP2 permitem a entrada somente de peptídeos pequenos porque MHCI faz ligações de peptídeos pequenos porque MHCI só consegue ligar-se com peptídeos de 7 a 9 resíduos.
Animais Knockout RAG1 e RAG 2 não produzem linfócitos T e B
Knockout HLA-DM – na MHCI não tem nada, na MHCII não retira o CLIP
Proteção na MHC II para não receber peptídeos da MHCI é feita pela cadeia invariável. 
ELISA 
CAPTURA DE ANTICORPO (indireto):
1º) Sensibilização: Coloca-se o antígeno na placa o deixa lá por um tempo, então ele fixa-se através de regiões hidrofóbicas (adsorção passiva).
2º) Bloqueio: adição de proteínas bloqueadoras imunologicamente não relacionadas ao ensaio. Essas pt irão bloquear o plástico, evitando a ocorrência de resultados falsos. Ex. de pt bloqueadora: caseína
3º) Reação primária: dilui-se a amostra do pct em solução tampão (1/100) Lava-se. Caso dê positivo o anticorpo ligou-se ao antígeno escolhido, caso dê negativo não se ligou.
4º) Lavagem
5º)Reação secundária: adiciona-se anticorpo secundário que reconhece o anticorpo humano. Esses anticorpos secundários recebem na região constante uma enzima imobilizada, ex.: peroxidase.
Acopla-se uma reação enzimática, que juntamente com a peroxidase fará a revelação.
Revelação: H2O2 + OPD(indicador – reduzido incolor)→ H2O + OPD (oxidado – laranja)
Amarelo, usou peroxidase – positivo
Incolor, não usou peroxidase – negativo
6º) Lavagem
7º) Substrato + cromogênio
8º) Bloqueio da reação. O bloqueio da reação vai ser feito por um ácido que vai desnaturar a enzima
CAPTURA DE ANTÍGENO:
Neste caso detecta-se a presença de determinado antígeno a partir do anticorpo de captura. A aderência do anticorpo de captura é feita através da pt A do S. aureus que adere o anticorpo pela cadeia pesada. Método de detecção por antígeno marcado (ex.: antígeno marcado com radioisótopo)
SANDUÍCHE:
(ANTICORPO de captura – ANTÍGENO – ANTICORPO de revelação). Neste caso usa-se outro anticorpo para fazer a revelação, esse anticorpo tem que reconhecer o mesmo antígeno, mas epítopos diferentes para ocorrer à ligação simultânea.
Anticorpos monoclonais
Surgem a partir de um linfócito B, que é clonado e imortal, produzindo sempre os mesmos anticorpos, em resposta a um agentepatogênico. Esses anticorpos apresentam-se iguais entre si na sua estruturam especificidade, e afinidade ligando-se por isso ao mesmo epítopo no antígeno.
Anticorpos policlonais
São provenientes de diferentes clones de linfócitos B produzidos a partir da exposição ao antígeno. 
Hibridomas
São gerados a partir da fusão de linfócitos B com células mielóides provenientes de tumores.
SELEÇÃO POR MEIO HAT
Serve para selecionar hibridomas de células que não se fusionaram. Existem duas vias que fazem a síntese de nucleotídeos: a via do novo e a via do salvamento.
Os linfócitos B tem a via do salvamento por ter hipoxantina/tímida que são substratos para a enzima que converte elas em purinas que é a HPRT (enzima hipoxantina fosforribosil transferase). Os linfócitos B também tem via de novo. Nas células mielóides não tem via de salvamento pois não expressam a HPRT e se no meio tiver aminopterina não vai haver a via de novo pois a aminopterina bloqueia a principal via de síntese de purinas e pirimidinas na célula mielóide que é a via do novo, portanto as células mielóides vão morrer. Já que os linfócitos B não crescem em meio de cultura, vão resistir apenas os hibridomas no meio HAT pois esses tem enzimas que quebram hipoxantina/tímida.
Semeia-se o hibridoma em placas e espera o meio HAT fazer a seleção, então adiciona-se macrófagos para a fazer a limpeza do meio. Com as colônias que crescem se faz ELISA (captura de anticorpo). Onde der positivo conta-se as células, põe na placa de novo para fazer uma nova ELISA e confirmar onde há anticorpo. 
DIFERENCIAÇÃO DE LINFÓCITOS T e B
Desenvolvimento de Células B → se desenvolvem na medula óssea e migram para os órgãos linfoides periféricos, onde podem ser ativados pelo antígeno. 
1º FASE) células B progenitoras rearranjam seus genes de Ig na medula óssea. Essa fase é independente do antígeno, mas depende de interações com células do estroma medular. Ela termina em uma célula B imatura que carreia um receptor de antígeno na forma IgM de superfície.
2º FASE) células B imaturas fortemente estimuladas pelo antígeno morrem ou são inativadas, em um processo de seleção negativa, removendo muitas células B autorreativas.
3º FASE) Células B maduras que não reagem com antígenos próprios, maturam para expressar IgD e IgM. Essas podem ser ativadas pelo encontro com o antígeno em um órgão linfoide secundário, fazendo seleção positiva.
4º FASE) Células B ativadas proliferam e podem se diferenciar em células plasmáticas secretoras de anticorpos ou células B de memória de vida longa.
Desenvolvimento de Linfócitos T → se desenvolvem no timo e migram para órgãos linfoides periféricos. 
1º FASE) células precursoras migram da medula óssea para o timo, ondem os genes de receptores de células T são rearranjados .
2º FASE) Células T imaturas que reconhecem o MHC próprio, recebem sinais de sobrevivência. As células que interagem fortemente com o antígeno próprio são removidas do repertório. Seleção positiva e negativa.
3º FASE) as células T que sobrevivem maturam e deixam o timo para circular nas periferias ondem encontram antígenos e são ativados. 
4º FASE) a ativação leva a expansão clonal e diferenciação das células T efetoras, essas são atraídas para os locais de infecção onde podem matar as células infectadas ou ativar os macrófagos. 
Células T podem ser atraídas para áreas onde tem células B para auxiliar na ativação de resposta do anticorpo.