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Métodos laboratoriais t6

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DESCRIÇÃO
Abordagem dos principais métodos laboratoriais empregados na imunologia clínica.
PROPÓSITO
Compreender os principais métodos laboratoriais empregados na imunologia clínica, bem como
sua importância e aplicabilidades na rotina laboratorial para auxiliar na escolha da melhor
metodologia para um diagnóstico confiável, rápido, de baixo custo e que possibilite um
tratamento eficaz e cuidadoso ao paciente.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Descrever os principais métodos laboratoriais imunológicos com reagentes não marcados
MÓDULO 2
Explicar os métodos laboratoriais imunológicos com reagentes marcados
INTRODUÇÃO
Neste tema, vamos explorar um pouco mais sobre a metodologia dos principais testes
imunológicos empregados em um laboratório de análises clínicas.
Você sabe o que é um teste imunológico?
Os testes imunológicos são metodologias amplamente empregadas para detectar anticorpos
contra os microrganismos (Parasitas, fungos, vírus e bactérias) . Isto é, antígenos que podem
ser o próprio patógeno que causou a enfermidade ou qualquer substância que se comporte
como um antígeno em uma interação com o anticorpo, como:
Hormônios
Drogas
Ácidos nucléicos
Receptores das células.
A partir desses testes, podemos fornecer uma confirmação diagnóstica, o diagnóstico precoce,
a fim de acompanhar a evolução e o tratamento de uma doença, além de confirmar a presença
de uma substância no organismo.
Atualmente, existe uma enorme variabilidade de testes imunológicos, como, por exemplo, as
reações de precipitação, reações de aglutinação, reações de fixação de complemento, ensaios
imunocromáticos, imunoenzimáticos, dentre outros. Todas essas técnicas são baseadas no
reconhecimento antígeno-anticorpo e podem ser feitas a partir de reagentes marcados com
algum corante fluorescente ou quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas que geram uma
coloração ao final da reação ou reagentes não marcados, gerando uma interação que é
visível a olho nu.
 DICA
Imunosorologia é a detecção quantitativa e qualitativa da interação antígeno e anticorpo que
visa o diagnóstico.
Você certamente já ouviu falar em ELISA, ensaios de precipitação e teste rápido. Sabe qual a
diferença entre eles? Ao longo desta jornada, vamos entender como esses testes são
realizados e como cada técnica pode ser empregada, compreendendo a diferença entre eles e
as principais vantagens e desvantagens. Para melhor entendimento, vamos dividir esses testes
em dois grandes grupos:
Métodos que usam reagentes não marcados
Métodos que usam reagentes marcados.
MÓDULO 1
 Descrever os principais métodos laboratoriais imunológicos com reagentes não
marcados
MÉTODOS LABORATORIAIS
IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO
MARCADOS
Como mencionamos, os métodos laboratoriais imunológicos que utilizam imunorreagentes
livres de marcação são técnicas que possibilitam uma interação antígeno e anticorpo que
podemos visualizar. Nesse tipo de reação, ocorre o reconhecimento de anticorpos com
antígenos solúveis e a formação de precipitados insolúveis.
Quando o antígeno pesquisado é um microrganismo, como uma bactéria, um protozoário, uma
hemácia, ou seja, um antígeno particulado, os anticorpos, ao reconhecerem o antígeno, irão se
aglutinar (Figura 1). De modo diferente, quando o antígeno está ligado à superfície celular, o
resultado da interação com o anticorpo pode ser a lise celular (Citólise) .
PRECIPITADOS
São produtos que não são capazes de se dissolver.
 
Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock
 Figura 1: Interação entre antígeno e anticorpo, resultando em aglutinação.
Dentre as técnicas imunológicas com reagentes não marcados, destacam-se:
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
AGLUTINAÇÃO
javascript:void(0)
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
São técnicas que consistem no reconhecimento de antígenos solúveis com seus anticorpos
complementares que também estão em solução, originando um agregado (Imunocomplexo)
que não se solubiliza (Precipitado) e é visível (Figuras 2 e 3).
 
Fonte: O autor
 Figura 2: Imunocomplexos.
 
Fonte: Wikimedia
 Figura 3: Formação dos imunocomplexos.
É importante ressaltar que, para que a reação de precipitação seja visível, um fator
determinante é a concentração de antígeno (Ag) e anticorpo presentes (Ac) . Quando as
concentrações dessas duas moléculas são equivalentes, ocorre uma precipitação máxima e,
assim, é possível visualizar a precipitação. Chamamos esse fenômeno de zona de
equivalência. De forma diferente, quando existe excesso de antígeno ou anticorpo, a interação
diminui e a formação de precipitado também, gerando resultados falso-negativos. Quando
temos excesso de anticorpos, ocorrem reações que não são visíveis a olho nu (Precipitação
subótima) , esse fenômeno é chamado de prozona (Figura 4).
PROZONA
Esse efeito pode ser observado em outros testes sorológicos, como aglutinação. Durante
os exames, a partir dessa técnica, são realizadas diferentes diluições para evitar
resultados falhos.
Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock
 Figura 4: Curva que mostra a reação de precipitação entre antígeno e anticorpo.
Entenda melhor a figura:
A
javascript:void(0)
javascript:void(0)
Na figura, temos em (A) excesso de anticorpos, o que resulta em precipitados pequenos que
não são visíveis a olho nu, efeito prozona.
B
Representa a zona de equivalência, com concentrações de antígeno e anticorpo equivalentes e
precipitação máxima e visível.
C
Em (C), o excesso de antígeno também gera precipitados pequenos, não visíveis a olho nu,
efeito pós-zona.
Nas reações de precipitação, para verificar a interação antígeno e anticorpo, são utilizados
diferentes meios reacionais, como, por exemplo, o meio líquido ou semissólido. Quando
realizadas em meio semissólido, essas reações são dividias em imunodifusão e
imunoeletroforese. As principais vantagens dessa técnica são rapidez, fácil execução, baixo
custo, podem ser testadas diferentes amostras e boa especificidade. No entanto, elas
apresentam uma baixa sensibilidade.
Agora vamos conhecer as peculiaridades de cada técnica de precipitação:
REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO LÍQUIDO,
TÉCNICA DE PRECIPITINA E/OU DO ANEL
A precipitação ocorre em tubos de ensaio ou em capilares e visa pesquisar a presença de
antígenos. Para isso, os tubos apresentam uma solução de anticorpos já conhecida, também
chamada de soro hiperimune e nele, cuidadosamente, é adicionado uma amostra, para
formar duas fases: uma inferior, com o soro hiperimune, e outra superior, com a amostra. Se o
antígeno pesquisado estiver presente na amostra, este migrará em direção ao soro, formando
um gradiente de concentração. Quando ocorrer a interação antígeno e anticorpo e esta estiver
na zona de equivalência, é possível verificar a formação de um precipitado visível (Um anel de
turvação) (Figura 5). Tal técnica é mais utilizada em laboratórios de pesquisa.
javascript:void(0)
javascript:void(0)
 
Fonte: O autor
 Figura 5: Esquema de reações de precipitação em meio líquido.
Antes de estudarmos as técnicas de precipitação em meio semissólido, devemos conhecer
mais um pouco sobre imunodifusão.
IMUNODIFUSÃO
Consiste na migração de antígenos solúveis em uma matriz gelatinosa (ágar ou um gel de
agarose) que contém um anticorpo em sua composição. É importante ressaltar que algumas
técnicas podem pesquisar anticorpos solúveis em uma matriz que apresente o antígeno
correspondente. Quando as moléculas estão livres, a difusão permanece constante, mas,
quando ocorre a interação de antígenos solúveis com os anticorpos, o
precipitado (Imunopreciptado) formado fica preso no gel de acordo com o peso molecular
desse complexo e assim, podem ser visualizados.
As técnicas de imunodifusão dependem de alguns parâmetros, são eles: concentração, pureza
e tamanho dos poros do gel, concentração dos antígenos e anticorpos, tempo de difusão,
temperatura, especificidade e avidez da interação antígeno e anticorpo.
Dependendo do tipo de migração do antígeno e do anticorpo sobre a matriz,a imunodifusão
pode ser dividida em simples, dupla ou radial.
ESPECIFICIDADE
javascript:void(0)
javascript:void(0)
Capacidade de um anticorpo apenas reconhecer o seu antígeno específico.
AVIDEZ
Força de interação total do antígeno com o anticorpo.
IMUNODIFUSÃO SIMPLES OU IMUNODIFUSÃO
UNIDIRECIONAL EM MEIO SEMISSÓLIDO
Quando um dos componentes (Ag ou Ac) fica fixado ao gel, enquanto o outro vai migrando até
que se forme os imunocomplexos.
O antígeno é colocado sobreposto a uma coluna de ágar, contendo o soro hiperimune. As
moléculas do antígeno irão penetrar no ágar e se difundirem com uma velocidade diferente
para cada substância, dependendo do peso molecular. Após o tempo de incubação de
normalmente uma semana, será possível observar o que chamamos de disco (banda) ou
zona de precipitação (Figura 06).
 
Fonte: Biosciencenotes
 Figura 6: Imunodifusão simples.
IMUNODIFUSÃO DUPLA OU IMUNODIFUSÃO DE
OUCHTERLONY
Quando o antígeno e o anticorpo migram ao mesmo tempo, um em direção ao outro para a
formação do imunocomplexos. Esse teste é realizado em uma lâmina de vidro ou placa de
Petri, que é coberta por uma camada fina de gel, com dois orifícios, onde em um é colocado o
antígeno e no outro o anticorpo, caso haja formação de imunocomplexos, há o aparecimento
de bandas ou linhas de precipitação (Figura 7). Essa é uma técnica semiqualitativa, que pode
ser utilizada para o diagnóstico de doenças infectocontagiosas, como candidíase,
histoplasmose e aspergilose.
Após a imunodifusão, podemos utilizar um corante para marcar as proteínas, a fim de visualizar
melhor as linhas de precipitação. A utilização desses corantes é preconizada quando temos
uma baixa concentração de antígenos e anticorpos, o que torna as bandas não visíveis.
 
Fonte: Biosciencenotes
 Figura 7: Imunodifusão dupla.
IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES (IMUNODIFUSÃO
DE MANCINI)
Quando o movimento do antígeno ocorre em todas as direções em um meio semissólido. Para
isso, uma lâmina de vidro ou uma placa de Petri é coberta com um gel impregnado de
anticorpo distribuído uniformemente, em seguida, as amostras em investigação são colocadas
em pequenos orifícios. Os antígenos presentes na amostra irão se difundir de forma radial e, à
medida que vão encontrando os anticorpos, há formação de imunocomplexos e de um halo de
precipitação ao redor do orifício (na forma de anel). Quanto maior a concentração do antígeno,
maior é o tamanho do halo (Figura 8).
 
Fonte: Microbenotes
 Figura 8: Imunodifusão radial.
Além das amostras testes, nessa técnica, são utilizadas soluções padrões com concentrações
conhecidas de antígenos. A partir do tamanho dos halos de precipitação obtidos com os
antígenos controles (padrão), podemos originar uma curva padrão e descobrir a concentração
de antígenos presentes em amostras de soros de pacientes, possibilitando uma análise
quantitativa. Essa técnica pode ser utilizada para quantificação de proteínas, como:
Imunoglobulinas
Proteínas séricas
Fatores do complemento
Proteínas de fase aguda (PCR)
IMUNOELETROFORESE (MÉTODO DE GRABAR
E WILLIAMS)
A imunoeletroforese é uma técnica de imunopreciptação em meio semissólido (gel) que
associa as técnicas de imunodifusão e a eletroforese. Como vimos, a imunodifusão verificará
a difusão do antígeno (ou anticorpo) sobre uma superfície gelatinosa composta de anticorpos
(ou antígeno) e a formação de zona de precipitação, indicando o reconhecimento antígeno-
anticorpo.
Mas e a eletroforese, você conhece?
 
Fonte: Shutterstock
A eletroforese é uma técnica que consiste na migração e separação de moléculas de acordo
com a carga após a geração de um campo elétrico. Ela utiliza diferentes meios de suporte,
como fitas ou membranas de poliacetato de celulose e géis de agarose.
No nosso organismo, diversas moléculas, como proteínas, aminoácidos, polipeptídios,
nucleotídeos e ácido nucleico, apresentam grupos funcionais ionizáveis que adquirem cargas
(positiva ou negativa) em um determinado pH. Assim, quando um campo elétrico é gerado, as
moléculas migrarão para o polo positivo (Ânodo) ou negativo (Cátodo) de acordo com a sua
carga líquida. Para verificação de proteínas, normalmente, é utilizado um tampão com pH entre
8,2 e 8,6 e, nessa solução, as moléculas são carregadas negativamente e migram em direção
ao ânodo (+) . As imunoglobulinas, em média, têm pouca carga neste pH e, portanto, migram
pouco desde o ponto de aplicação da amostra (origem). Além disso, a migração também
depende do tamanho e conformação das moléculas, proteínas de alto peso molecular migram
menos que as de baixo peso molecular.
Essa técnica é amplamente utilizada para:
Verificação analítica, como na avaliação de proteína sérica
Análises preparatórias, ou seja, na purificação de proteína que depois será estudada
Para a detecção específica de enzimas e suas isoformas (por meio de sua atividade
particular)
Detecção de antígenos (em combinação com uma variedade de técnicas imunológicas)
 SAIBA MAIS
As proteínas separadas por eletroforese podem ser fixadas e coradas com vários tipos de
corantes, como o preto de amido 10 B (azul escuro); Ponceau-S (vermelho); Coomassie G-250
(azul claro) ou Coomassie R-250 (violeta azul).
Agora que conhecemos mais sobre a eletroforese, vamos entender a técnica de
imunoeletroforese.
A imunoeletroforese é realizada em duas etapas:
 
Fonte: Adaptado de The Biotech Notes
A primeira separa as proteínas através da eletroforese. Para isso, um gel é preparado,
colocado em uma cuba de eletroforese, e o tampão é escolhido para que as partículas a serem
analisadas fiquem com as cargas negativas e migrem para o polo positivo. As amostras a
serem testadas (misturas de anticorpos ou antígenos) são aplicadas no gel (Figura 9A).
 Figura 9A: Esquema representando uma imunoeletroforese.
 
Fonte: Adaptado de The Biotech Notes
Nesse aparato, é aplicada uma diferença de potencial, que será responsável pela migração e
separação das moléculas de acordo com a carga, tamanho e conformação (Figura 9B).
 Figura 9B: Esquema representando uma imunoeletroforese.
 
Fonte: Adaptado de The Biotech Notes
Após a corrida eletroforética, é feita a imunodifusão de cada componente que foi separado no
gel. Para isso, é cortada uma canaleta entre os poços onde é colocado o antígeno ou anticorpo
correspondente (figura 9C).
 Figura 9C: Esquema representando uma imunoeletroforese.
 
Fonte: Adaptado de The Biotech Notes
À medida que ocorre uma interação antígeno-anticorpo, vamos ter uma linha de precipitação
em forma de arco na região de equivalência. Cada banda formada representa a formação de
um complexo imune específico (Figura 9D).
 Figura 9D: Esquema representando uma imunoeletroforese.
Essa é uma técnica qualitativa e semiquantitativa que possibilita distinguir substâncias de
acordo com suas cargas elétricas, seus pesos moleculares, tamanhos, sua conformação
espacial, concentração e suas propriedades antigênicas. Ela é muito empregada no
diagnóstico de gamopatias monoclonais, como o mieloma múltiplo e macroglobulinemia.
 SAIBA MAIS
O mieloma múltiplo é uma neoplasia da medula óssea que leva à proliferação das células B e
ao aumento descontrolado da produção de anticorpos monoclonais (normalmente, do tipo IgG
ou IgA) e fragmentos deles, chamados de proteína M. Nessa doença, as proteínas
monoclonais de IgM, IgA, IgD e IgE podem estar presentes em quantidades relativamente
pequenas quando comparadas à IgG. Um resultado de imunoeletroforese que não detecta a
porção da cadeia leve das imunoglobulinas não-IgG, mostra uma alteração no padrão de
produção desses anticorpos, o que é indicativo de gamopatias como o mieloma.
A partir da técnica de Grabar e Williams, outras metodologias foram desenvolvidas, são elas:
REAÇÃO DE IMUNOELETROFORESE
UNIDIMENSIONAL SIMPLES (ELETROFORESE DE
FOGUETE OU TÉCNICA DE LAURELL)
É uma adaptação da técnica de Graber e Williams, onde a eletroforese e a imunodifusão
ocorremao mesmo tempo com o deslocamento apenas da substância que se deseja analisar.
Para isso, uma pequena camada de gel incorporada com o anticorpo ou antígeno é preparada
sobre uma lâmina de vidro. As amostras são aplicadas em poços pré-formados, o tampão é
escolhido para que as partículas a serem analisadas fiquem com as cargas negativas e migrem
para o polo positivo e esse conjunto é submetido à eletroforese. Durante a eletroforese, à
medida que a substância vai migrando a partir do orifício de aplicação, ocorre a separação das
moléculas e o reconhecimento do antígeno-anticorpo , com a formação das linhas de
precipitação em formato de cone ou foguete. Isto porque, no início, há uma grande
concentração da substância de interesse, que ao longo da corrida eletroforética vai
diminuindo até que se esgote. É importante ressaltar que, durante a técnica, não ocorre a
migração da substância que está incorporada ao gel.
REAÇÃO DE IMUNOELETROFORESE DUPLA
BIDIMENSIONAL (CONTRAIMUNOELETROFORESE)
Nesta técnica, antígenos e anticorpos migram ao mesmo tempo por eletroforese, no mesmo
eixo, mas em direções opostas, resultando na precipitação no local onde ocorre o
reconhecimento antígeno e anticorpo. A reação de contraimunoeletroforese só é possível
quando antígenos e anticorpos migram em sentidos opostos durante a eletroforese, ou seja,
os anticorpos migram para o polo negativo (cátodo), enquanto os antígenos migram para o polo
positivo (ânodo). Nesse método, podemos realizar várias análises em somente uma lâmina, é
uma metodologia rápida e mais sensível que a imunodifusão, além de poder ser realizado em
membranas de acetato de celulose.
ANTÍGENOS MIGRAM PARA O POLO
POSITIVO
Esse fenômeno pode ser estimulado com o uso de tampões alcalinos.
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Fonte: O autor.
 Reação de imunoeletroforese dupla bidirecional.
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
As reações de aglutinação consistem na formação de um agregado visível após a interação de
anticorpos específicos com partículas insolúveis que contêm diferentes determinantes
antigênicos (local de ligação do anticorpo, ou epítopo) ligados à superfície dessas
partículas. Diferente da precipitação, onde os anticorpos e antígenos são solúveis, nessa
técnica, pelo menos uma substância deve ser insolúvel.
Mas o que são essas partículas insolúveis?
As partículas insolúveis podem ser um antígeno insolúvel, antígenos expressos na superfície
das membras plasmáticas, como os antígenos presente na membrana dos eritrocitários, ou
então partículas cobertas com os antígenos (exemplo: látex).
Essa técnica apresenta alta especificidade e reprodutibilidade, é de fácil execução, simples e
barata, mas apresenta baixa sensibilidade. É amplamente utilizada para tipagem sanguínea,
provas de compatibilidade transfusional, detecção de hormônios, detectar patógenos (Vírus,
bactérias, protozoários e fungos) e no diagnóstico das doenças autoimunes. Essas reações
são divididas em: reações de aglutinação direta, indireta, reações de inibição da aglutinação.
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Como o nome diz, é a interação direta entre antígenos presentes na superfície de uma
célula com o anticorpo correspondente. Os antígenos podem estar na sua forma integra ou
fragmentada. No entanto, para ocorrer uma aglutinação visível, é necessário que o anticorpo
reconheça pelo menos dois sítios antigênicos (bivalente), o que permite a ligação simultânea
com mais de um antígeno formando interações cruzadas e um agrupado de partículas visíveis
(rever a Figura 1).
FIGURA 1
 
Fonte: Shutterstock
 EXEMPLO
Classificação sanguínea, prova de compatibilidade, teste de Coombs direto e indireto e
sorotipagem bacteriana são exemplos dessa técnica.
Quando desejamos encontrar um anticorpo específico, devemos fazer diluições seriadas das
amostras frente a uma concentração fixa e conhecida do antígeno correspondente. Após o
javascript:void(0)
tempo de incubação, o resultado é expresso como título do anticorpo, ou seja, a última diluição
em que é possível verificar a aglutinação.
AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA
Essa reação consiste no reconhecimento de anticorpos presentes no soro com antígenos
presentes artificialmente em partículas inertes (látex ou gelatina) ou então hemácias, que são
sensibilizadas por adsorção passiva e desempenham uma função de suporte. Quando uma
amostra de soro ou plasma apresenta um anticorpo que reconheça os antígenos
correspondentes nas hemácias ou nas partículas inertes que formem pontes entre as partículas
vizinhas, irá ocorrer a aglutinação (Figura 10). Esse teste apresenta diversas aplicabilidades.
LÁTEX
Partículas de látex são esferas de poliestireno que desempenham um papel de suporte, e
é possível adsorver antígenos.
ADSORÇÃO PASSIVA
Adesão de moléculas fluidas a uma superfície sólida.
javascript:void(0)
javascript:void(0)
 
Fonte: Wikimedia
 Figura 10: Teste de aglutinação indireta. O teste de Coombs indireto é um exemplo desse
teste quando é utilizado hemácias como suporte.
O teste de Coombs indireto é um exemplo desse teste quando se utiliza hemácias como
suporte.
 VOCÊ SABIA
A reação de aglutinação indireta com o látex como partícula inerte é amplamente utilizada para
a detecção do fator reumatoide. A artrite reumatoide é uma doença autoimune que leva à
inflamação crônica nas articulações, à ativação desregulada de células B e T e à produção de
autoanticorpos, moléculas que reconhecem a região Fc das imunoglobulinas produzidas no
nosso organismo, chamado de fator reumatoide que normalmente é uma variante de IgM. Na
pesquisa do fator reumatoide, o látex é sensibilizado com anticorpo do tipo IgM, IgG, IgM e IgA,
e essa partícula é reagida com o soro do paciente. Se o soro apresentar o fator reumatoide,
teremos a aglutinação.
REAÇÕES DE INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Nessas reações, ocorre uma competição entre os antígenos presentes na superfície de
hemácias ou de partículas inertes e antígenos solúveis pelo sítio de ligação com o
anticorpo, diminuindo assim a capacidade de interação e aglutinação. Dessa forma, a reação
é positiva quando não temos aglutinação. A competição acontece entre dois antígenos
semelhantes, pelo local de ligação com o anticorpo, ou entre dois anticorpos diferentes pela
ligação ao mesmo antígeno. A interação acontecerá entre o antígeno e o anticorpo que
apresente uma reação mais estável.
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DIRETA DE HEMÁCIAS
POR ANTÍGENOS VIRAIS
Durante uma infecção viral, alguns vírus apresentam a capacidade de se ligar a receptores
localizados na superfície de hemácias danificadas. Assim, essa propriedade é utilizada para a
dosagem de anticorpos contra os vírus durante a evolução de uma doença.
Um paciente com uma suspeita de infecção viral faz um exame de sangue para confirmar a
presença de anticorpos contra esse vírus. O soro desse paciente é então diluído e colocado em
contato com quantidades fixas de antígenos virais e hemácias. Teremos uma competição da
ligação dos anticorpos aos antígenos livres e os que estão ligados a hemácias. À medida
que ocorre a ligação antígeno livre e anticorpo, a aglutinação diminui. Em seguida,
verificamos qual foi a diluição que não houve mais a aglutinação das hemácias, ou seja, a
inibição da propriedade aglutinante, e esse representa o título do anticorpo .
REAÇÃO DE INIBIÇÃO PASSIVA DE PARTÍCULAS
INERTES (LÁTEX)
Ocorre pela inibição da ligação entre antígenos ancorados na sua superfície do látex e seus
anticorpos correspondentes, quando existem anticorpos solúveis que competem inibindo a
aglutinação.
 
Fonte: Shutterstock
Uma paciente está com suspeita de gravidez e realiza a coleta da urina para o teste.
Normalmente, o teste de gravidez detecta o hormônio da gonodotrofina coriônica (hHCG) em
uma reação de inibição de aglutinação.
Vamos entender melhor:
 
Fonte: O autor
REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Podemos identificar e quantificar a presença de antígenos e anticorpos em uma amostra
através da formação de imunocomplexose a avaliação da capacidade desses complexos em
fixar e consumir as moléculas do sistema complemento in vitro.
Essa técnica é barata, simples e utilizada para o diagnóstico de alguns agentes infecciosos
como a histoplasmose e a coccidioidomicose. No entanto, esses testes estão sendo
substituídos pelos ensaios enzimáticos, que são mais sensíveis, e são empregados apenas
como testes confirmatórios.
O teste é realizado em duas etapas.
ETAPA 1
Na primeira etapa, ocorre a formação dos imunocomplexos (interação antígeno e anticorpo) e a
ligação (fixação) com as moléculas do sistema complemento.
ETAPA 2
Na segunda etapa, as hemácias ligadas aos anticorpos antieritrócitos (hemolisinas) são
adicionadas e, após um período, observamos se ocorreu ou não a hemólise.
A presença de hemólise indica que, na primeira etapa, não houve a formação do
imunocomplexo e a fixação do complemento, ficando as moléculas do sistema complemento
livres e capazes de interagir com o complexo hemácias-hemolisinas. De forma diferente, a
ausência de hemólise informa que houve a formação do imunocomplexo e a fixação das
moléculas do sistema complemento, ou seja, uma reação positiva. É importante ressaltar que,
nessa reação, os antígenos e anticorpos isolados não podem ativar o sistema complemento,
pois geraria resultados falhos.
javascript:void(0)
javascript:void(0)
 
Fonte: O autor.
 Esquema mostrando a reação de fixação do complemento.
O sistema hemácia-hemolisina funciona como um sistema revelador.
IMUNOFIXAÇÃO, NEFELOMETRIA E
FLOCULAÇÃO
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. APRENDEMOS QUE OS TESTES IMUNOLÓGICOS SÃO BASEADOS NO
RECONHECIMENTO ANTÍGENO-ANTICORPO E PODEM SER FEITOS A
PARTIR DE REAGENTES MARCADOS OU NÃO MARCADOS, GERANDO
UMA INTERAÇÃO QUE É VISÍVEL A OLHO NU, COMO A AGLUTINAÇÃO.
SOBRE A AGLUTINAÇÃO, ANALISE AS ASSERTIVAS A SEGUIR: 
 
I. SÃO REAÇÕES QUE OCORREM ENTRE ANTÍGENOS NATURAIS
INSOLÚVEIS OU ADSORVIDOS À SUPERFÍCIE DE PARTÍCULAS INERTES
COM OS ANTICORPOS CORRESPONDENTES. 
II. A ALTA SENSIBILIDADE E BAIXA ESPECIFICIDADE SÃO VANTAGENS
DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO. 
III. PODE SER UTILIZADA PARA TIPAGEM SANGUÍNEA, PROVAS DE
COMPATIBILIDADE TRANSFUSIONAL, DETECÇÃO DE HORMÔNIOS,
DETECTAR PATÓGENOS (VÍRUS, BACTÉRIAS, PROTOZOÁRIOS E
FUNGOS) E NO DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS AUTOIMUNES. 
 
ESTÃO CORRETAS AS ASSERTIVAS:
A) I e II
B) II e III
C) I e III
D) III
2. ESTUDAMOS QUE A DETECÇÃO DE UM ANTÍGENO OU ANTICORPO
PODE SER REALIZADA A PARTIR DA CAPACIDADE DOS
IMUNOCOMPLEXOS DE FIXAR E CONSUMIR O SISTEMA
COMPLEMENTO, NO TESTE CHAMADO DE REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO
COMPLEMENTO. SOBRE ESSE MÉTODO, ASSINALE A ALTERNATIVA
INCORRETA.
A) O teste de fixação do complemento é um teste utilizado para o diagnóstico de alguns
agentes infecciosos como a histoplasmose e coccidioidomicose.
B) O teste de fixação de complemento é feito em duas etapas, na primeira etapa, ocorre a
fixação do complemento e, na segunda, a revelação da reação que é verificada pela ausência
ou presença de lise nas hemácias.
C) A interação do antígeno e anticorpo possibilita a fixação do sistema complemento e, nesse
caso, ele é consumindo não ficando disponível para uma segunda reação.
D) Se o complemento foi fixado na primeira etapa da reação, na segunda etapa após a
revelação, veremos a hemólise, ou seja, um resultado positivo.
GABARITO
1. Aprendemos que os testes imunológicos são baseados no reconhecimento antígeno-
anticorpo e podem ser feitos a partir de reagentes marcados ou não marcados, gerando
uma interação que é visível a olho nu, como a aglutinação. Sobre a aglutinação, analise
as assertivas a seguir: 
 
I. São reações que ocorrem entre antígenos naturais insolúveis ou adsorvidos à
superfície de partículas inertes com os anticorpos correspondentes. 
II. A alta sensibilidade e baixa especificidade são vantagens das reações de aglutinação. 
III. Pode ser utilizada para tipagem sanguínea, provas de compatibilidade transfusional,
detecção de hormônios, detectar patógenos (vírus, bactérias, protozoários e fungos) e
no diagnóstico das doenças autoimunes. 
 
Estão corretas as assertivas:
A alternativa "C " está correta.
 
A aglutinação é uma técnica que apresenta alta especificidade e baixa sensibilidade, pois, se
os anticorpos e antígenos não estiverem nas concentrações equivalentes, pode ocorrer
resultados falso negativos (o paciente tem a doença, mas o teste não detecta).
2. Estudamos que a detecção de um antígeno ou anticorpo pode ser realizada a partir da
capacidade dos imunocomplexos de fixar e consumir o sistema complemento, no teste
chamado de reação de fixação do complemento. Sobre esse método, assinale a
alternativa INCORRETA.
A alternativa "D " está correta.
 
Na reação de fixação do complemento, quando temos a ligação do antígeno-anticorpo, o
complexo formado é capaz de se ligar, fixar e consumir o sistema complemento, não ficando
assim disponível para hemolisar as hemácias ligadas à hemolisina (anticorpo antieritrocitário)
quando for adicionado o sistema revelador. Nesse caso, uma reação é positiva quando não
vemos hemólise.
MÓDULO 2
 Explicar os métodos laboratoriais imunológicos com reagentes marcados
MÉTODOS LABORATORIAIS
IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES
MARCADOS
Estudamos que as técnicas de precipitação, aglutinação e de fixação do complemento são os
principais ensaios imunológicos que utilizam reagentes não marcados. Agora, vamos conhecer
alguns métodos onde a verificação da presença de um antígeno e o anticorpo é realizado com
algum dos elementos (antígeno ou anticorpo) marcados com um corante fluorescente ou
quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas, entre outros marcadores.
Vamos juntos estudar um pouco sobre o ELISA, testes de fluorescência, testes
imunocromatográficos, radioimunoensaios e algumas técnicas de imuno-histoquímica. Além
disso, vamos entender a importância dos testes de hipersensibilidade celular cutânea tardia na
avaliação geral da imunidade celular.
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Em 1941, uma equipe de pesquisadores liderados por Albert H. Coons, desejando analisar as
técnicas imunológicas com auxílio de corantes, utilizou radicais fluorescentes, pois a coloração
com os reagentes comuns conferia uma fraca intensidade. Nessa época, já era conhecida a
capacidade dos anticorpos de ligar-se aos radicais químicos sem alterar sua conformação e
capacidade de interagir com os antígenos. Foi desenvolvido assim o teste de
imunofluorescência.
O desenvolvimento desse teste só foi possível pela capacidade de algumas substâncias em
armazenar energia luminosa e liberá-la depois, fenômeno esse conhecido como
luminescência.
FOSFORESCÊNCIA
Quando a substância consegue armazenar energia luminosa por longos períodos até a sua
emissão.
FLUORESCÊNCIA
Quando a substância armazena energia luminosa por curto período até sua emissão.
javascript:void(0)
javascript:void(0)
Os corantes fluorescentes mais utilizados são a rodamina e a fluoresceína. 
Após a coloração, essas amostras podem ser analisadas:
 
Fonte: Wikipedia
NO MICROSCÓPIO ÓPTICO DE FLUORESCÊNCIA

 
Fonte: Wikipedia
NO CITÔMETRO DE FLUXO
A imunofluorescência representa um grande avanço na imunologia clínica, pois permitiu a
detecção de substâncias de forma direta, mesmo que em pequenas concentrações, e
utilizando pequenas quantidades de corantes fluorescentes, uma vez que esses corantes
emitem grande quantidade de energia. Antes, a detecção de um antígeno ou anticorpo era
realizado através de Reações secundárias (aglutinação ou precipitação) , ou seja, após a
formação de um imunocomplexo, sendo necessária grandes quantidades de antígenos e
anticorpos para sua visualização.
A partir dessa técnica, diferentes métodos foram descritos, como a imunoflorescência direta e
indireta.
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Esta técnica é utilizada para detectar antígenos em biopsias de tecidos, como também a
presença de células, bactérias, vírus, fungos e protozoários. Ela consiste no reconhecimento
de antígenos poranticorpo correspondente que está conjugado com uma substância
fluorescente. A presença de fluorescência indica que a amostra tem a substância pesquisada.
A análise por esse método costuma ser qualitativa (Figura 11).
 
Fonte: Vshivkova/Shutterstock
 Figura 11: Células leucêmicas marcadas com corante fluorescente, em que o núcleo está
corado em verde e o citoplasma em vermelho.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Nesta técnica, utiliza-se um anticorpo secundário conjugado com o radical fluorescente, ou
seja, um anticorpo anti-imunoglobulina que é capaz de reconhecer diferentes imunoglobulinas
ligadas a um antígeno específico. A principal vantagem desse método é a diminuição dos
custos, uma vez que o anticorpo secundário pode ser empregado para o reconhecimento de
qualquer anticorpo humano e utilizado para diferentes análises. Além disso, é um método mais
sensível e específico quando comparado à imunofluorescência direta. É utilizado para o
diagnóstico e o acompanhamento de diferentes doenças (Figura 12).
 
Fonte: Wikimedia
 Figura 12: Teste de imunofluorescência. Em (A) e (B) fotos de células marcadas pela
imunofluorescência. (C) esquema mostrando a diferença entre a imunofluorescência direta e
indireta.
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA-
ENZYME LINKED IMMUNOSORBET ASSAY)
Em 1971, foi introduzido pelos pesquisadores Van Weermen e Schurs e Engvall e Perlmann o
método imunoenzimático para detecção e quantificação de antígenos e anticorpos específicos.
Esses pesquisadores verificaram que a interação antígeno e anticorpo poderia ser detectada e
quantificada utilizando como substância reveladora um conjunto enzima-substrato, que, na
presença de uma espécie doadora de elétrons (cromógeno), forma produtos coloridos. Além
disso, observaram que as proteínas poderiam ser imobilizadas em superfícies sólidas como a
de poliestireno. Essa foi a base para o desenvolvimento dessa técnica.
O método de ELISA é capaz de detectar antígenos ou anticorpos. Ele é realizado em placas
plásticas de 96 poços (placas de microdiluições) formadas de poliestireno e que seguem uma
sequência de procedimentos.
 
Fonte: Wikipedia
 Uma microplaca de 96 poços usada para ELISA.
ETAPA 1
Inicialmente, a placa é previamente sensibilizada com a substância (antígeno e anticorpo)
específica que é complementar à molécula que desejamos identificar.
SENSIBILIZADA
Processo de revestimento da placa com o reagente adequado. Normalmente, utiliza-se
um pH alcalino, mantendo os reagentes com carga negativa e garantindo que ocorra a
adsorção na placa, pois essa apresenta carga positiva, devido ao poliestireno.
ETAPA 2
Após a sensibilização, nem todos os espaços da placa são cobertos, restando alguns espaços
vazios que podem ser ocupados por qualquer outra molécula gerando ligações inespecíficas e
resultados falso positivos. Assim, é feito um bloqueio com soro albumina bovina (BSA), a
ovalbumina, a caseína ou um complexo proteico, como o soro de cobaia dos espaços vazios
da placa.
javascript:void(0)
ETAPA 3
Durante a execução do método, são realizadas várias lavagens (manual, por meio automático
ou por um sistema a vácuo) importantes para a retirada dos excessos de reagentes que não
estão ligados a nenhuma molécula, impedindo assim qualquer tipo de ligação cruzada e
interferências.
ETAPA 4
Dependendo do que queremos analisar, podemos utilizar antígenos conjugados com
enzimas (Ac-E) e anticorpos ou anti-anticorpos conjugados com enzimas (Ag-E) . As
enzimas mais empregadas são a fosfatase alcalina e peroxidase. Para revelar e verificar se
ocorreu interação antígeno-anticorpo conjugado com a enzima ou anticorpo-antígenos
conjugados com a enzima, é oferecido o substrato dessa enzima e um componente doador de
elétrons (cromógeno).
Quando a enzima está presente no meio reacional, ou seja, quando houve interação e
reconhecimento antígeno-anticorpo conjugado, a enzima quebra o substrato e o produto
formado atua no cromógeno, gerando uma cor. Agora, quando a alteração de cor não é
verificada, indica que a interação não ocorreu, não tendo assim no meio reacional a enzima
para agir no substrato
ETAPA 5
A leitura pode ser qualitativa, apenas verificando a alteração de cor, ou então pode ser
realizada a leitura em espectrofotômetro, o que converte as diferentes intensidades de cor em
valores numéricos (valores de densidade óptica). Quanto maior a cor obtida, maior é a
concentração da enzima conjugada e assim, maior a concentração da substância na amostra
investigada.
O método de ELISA, quando realizado em condições excelentes (enzimas ativas, antígenos
puros e anticorpo conjugado), é capaz de apresentar uma sensibilidade muito similar à do
radioimunoensaio, porém com vantagem de não se utilizar elementos radioativos. Ele
consegue detectar quantidades muito pequenas de antígenos ou anticorpos. No entanto,
alguns reagentes utilizados são teratogênicos e podem ter interferentes de enzimas endógenas
quando utilizadas como antígenos células inteiras e íntegras.
 
Fonte: Jarun Ontakrai/Shutterstock
 ELISA com reação colorimétrica.
O método de ELISA pode ser classificado em direto, indireto ou competitivo, são eles:
ELISA direto
Método utilizado para pesquisar a presença de antígenos. É amplamente empregado em
testes imuno-histoquímicos, que buscam em amostra de tecidos obtidas por biopsias detectar
proteínas, enzimas, receptores, alterações celulares etc. Para isso, o tecido ou amostra (com
os antígenos pesquisados) é fixado a uma superfície e, em seguida, é adicionado um anticorpo
conjugado com uma enzima (anticorpos primários) correspondente ao antígeno que
investigamos. Quando temos a presença do antígeno, há o reconhecimento com o anticorpo-
conjugado e, ao adicionar o substrato da enzima, teremos uma coloração (Figura 13).
 
Fonte: Adaptado de Soleil Nordic e Fluke Cha /Shutterstock
 Método de ELISA direto. (A) Esquema mostrando a técnica. (B) Esquema mostrando a
interação antígeno-anticorpo marcado, uma reação positiva e uma reação negativa.
ELISA INDIRETO
Método utilizado para pesquisar a concentração de anticorpos presentes em uma amostra de
soro ou plasma. Para isso, os antígenos são imobilizados na fase sólida (Placa de ELISA) . A
interação antígeno-anticorpo será evidenciada pela utilização de um segundo
anticorpo (Anticorpo secundário) que está conjugado com a enzima e reconhece o anticorpo
ligado ao antígeno (Figura 14). A reação será visualizada após a adição do substrato da
enzima. É empregado no diagnóstico de doenças infectocontagiosas como AIDS e doença de
chagas.
Essa técnica pode ser adaptada para a pesquisa de antígenos em uma amostra biológica e é
chamada de ELISA Sanduíche. Para isso:
A placa é sensibilizada com o anticorpo (anticorpos de captura).

Depois, o anticorpo de captura reconhece o antígeno presente na amostra biológica.

Em seguida, a reação é revelada com um anticorpo-conjugado que reconhece o antígeno
ligado ao anticorpo de captura (Figura 14).
 SAIBA MAIS
É empregado no teste de gravidez para detecção do hormônio gonodotrofina coriônica no soro.
 
Fonte: Adaptado de Soleil Nordic/Shutterstock
 Figura 14: Método de ELISA Indireto e ELISA Sanduíche.
ELISA COMPETITIVO
Nessa técnica, pesquisamos antígenos nas amostras através da competição com antígenos
conjugados com a enzima. Para isso:
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
ETAPA 1
A placa é sensibilizada com o anticorpo de captura.
ETAPA 2
São adicionados ao mesmo tempo a amostra em investigação e quantidades fixas de
antígenos conjugados em que ambos competirão pela ligação ao anticorpo, que se liga àquela
molécula que estiver em maior concentração.
ETAPA 3
Após a adição do substrato da enzima, a interação anticorpo de captura e antígeno marcado
gera uma cor, quanto maior a intensidade de coloração, mais antígenos conjugados estão
ligados e menor é a concentração de antígenos na amostra. Agora, quanto menor a
intensidade de cor, maior é a concentração de antígenosna amostra em investigação e
menor a ligação dos antígenos conjugados ao anticorpo de captura.
O ELISA Competitivo pode ser:
DIRETO
Pesquisa antígenos
INDIRETO
Pesquisa anticorpos
javascript:void(0)
javascript:void(0)
Ocorre através de uma competição simultânea, quando a substância marcada e a investigada
são adicionadas ao mesmo tempo, ou uma saturação sequencial, quando a substância em
investigação é adicionada primeiro e depois é adicionado o antígeno ou o anticorpo conjugado
(Figura 15).
 
Fonte: Adaptado de Research Gate
 Figura 15: Método de ELISA Competitivo.
RADIOIMUNOENSAIO
Em 1956, foi desenvolvida a técnica radioimunoensaio (RIE) para a detecção da insulina.
Essa representa a primeira metodologia padronizada que utiliza reagentes marcados para a
detecção de moléculas na ordem de nano e picogramas. O RIE é semelhante ao ELISA
competitivo, no entanto, utiliza substâncias marcadas com o radioisótopo. O radioisótopo mais
empregado é o iodo-125.
 SAIBA MAIS
O termo Radioimunoensaio (RIE) é usado apenas quando a substância marcada é o antígeno,
e ensaio imunorradiométrico (IRMA) quando o anticorpo que está marcado.
A detecção de antígenos ou anticorpos ocorre pela competição pelo sítio de ligação entre a
substância marcada com radioisótopo e a substância que se deseja analisar. Os antígenos ou
anticorpos são adicionados à fase sólida e acrescentados às moléculas marcadas com
radioisótopo junto com a amostra do paciente. A quantificação é realizada em aparelho
específico para a detecção da radioatividade.
Quanto maior for a leitura da radioatividade, maior a formação de imunocomplexos com a
substância marcada e menor é a concentração do antígeno ou anticorpo investigado
(Figura 16).
VANTAGENS DESSE TESTE
Alta especificidade e sensibilidade.
É rápido, barato.
Requer pouco volume de amostra para testagem.
Permite dosagem de substâncias em pequenas concentrações.

DESVANTAGEM DESSE TESTE
Apresenta um alto risco ao operador.
É necessário um grande investimento em biossegurança e descarte de material
radioativo.
Grande instabilidade dos radioisótopos.
E amplamente empregado para dosar polipeptídeos, catecolaminas, esteroides, hormônios,
drogas, vitaminas, verificar a presença de vírus como o da hepatite B e a presença de alguns
marcadores tumorais.
 
Fonte: O autor
 Figura 16: Esquema ilustrando um ensaio imunorradiométrico (IRMA).
TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS
Os testes imunocromatográficos realizam a detecção da interação antígeno-anticorpo pela
difusão cromatográfica, onde o complexo formado gera uma cor, e a partir deles, podemos
detectar antígenos ou anticorpos. Os testes rápidos são um exemplo clássico de
imunocromatografia e são muito utilizados para a detecção de várias doenças, como: HIV,
Hepatite, COVID. Essa metodologia é de fácil execução, baixo custo, que conferem resultados
rápidos, versáteis, dispensa equipamentos e que podem ser realizados em diferentes
amostras, como o soro, plasma, sangue total, saliva, swab de nasofaringe e orofaringe, urina e
fezes. Entretanto, apresentam baixa sensibilidade.
 
Fonte:Shutterstock
 Teste Imunocromatográfico para HIV.
Você já realizou um teste rápido? 
Sabe por que aparecem duas bandas, uma chamada de “T” e a outra de “C”, vamos entender?
O teste rápido é realizado em um cassete constituído por uma membrana porosa de celulose
modificada e membranas absorventes de fibra de vidro. Envolvendo a membrana, temos um
dispositivo plástico que contém os locais de aplicação das amostras e verificação dos
resultados. Ele é constituído por uma fase sólida (Membrana porosa) , onde ocorre a interação
antígeno-anticorpo e é o local onde estão presentes os elementos de captura (Antígeno ou
anticorpos específicos) fixados na membrana e uma fase móvel com o deslocamento das
substâncias por capilaridade.
Inicialmente, para a detecção de antígenos, a amostra é colocada em uma região pré-
determinada da membrana. Nessa área, estão presentes anticorpos conjugados normalmente
com ouro coloidal (coloração rosa) ou prata coloidal (azul marinho), que serão responsáveis
pela revelação da interação antígeno-anticorpo.

Após aplicação, a amostra migra em direção as regiões testes (T) e controle (C).

Caso haja reconhecimento entre o antígeno-anticorpo conjugado, esse complexo será retido
pela ligação com os anticorpos presentes na região T, que reconhecem os epítopos do
antígeno em investigação e gera uma linha colorida. Caso não haja interação, essa linha
colorida não aparecerá.
É importante ressaltar que, após a região teste, temos uma região controle, com anticorpos
anti-IgG que são capazes de se ligar a todos os anticorpos livres presentes na amostra. O
aparecimento da linha controle é essencial, pois indica que houve migração da amostra e deve
estar presente nos resultados positivos e negativos. O não aparecimento da linha controle
invalidada o teste (Figura 17).
 
Fonte: Adaptado de Biomedicina Padrão
 Figura 17: Esquema ilustrando um teste rápido para detecção do antígeno NS1, que indica
infecção pelo vírus da dengue.
IMUNO-HISTOQUÍMICA
O teste de imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica que combina a imunologia, histologia e
química e tem como finalidade o reconhecimento de proteínas de alta afinidade durante os
exames histopatológicos. Esse teste é empregado em cortes de tecidos obtidos após a biópsia
para a detecção de doenças degenerativas ou parasitárias, identificação de substâncias e
análises de estruturas dos tecidos normais e alteradas durante a evolução da doença.
Atualmente, existe uma série de anticorpos capazes de reconhecer com alta especificidade
proteínas do tecido e que garantem um diagnóstico mais fidedigno.
Existem dois tipos de técnicas que podem ser aplicadas para a imuno-histoquímica:
TÉCNICA DIRETA
Técnica que reconhece os antígenos presentes em um corte de tecido a partir de anticorpos
ligados a um marcador (anticorpos primários). Os cortes de tecidos são colocados em contato
com os anticorpos primários e, após um tempo de incubação, é realizada a leitura em
microscópios adequados. Os antígenos pesquisados no tecido serão observados pelo
aparecimento de uma cor, indicando que houve reconhecimento pelo anticorpo. Os anticorpos
não ligados são removidos por lavagens realizadas durante a técnica.
TÉCNICA INDIRETA
Técnica que reconhece proteínas pela ligação com um anticorpo (primário não marcado)
específico ao antígeno em investigação e depois essa interação é revelada pela utilização de
um anticorpo anti-IgG marcado (anticorpo secundário) e a amostra é observada em um
microscópio adequado.
Normalmente, em sistemas reveladores na IHQ, são utilizadas reações enzimáticas, com
destaque para o sistema avidina-biotina-enzima-cromógeno. Vamos entender como isso
acontece?
Nessas reações, o anticorpo secundário é complexado à biotina, e é adicionado ao meio
reacional à estreptavidina ligada a uma peroxidase. A estreptavidina tem afinidade à biotina e
liga-se a ela e, consequentemente, ao anticorpo secundário. Em seguida, é adicionado ao meio
reacional a 3,3-diaminobenzina (DAB) , que reage com a peroxidase, reduzindo o DAB que se
precipita no local de reação e gera uma cor marrom- ferruginosa. A coloração marrom indica
que houve interação antígeno-anticorpo (Figura 18).
 
Fonte: Vetpathologist/Shutterstock
 Figura 18: Corte histológico mostrando as enzimas pepsinogênicas (coloração marrom) no
estômago. Imuno-histoquímica por complexo avidina-biotina-enzima-cromógeno.
TESTE DE HIPERSENSIBILIDADE CELULAR
CUTÂNEA TARDIA
Todas as técnicas que verificamos até aqui estudam a imunidade humoral, com a interação
antígeno e anticorpo. Mas e a imunidade celular? Quais são as técnicas que avaliam in vitro ou
in vivo esse tipo de imunidade?
A análise da imunidade celular in vitro é feita pela linfoproliferação e citometria de fluxo e in
vivo a partir do teste de hipersensibilidade celular cutânea tardia. O teste de hipersensibilidadetardia é um método simples e pode ser empregado para confirmar exposição prévia a alguns
agentes infecciosos, como Mycobacterium tuberculosis, Hanseníase, Leishmania, Candida
albicans, Paracoccidioides brasiliensis, dentre outros. Para isso:
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
ETAPA 1
São aplicados no antebraço do paciente 0,1 mL de antígeno específico com agulhas e seringas
estéreis, por via intradérmica.
A via subcutânea não é recomendada, pois diluiu os antígenos inoculados, levando a
resultados falso negativos.
ETAPA 2
No outro antebraço, é aplicado a mesma quantidade de Soro fisiológico 0,9% estéril (salina)
como controle.
ETAPA 3
Após 48-72 horas, é realizada a leitura, onde é medido o diâmetro do endurecimento (Parte
dura) . Normalmente, caroços superiores a 5 mm são indicativos de uma reação imune
celular (Tipo th1) no local e da exposição ao antígeno pesquisado, mas o tamanho depende
do tipo de antígeno (Figura 19).
 
Fonte: Adaptado de Shutterstock
 Figura 19: Ilustração mostrando o teste de PPD.
Um teste positivo não indica que o paciente esteja doente ou que obrigatoriamente tenha tido
uma infecção. O aparecimento do eritema e do endurecimento indica a presença de células de
memória do tipo Th1, por uma doença que já foi curada ou uma infecção assintomática, onde o
participante não apresentou sintomas. O teste negativo indica a ausência de contato com
aquele agente infeccioso.
Alguns exemplos do emprego do teste hipersensibilidade celular cutânea tardia, ou teste de
PPD (derivado proteico purificado):
Pesquisa a exposição ao Mycobacterium tuberculosis, com o antígeno tuberculina,
conhecido como teste de Mantoux.
Pesquisa a exposição à hanseníase com o antígeno lepromina, ou antígeno de Mitsuda.
Pesquisa a exposição a Candida albicans com os antígenos candidina ou oidiomicina.
Pesquisa a exposição a Paracoccidioides brasiliensis com o antígeno paracoccidioidina.
Pesquisa de Leishmaniose tegumentar com o extrato de protozoário como antígeno, o
famoso teste de Montenegro.
Além disso, essa metodologia é indicada para avaliar a diminuição da imunidade celular do tipo
th1 (anergia) em indivíduos que não respondem mais a microrganismos não patogênicos,
situação que é observada em pacientes imunossuprimidos pelo uso de drogas e doenças,
como neoplasias, AIDS, doenças autoimunes. Alguns produtos químicos quando aplicados ao
antebraço provocam uma sensibilização e uma reação imune no local. Essa propriedade tem
sido utilizada para analisar casos de anergia e a droga mais empregada é o DNCB. Esse é um
teste que não é de rotina e deve ser feito apenas com pacientes com suspeita de ausência de
resposta imune celular.
 
Fonte: Pixel-Shot/Shutterstock
CITOMETRIA DE FLUXO E
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. VIMOS QUE A TÉCNICA DE ELISA É AMPLAMENTE UTILIZADA NO
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE DIFERENTES DOENÇAS
INFECCIOSAS, COMO HIV, DOENÇA DE CHAGAS, COMO TAMBÉM É
CAPAZ DE DETECTAR HORMÔNIOS COMO A GONADOTROFINA
CORIÔNICA HUMANA. ESSA TÉCNICA APRESENTA ALGUMAS
VARIAÇÕES E, DE ACORDO COM A METODOLOGIA, PODE SER
CLASSIFICADA EM ELISA DIRETO, COMPETITIVO E INDIRETO. SOBRE
ESSE ASSUNTO, MARQUE A ALTERNATIVA CORRETA.
A) O teste de ELISA indireto é utilizado para verificar apenas a presença de antígenos em
cortes de tecidos.
B) O teste de ELISA direto é utilizado para verificar a presença de antígenos em cortes de
tecido.
C) No teste de ELISA competitivo, a intensidade de cor e a concentração de antígenos na
amostra em investigação é diretamente proporcional.
D) O teste de ELISA competitivo é utilizado para verificar apenas a presença de antígenos em
cortes de tecidos.
2. APRENDEMOS QUE OS TESTES RÁPIDOS SÃO MUITO UTILIZADOS
QUANDO PRECISAMOS DE UM DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO IMEDIATO,
PARA A DETECÇÃO DE DOENÇAS INFECTOCONTAGIOSAS COMO
COVID, DENGUE, HIV E SÍFILIS E É UMA TÉCNICA DE FÁCIL EXECUÇÃO,
VERSÁTIL E QUE DISPENSA EQUIPAMENTOS. OS TESTES RÁPIDOS
DETECTAM A INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPOS POR QUAL
REAÇÃO?
A) Imunoenzimática
B) Imunocromatografia
C) Imuno-histoquímica
D) Teste de sensibilidade cutânea
GABARITO
1. Vimos que a técnica de ELISA é amplamente utilizada no diagnóstico imunológico de
diferentes doenças infecciosas, como HIV, doença de chagas, como também é capaz de
detectar hormônios como a gonadotrofina coriônica humana. Essa técnica apresenta
algumas variações e, de acordo com a metodologia, pode ser classificada em ELISA
direto, competitivo e indireto. Sobre esse assunto, marque a alternativa correta.
A alternativa "B " está correta.
 
O teste de ELISA direto é um teste para verificar a presença de antígenos em cortes de
tecidos. O ELISA indireto e competitivo pode analisar tanto antígenos como anticorpos. No
teste de ELISA competitivo, a intensidade de cor e a concentração da amostra é inversamente
proporcional, quanto maior a intensidade de cor, maior é a concentração de antígenos na
amostra em investigação, pois menor é a ligação dos antígenos conjugados ao anticorpo de
captura.
2. Aprendemos que os testes rápidos são muito utilizados quando precisamos de um
diagnóstico imunológico imediato, para a detecção de doenças infectocontagiosas como
COVID, dengue, HIV e sífilis e é uma técnica de fácil execução, versátil e que dispensa
equipamentos. Os testes rápidos detectam a interação antígeno-anticorpos por qual
reação?
A alternativa "B " está correta.
 
Os testes imunocromatográficos realizam a detecção da interação antígeno-anticorpo pela
difusão cromatográfica, onde o complexo formado gera uma cor, e a partir dele podemos
detectar antígenos ou anticorpos. Um exemplo clássico de teste imuncromatográfico são os
testes rápidos comerciais para detecção de várias doenças, como: HIV, Hepatite, COVID.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, conhecemos os diferentes testes imunológicos empregados para a
confirmação diagnóstica, o diagnóstico precoce, acompanhar a evolução e o tratamento de
uma doença, além de confirmar a presença de uma substância no organismo. Vimos que a
maioria dos testes utilizados consistem na interação antígeno-anticorpo. Essa interação pode
ser visível a olho nu (teste de precipitação, aglutinação ou fixação de complemento) ou então
um dos componentes da interação deve estar marcado com corante fluorescente ou
quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas, entre outros marcadores, para que essa
interação seja visível (ELISA, radioimunoensaio, teste de fluorescências).
Ao final, foi verificado que o teste de hipersensibilidade cutânea tardia é uma forma de
verificação in vivo da imunidade celular, sendo essencial para confirmar a exposição prévia a
alguns agentes infecciosos e estudar casos de diminuição da imunidade celular do tipo th1
(anergia).
Juntos podemos entender a metodologia de cada teste, aplicabilidade, sua vantagem e
desvantagem, ampliando ainda mais o conhecimento sobre imunologia clínica.
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. Imunologia Celular e Molecular. 5. ed. Rio de Janeiro:
Elsevier, 2005.
MACHADO, S. L; MACHADO, R. D. Imunologia básica e aplicada às análises clínicas.
Consultado em meio eletrônico em: 18 ago. 2020.
MOLINARO, E. M.; CAPUTO, L. F. G; AMENDOEIRA, M. R. R. Conceitos e métodos para a
formação de profissionais em laboratórios de saúde. 3. ed. Rio de Janeiro: EPSJV: IOC,
2013.
WASTOWSKI, I.; DONADI, E. Imunologia básico para o clínico. Consultado em meio
eletrônico em: 18 ago. 2020.
EXPLORE+
Aprendemos que o efeito prozona acontece quando a concentração de anticorpos está maior
do que de antígenos e que isso pode levar a resultados falso negativos, pois a visualização
desses precipitados fica prejudica. Esse efeito é muito comum nos testes para detecção de
sífilis pelo teste de VDRL. Para conhecer mais sobre isso, busque o artigo Efeito prozona no
diagnóstico de sífilis pelo método VDRL: experiência de um serviço de referência no sul do
Brasil.
Conhecemos um pouco sobre o diagnósticopor ELISA e de que forma pode ser realizado.
Para saber mais, não deixe de pesquisar artigo Teste de ELISA indireto para o diagnóstico
sorológico de pitiose.
Para conhecer um pouco mais da aplicabilidade do teste rápido para HIV e como são utilizados
na clínica, leia o artigo Teste Rápido para Detecção da Infecção pelo HIV-1 em Gestantes.
Para compreender um pouco mais sobre o teste de sensibilidade cutânea Montenegro, leia o
artigo Avaliação do poder sensibilizante da reação de Montenegro.
Apreendemos que a citometria de fluxo é uma forma de avaliação da imunidade celular in vitro,
para conhecer mais sobre essa técnica leia Citometria de Fluxo no estudo das doenças infecto-
parasitárias.
CONTEUDISTA
Gabrielly Sbano Teixeira
 CURRÍCULO LATTES
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