Apostila - GENÉTICA FORENSE - Felipe G. Murga e Sérgio Paulo L. Fernandes - UnB

Prévia do material em texto

GENÉTICA FORENSE 
 
 
 
 
 
 Autores: Felipe Gonçalves Murga 
 Sérgio Paulo Lopes Fernandes 
 
 
 
 
Professora: Zulmira Lacava 
 
 
 
 
 
 
Brasília 
2008 
 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
Figura 1 – Esquema da amplificação de DNA pela reação em cadeia da polimerase 9 
Figura 2 – Seqüenciamento de DNA pelo método de Sanger 14 
Figura 3 – Eletroferograma de uma análise de DNA mitocondrial 15 
Figura 4 – Perfis de STR de dois diferentes indivíduos 19 
Figura 5 – Tabela de loci utilizados em determinados métodos multiplexados 20 
Figura 6 – Análise de STR de um indivíduo homem 21 
Figura 7 – Análise de STR de um indivíduo mulher 22 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
ABI – Applied Biosystems, Inc. 
 
CODIS – Sistema Conjunto de Indexação de DNA [Combined DNA Index System] 
 
DNA – Ácido desoxirribonucléico 
 
DNAmt – DNA mitochondrial 
 
EDNAP – European DNA Profiling Group 
 
ENFSI – European Network of Forensic Science Institutes 
 
IPCR – Inverse-PCR 
 
LCN – Low Copy Number 
 
mRNA – Ácido ribonucléico mensageiro 
 
PIA – Paternally imprinted allele 
 
PCR – Reação em cadeia da polimerase 
 
RACE – Rapid Amplification of cDNA Ends 
 
RFLP – Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição [restriction fragment 
length polymorphisms] 
 
RT – Transcriptase reversa 
 
rTth – enzima que realiza simultaneamente a transcrição reversa e a reação em cadeia da 
polimerase 
 
SGM – Sistema multiplex de segunda geração 
 
STR – Repetições curtas enfileiradas [short tandem repeats] 
 
 
 
 
Taq – DNA polimerase derivada da Thermus aquaticus 
 
XL PCR – PCR extra-longas 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 – Introdução 1 
2 – Histórico 3 
3 – DNA fingerprinting 6 
4 – Reação em cadeia da polimerase (amplificação de DNA in vitro) 8 
5 – Seqüenciamento 13 
6 – Futuro 15 
6.1 – Amplificação de quantidade traço de DNA 15 
6.2 – Banco de dados 16 
6.2.1 – Seleção de loci STR para multiplexação forense 17 
6.2.2 – Nomenclatura do locus STR 18 
6.3 – Patentes 22 
 
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 23 
 
ANEXOS 24 
Anexo A – Genetic Fingerprinting 24 
 
1 
 
1 Introdução: 
 Barry Scheck e Peter Nefeuld expressaram bem a questão no prefácio de seu 
livro Actual innocence: “Os testes de DNA são para a justiça o que o telescópio é para as 
estrelas; não uma lição de bioquímica, não uma exibição das maravilhas da lente de aumento, 
mas uma maneira de ver as coisas como realmente são”. O que poderia haver de errado nisso? 
 O ácido desoxirribonucleico (DNA) é o código genético de muitos organismos. 
O DNA de humanos e de muitos outros organismos como gatos, cães, ovelhas, tigres, cavalos, 
plantas (e.g., Cannabis sativa), e bactérias tem sido utilizado em aplicações forenses. Os 
primers para humanos podem ser utilizados para amplificar DNA de alguns outros primatas. 
 A maioria do DNA humano está presente no núcleo da célula. Ele está 
empacotado nos 46 cromossomos da maioria das células. Este DNA é denominado DNA 
nuclear. Entretanto, uma pequena porção do DNA de cada célula está localizada nas 
mitocôndrias. Este DNA mitocondrial é herdado por um mecanismo diferente e é tratado de 
forma diferente no contexto forense. 
 A maioria das células humanas é diplóide, isto significa que elas têm duas 
cópias de cada cromossomo. São exceções, as células sexuais (esperma ou óvulos), que são 
haplóides (tem uma cópia simples de cada cromossomo), e as células do fígado, que são 
poliplóides – triploidia (69,XXX) e tetraploidia (92,XXXX) são diferentes de aneuploidia 
(47,XXX) e (48,XXXX). As células diplóides contêm 46 cromossomos em 23 pares (durante 
40 anos considerou-se 48 cromossomos). Os cromossomos humanos são numerados de 1 a 
22, no qual o maior recebe o número 1 e o segundo maior o número 2. Os 23 pares 
compreendem os cromossomos X e Y, que dá o sexo do indivíduo. Este par pode ser 
denominado como “não autossômico” ou “germinativo”. 
 Cada cromossomo possui um centrômero. Esta estrutura está envolvida na 
organização do DNA durante a divisão celular. Ele é sempre fora do centro e por 
conseqüência produz o braço curto e o braço longo do cromossomo. 
 Uma fêmea normal tem dois cromossomos X enquanto que um macho normal 
tem um cromossomo X e um Y. Um dos cromossomos X da fêmea é desativado em cada 
célula, tornando-se uma estrutura visível ao microscópio conhecida como corpo visível de 
Barr. O cromossomo X desativado pode diferir entre cada célula. Em mamíferos, a existência 
de um cromossomo Y determina que o organismo seja macho. De fato, a existência de uma 
pequena seção do braço curto do cromossomo Y resultará em um macho (outras ordens de 
 
2 
 
vida, tais como os répteis, determinam o sexo utilizando outros mecanismos). Um 
cromossomo de cada um dos 23 pares é herdado da mãe e outro do pai. 
 Pela análise de um único indivíduo, não é possível dizer que cromossomo veio 
do pai ou da mãe, com a exceção do cromossomo sexual de um indivíduo macho cujo 
cromossomo Y advém de seu pai e cujo cromossomo X advém de sua mãe. Entretanto, há 
estudos recentes utilizando identificação do tipo paternally imprinted allele (PIA) que 
sugerem que isto pode ser possível para alguns loci. Em mamíferos, alguns genes sofrem 
impressão paterna e tanto o alelo da mãe quanto do pai pode ser preferencialmente expresso 
nos seus descendentes. A razão para isto ainda é desconhecida. A impressão parece estar 
associada com a metilação diferencial do alelo. Trinta e nove genes humanos têm sido 
identificados como sujeitos à impressão paterna. 
 Quando o perfil de DNA da maioria dos indivíduos é verificado, eles mostram 
um ou dois alelos para cada locus. Se eles apresentam um, nós assumimos que eles serão 
homozigóticos – isto significa que eles têm recebido duas cópias de um mesmo alelo, um de 
cada pai. Se os indivíduos mostram dois alelos, ele ou ela é denominado heterozigótico. Em 
tais casos, o indivíduo herdou diferentes alelos de cada pai. A exceção é causada pelos alelos 
nulos ou silenciosos. 
 Acredita-se que todos os humanos, exceto os gêmeos idênticos, diferem em seu 
DNA nuclear. Mesmo gêmeos idênticos podem diferir em menor proporção. Não há uma 
prova formal deste conceito de unicidade, contudo isto tem pouca influência nos trabalhos 
forenses porque somente algumas poucas regiões ou loci do genoma humano são examinadas. 
As áreas do genoma humano utilizadas para os perfis de DNA STR [short tandem repeats] 
são largamente intrônicas. Isto significa que elas são segmentos de DNA que não codificam 
para proteínas distribuídas entre áreas do DNA que codificam para proteínas. Elas foram 
inicialmente consideradas não funcionais; entretanto, acumulam-se evidências de que estas 
regiões de DNA podem, certamente, ter uma função. Uma das funções para essas regiões 
pode ser a regulação do desenvolvimento de eucariotos. Interessantemente, grandes áreas de 
DNA que não codificam proteínas, muitas das quais não estão relacionadas à regulação, são 
fortemente conservadas entre as espécies. Isto pode ser uma forte evidência que elas também 
são, certamente, funcionais. 
 Introns são peculiares de eucariotos e acredita-se que se desenvolveram 
posteriormente na evolução eucariótica. Eles apresentam uma característica de conter regiões 
polimórficas, ou seja que têm muitas formas diferentes. Acredita-se que isto se deve à 
 
3 
 
pequena ou à quase nenhuma pressão seletiva em alguns destes loci e, que por conseqüência, 
diferentes formas podem subsistirlado a lado na população. 
 Algumas alterações alélicas têm sido registradas em células da mucosa oral e 
colorretal de pacientes com câncer e isto pode afetar a genotipagem quando um DNA de 
referência é tomado de um tecido diferente do corpo na amostra de cena de crime. 
 
2 Histórico: 
 Até meados da década de 1980, a amplificação de uma determinada região do 
DNA dependia do método Cohen-Boyer de clonagem molecular, a saber: recortar o pedaço 
desejado de DNA, inseri-lo num plasmídeo, e inserir o plasmídeo modificado numa célula 
bacteriana. Essa célula então se replicava, duplicando em cada replicação o segmento inserido 
de DNA. Quando as bactérias se multiplicassem o suficiente, purificava-se o segmento de 
DNA desejado separando-o da massa total de DNA da população bacteriana. Embora 
houvesse sido aprimorado desde os experimentos originais de Boyer e Cohen, esse 
procedimento continuava sendo trabalhoso e demorado. A descoberta da reação em cadeia da 
polimerase (PCR) foi, portanto, um grande avanço: alcançava-se o mesmo fim – a 
amplificação seletiva de um segmento de DNA – em poucas horas, sem a necessidade de ficar 
lidando com bactérias. 
 
 Nesta época, a controvérsia genômica estava no auge, talvez porque a 
tecnologia forense estivesse sendo aplicada cada vez mais, embora ainda se usasse a técnica 
original, ainda não aperfeiçoada, de Jeffreys – a barulhenta e obscura análise dos 
polimorfismos do comprimento dos fragmentos de restrição [conhecidos pela sigla em inglês 
RFLP = restriction fragment length polymorphisms]. Inevitavelmente, alguns resultados eram 
difíceis de interpretar e, com isso, a identificação genômica passara a ser contestada por 
motivos técnicos e legais. 
 
 No início, quando a identificação genômica era realizada em laboratórios 
forenses não especializados no manuseio e na análise do DNA, erros crassos não eram 
incomuns. Os órgãos de segurança pública logo perceberam que, se quisessem que essa nova 
e poderosa arma continuasse sendo usada, essas questões teriam de ser resolvidas. Foi quando 
um novo tipo de marcador genético – as chamadas “repetições curtas enfileiradas”, 
conhecidas pela sigla em inglês STRs [short tandem repeats] – substituiu o método dos 
 
4 
 
RFLPs. O tamanho das STRs pode ser medido com bastante precisão, eliminando-se assim a 
avaliação subjetiva das faixas de RFLPs num filme de raios X. E a comunidade da ciência 
forense também resolveu rapidamente o problema da competência técnica variável ao 
estabelecer não só um código uniforme de procedimentos para a identificação genômica, mas 
também um sistema de credenciamento de laboratórios. 
 
 Na Rússia, a identificação dos resquícios esqueletais da família do czar 
Romanov foi recebida com certo ceticismo, especialmente pela discórdia entre os cientistas 
russos e uma equipe americana que participava do projeto. Mas, em setembro de 1992, o dr. 
Pável Ivanov levou nove amostras de ossos ao laboratório de Peter Gill, do Serviço de Ciência 
Forense [Forensic Science Service] da Grã-Bretanha. Gill e um colega, David Werrett, eram 
co-autores do primeiro trabalho que Alec Jeffreys publicou nesse campo e haviam fundado o 
Serviço de Ciência Forense, o primeiro laboratório do Reino Unido especializado em 
identificação genômica. 
 Gill desenvolvera um método de identificação que utilizava DNA mitocondrial 
(DNAmt) – que, como vimos na análise dos restos neandertais, é muito mais profícuo quando 
o DNA disponível é velho ou difícil de obter (o DNAmt é muito mais abundante do que o 
DNA cromossômico do núcleo celular). 
 A primeira incumbência de Gill e Ivanov foi o delicado trabalho de extrair 
DNA nuclear e DNAmt das amostras de ossos. A análise mostrou que cinco corpos eram 
aparentados e que três deles pertenciam a três irmãs. Mas seriam ossos dos Romanov? No 
caso da czarina Alexandra, pelo menos, era possível encontrar uma resposta comparando a 
impressão genômica do DNAmt de seus ossos com a impressão do DNAmt de seu sobrinho-
neto, o príncipe Phillip, duque de Edimburgo. As impressões eram simétricas. 
 Encontrar um parente do czar foi bem mais difícil. O corpo do grão-duque 
Georgij Romanov, irmão caçula do czar, jazia num requintado sarcófago de mármore 
considerado precioso demais para ser arrombado. O sobrinho do czar recusou-se a cooperar, 
ainda rancoroso com a recusa do governo britânico em conceder asilo à sua família quando 
irrompeu a revolução. Sabia-se da existência de um lenço ensangüentado no Japão, que o czar 
usara após ser atacado por um espadachim homicida em 1892. Gill e Ivanov obtiveram um 
pequeno pedaço do lenço, mas verificaram que ao longo dos anos a relíquia fora tão 
contaminada por DNA estranho que se tornara inútil para esse fim. Só quando dois parentes 
 
5 
 
distantes puderam enfim ser localizados é que se confirmou que a impressão do DNAmt era 
realmente do czar. 
 Contudo, a análise guardava mais uma surpresa: as seqüências de DNAmt do 
suposto czar e de seus parentes modernos eram semelhantes, mas não idênticas. 
Especificamente, na posição 16.169, o DNAmt do suposto czar continha um C e o dos dois 
parentes apresentava um T. Testes subseqüentes mostraram outras complicações. O DNA 
mitocondrial do czar era, na realidade, uma mistura de dois tipos (C e T), uma condição 
bastante rara conhecida como heteroplasmia – a coexistência num mesmo indivíduo de mais 
de um tipo de DNAmt. 
 Alguns anos depois, as dúvidas de todos (exceto as dos mais ferrenhos adeptos 
de teorias conspiratórias) foram finalmente resolvidas. O governo russo concordara em 
romper o sarcófago e proporcionar a Ivanov uma amostra de tecido de Georgij Romanov, 
irmão do czar. As mitocôndrias do grão-duque apresentavam exatamente a mesma 
heteroplasmia encontrada nos ossos do fosso em Koptiaki. Agora não havia dúvida de que os 
ossos eram do czar. 
 
 Quando Brian Sykes fundou uma empresa para oferecer serviços de 
identificação genômica, um dos primeiros clientes foi a Sociedade John Clough, cujos 
membros remontam suas origens a um bretão de mesmo nome que emigrara para 
Massachusetts em 1635. A sociedade sabia também que certo antepassado de John Clough, 
Richard, da linhagem galense da família, recebera o título de cavaleiro por feitos numa 
cruzada à Terra Santa. Mas não havia nenhuma prova histórica que associasse suas famílias 
àquelas do outro lado do Atlântico. A empresa de Sykes analisou o DNA de cromossomos Y 
dos Clough de Massachusetts e de um homem que descendia diretamente de sir Richard: eram 
idênticos – comprovação para o ramo de Massachusetts. Mas nem todos os Clough 
americanos tiveram a mesma sorte, pois se constatou que membros da sociedade no Alabama 
e na Carolina do Norte não tinham parentesco nem com sir Richard nem com os Clough de 
Massachusetts. 
 
 Um caso recente mereceu várias manchetes devido ao grande interesse 
histórico do suposto pai. Há muito suspeitava que Thomas Jefferson, terceiro presidente dos 
Estados Unidos e principal autor da Declaração de Independência, fora mais do que um dos 
pais fundadores da nação, pois teria tido um ou mais filhos com sua escrava, Sally Hemings. 
 
6 
 
A primeira acusação data de 1802, apenas doze anos após o nascimento de um menino, Tom, 
que adotaria o sobrenome de um de seus donos subseqüentes, Woodson. Além disso, uma 
forte semelhança com Jefferson havia sido notada no último filho de Hemings, Eston. Mas era 
o DNA que estava fadado a resolver a questão. 
 Thomas Jefferson não deixou descendentes homens legítimos, de modo que era 
impossível determinar os marcadores do seu cromossomo Y. Em vez disso, os pesquisadores 
obtiveram amostras do DNA dos descendentes masculinos do seutio paterno, Field Jefferson 
(cujo cromossomo Y teria sido idêntico ao do presidente), e as compararam com amostras dos 
descendentes masculinos de Tom Woodson e Eston Hemings. Os resultados identificaram 
uma inconfundível impressão jeffersoniana no cromossomo Y, mas a impressão genômica 
não estava presente nos descendentes de Tom Woodson. A reputação de Jefferson conseguiu 
escapar ilesa dessa bala. Todavia, nos descendentes de Eston Hemings, a assinatura 
jeffersoniana no cromossomo Y estava clara e distinta. O que o DNA não pode confirmar sem 
razoável sombra de dúvida é a origem desse cromossomo. Não podemos dizer com certeza se 
o pai de Eston foi realmente Thomas Jefferson ou se algum outro homem da linhagem 
jeffersoniana teve acesso a Sally Hemings. 
 
3 DNA fingerprinting: 
 DNA fingerprinting ou “identificação genômica” [literalmente, “datiloscopia 
do DNA”], como é chamada a técnica que salvou Marvin Anderson de uma prisão perpétua 
indevida, foi uma descoberta acidental de um geneticista britânico, Alec Jeffreys. Desde o 
início da revolução instaurada pela tecnologia do DNA recombinante, Jeffreys se interessara 
pelas diferenças genéticas entre as espécies. Suas pesquisas na Universidade de Leicester se 
concentraram no gene da mioglobina, que produz uma proteína semelhante à hemoglobina, 
encontrada principalmente em tecido muscular. Foi durante essa “dissecação molecular” que 
ele constatou algo muito estranho; um pequeno trecho de DNA que se repetia continuamente. 
Um fenômeno similar havia sido observado em 1980 por Ray White e Arlene Wyman, que, ao 
examinarem outro gene, constataram que o número dessas repetições variava de indivíduo 
para indivíduo. Jeffreys concluiu que faziam parte do DNA-lixo, por não participarem de 
codificação de proteínas, mas logo verificou que esse lixo em particular poderia ser muito 
bem aproveitado. 
 Jeffreys constatou que esse curto trecho de DNA repetitivo aparecia não apenas 
no gene da mioglobina, mas espalhado por todo o genoma. E, embora os trechos variassem 
 
7 
 
um pouco de uma repetição para outra, todos tinham em comum uma seqüência curta, 
praticamente idêntica, de cerca de quinze nucleotídeos. Ele decidiu usar essa seqüência como 
uma “sonda”: utilizando uma amostra purificada da seqüência, marcada com uma molécula 
radioativa, pôs-se a “caçar” a seqüência por todo o genoma. O DNA do genoma é espalhado 
numa folha de náilon especial e, por emparelhamento das bases, a sonda irá grudar na sua 
seqüência complementar sempre que a encontrar. Usando um filme de raios X sob a folha de 
náilon, Jeffreys pôde registrar o padrão desses pontos radioativos. Quando revelou o filme 
desse experimento, ficou pasmo com o que viu. Embora a sonda houvesse detectado muitas 
seqüências similares em inúmeras amostras de DNA, ainda restava tanta variação entre uma 
amostra e as demais que, mesmo naquelas extraídas de membros da mesma família, era 
possível distinguir um indivíduo do outro. Como disse no artigo que escreveu a respeito para 
a revista Nature em 1985, o “perfil nos fornece uma fingerprint [impressão digital] específica 
de cada indivíduo”. 
 O nome identificação genômica, ou DNA fingerprinting, é pertinente, pois essa 
tecnologia tem a capacidade de identificar indivíduos por meio da sua “impressão” – 
impressão digital na datiloscopia tradicional, uma impressão genômica no caso do DNA 
fingerprinting. Jeffreys e seus colegas extraíram amostras de DNA do próprio sangue e as 
submeteram ao mesmo procedimento. Conforme esperado, as imagens estampadas no filme 
de raios X permitiram distinguir, sem ambigüidade, cada um deles. Jeffreys percebeu que 
havia um amplo espectro de utilidades possíveis. 
 
 Hoje, as “repetições curtas enfileiradas” (STRs = short tandem repeats) 
substituíram os polimorfismos do comprimento dos fragmentos de restrição (RFLPs = 
restriction fragment length polymorphism) como o principal método de identificação 
genômica. As STRs, cujas seqüências de duas a quatro bases podem se repetir até dezessete 
vezes, são segmentos comumente amplificados pela reação em cadeia da polimerase. Os loci 
STR selecionados têm alelos muito menores, entre 100 e 400 pares de base (pb). Por exemplo, 
a D7S820 é uma região do cromossomo 7 onde a seqüência AGAT pode ocorrer entre sete e 
quatorze vezes. No entanto, a DNA polimerase não é muito eficiente em copiar esses trechos 
repetidos de DNA – seu sistema de contagem não é muito preciso –, de modo que há um 
grande número de mutações nas cópias que ela faz da seqüência AGAT na posição D7S820 (a 
DNA polimerase de procariotos não apresenta unidades de verificação como as de 
eucariotos). Em outras palavras, há muita variação no número de cópias de AGAT em cada 
 
8 
 
ser humano. Como possuímos duas cópias do cromossomo 7 (uma de nosso pai, outra de 
nossa mãe), costumamos ter um número diferente de repetições AGAT em cada uma – 
digamos, oito em uma das cópias e onze na outra –, mas isso não significa dizer que um 
indivíduo não possa ser homozigótico para um determinado número de repetições (e.g., onze 
e onze). Se realizarmos uma análise de identificação genômica numa amostra de sangue 
encontrada na cena de crime e constatarmos que ela corresponde às características do suspeito 
na região D7S820 (digamos, oito e onze repetições), haverá um indício, mas não uma prova 
conclusiva da sua culpabilidade – afinal, muitas outras pessoas também têm um genótipo 8/11 
na região D7S820. Portanto, é necessário examinar diversas regiões; quanto maior o número 
de regiões em que o DNA da cena de crime corresponder às do suspeito, maior a 
probabilidade de ele ser culpadas e mais remotas as chances de o DNA encontrado no local de 
crime ter vindo de outra pessoa. No sistema do FBI, a identificação genômica se faz mediante 
análise de doze regiões, mais um marcador que determina o sexo do indivíduo de quem a 
amostra de DNA foi retirada. 
 
4 Reação em cadeia da polimerase (amplificação de DNA in vitro): 
 Ela é para os genes aquilo que o sistema de impressão de Gutenberg foi para a 
palavra escrita. A técnica de reação em cadeia da polimerase [Polymerase Chain Reaction 
(PCR)] pode amplificar uma seqüência desejada de DNA de fita simples ou dupla de qualquer 
origem (DNA genômico, DNA viral, seqüências clones, lisados de células, DNA bacteriano, 
DNA de planta, ou DNA antigo, por exemplo) centenas de milhões de vezes em questão de 
horas, uma tarefa que teria exigido muitos dias com a tecnologia recombinante. A técnica de 
PCR é especialmente valiosa porque a reação é altamente específica, facilmente automatizada, 
e capaz de amplificar diminutas quantidades de amostra. Por estas razões, a PCR também tem 
proporcionado um grande impacto na medicina clínica, no diagnóstico de doenças genéticas, 
na ciência forense, e na biologia evolucionária. 
 A PCR é um processo baseado em uma enzima polimerase especializada, que 
pode sintetizar uma fita complementar para uma dada fita de DNA, utilizando uma mistura 
contendo a seqüência alvo, as 4 bases do DNA, 2 fragmentos (primers, cada qual com cerca 
de 20 bases de comprimento), e geralmente 10 mM de tampão Tris-HCl, 50 mM de KCl para 
conferir força iônica, e Mg+2 como um co-fator (concentrações ótimas de Mg+2 podem ter que 
ser determinadas para cada reação). 
 
9 
 
 A reação em cadeia da polimerase foi originalmente descrita em 1986 e desde 
então tem se tornado uma das técnicas mais freqüentemente utilizadas e largamente aplicadas 
na biologia celular. Em sua forma mais simples, dois oligodesoxiribonucleotídeos (oligos) são 
utilizados para selecionar uma seqüência alvo específica de uma mistura de moléculas de 
DNA e atuar como primers paraa extensão do DNA utilizando o DNA alvo como molde. 
 
Figura 1: Esquema da amplificação de DNA pela reação em cadeia da polimerase: 
 
 
 A reação em cadeia da polimerase é um processo ao mesmo tempo requintado 
e simples. Por meio de métodos químicos, sintetizamos dois primers – pequenos trechos de 
uma única fita de DNA, normalmente com vinte pares de bases de comprimento – cuja 
seqüência corresponde às regiões que margeiam o segmento de DNA em que estamos 
interessados. Os primers, que delimitam o gene desejado, são adicionados ao molde de DNA, 
que foi extraído de uma amostra de tecido e que essencialmente contém o genoma inteiro. 
Quando o DNA é aquecido a 95 °C ± 1°C, as duas fitas se separam. Isso permite que cada 
primer se ligue aos fragmentos de vinte pares de bases do molde cujas seqüências sejam 
complementares às suas. A Tm (temperatura na qual metade das moléculas está na forma de 
 
10 
 
fita dupla e metade na forma de fita simples) é freqüentemente utilizada para a temperatura de 
acoplamento e então ajustada para cima ou para baixo se necessário [se o primer tem 18 bases 
de comprimento ou menos, a Tm pode ser estimada pela seguinte fórmula: Tm = 4 °C (número 
de pares de base GC) + 2 °C (número de pares de base AT)]. Desse modo, formamos duas 
pequenas ilhas, com vinte pares de bases de DNA de dupla fita, ao longo das fitas simples do 
molde de DNA. A DNA polimerase – a enzima que copia DNA incorporando novos pares de 
bases em posições complementares ao longo de uma fita de DNA – só funcionará a partir do 
ponto em que o DNA já for de fita dupla. Portanto, a DNA polimerase passa a atuar na ilha de 
fita dupla criada pela união do primer com a região complementar do molde quando a 
temperatura é baixada para 72 °C. A polimerase faz uma cópia complementar do molde de 
DNA a partir de cada primer, copiando assim a região-alvo. No final do processo, a 
quantidade total do DNA-alvo terá dobrado. Em seguida, repetimos a etapa de aquecimento e 
o processo todo ocorre novamente. E, mais uma vez, dobra-se o número de cópias do DNA 
delimitado pelos dois primers. Cada ciclo do processo resulta na duplicação da região visada. 
Após 25 ciclos da reação em cadeia da polimerase – ou seja, em menos de duas horas –, nosso 
DNA-alvo terá sido amplificado 225 vezes (cerca de 34 milhões de vezes). Com isso, a 
solução resultante, que começou como uma mistura de molde de DNA, primers, enzimas 
DNA polimerase e As, Ts, Gs e Cs livres, terá se tornado uma solução concentrada da região-
alvo do DNA. 
 Um grave problema inicial da reação em cadeia da polimerase é que a DNA 
polimerase, a enzima responsável pela multiplicação, é destruída a 95 °C. Portanto, torna-se 
necessário obter enzimas novas em cada um dos 25 ciclos do processo. A polimerase é cara, 
de modo que logo ficou evidente que a sua reação em cadeia, por maior que fosse o potencial, 
não seria uma ferramenta economicamente viável se significasse “transformar em fumaça” 
enormes quantidades do material. Mas a natureza acabou dando uma mãozinha. Muitos 
organismos vivem em temperaturas muito superiores aos 37 °C ideais para a E. coli, a fonte 
original da enzima; as proteínas dessas criaturas, incluindo enzimas como a DNA polimerase, 
foram se adaptando ao longo de milênios de seleção natural para suportar o calor. Hoje, a 
reação em cadeia da polimerase costuma ser realizada usando uma forma de DNA polimerase 
derivada da Thermus aquaticus (Taq), uma bactéria que vive nas termas quentes do parque 
nacional Yellowstone. Embora a Taq apresente taxas baixas de erro, é suficientemente exata 
para a maioria das aplicações. Se a exatidão for fundamental para o experimento, pode ser 
necessário utilizar uma polimerase que tenha uma exonuclease 3’-5’ intrínseca, com atividade 
 
11 
 
de verificação, como a polimerase vent. Para a amplificação de seqüências de mais do que 10 
kpb, devem ser utilizadas condições de PCR extra-longas (XL PCR), e, por esta razão, torna-
se fundamental utilizar uma polimerase com atividade de verificação, porque os erros podem 
levar a terminação da síntese. 
 Repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento multiplicam o DNA alvo 
exponencialmente, pois cada nova fita dupla se separa para servir de molde para as sínteses 
subseqüentes. Em aproximadamente 1 hora, 20 ciclos de PCR podem amplificar o alvo por 
um milhão. 
 A DNA polimerase utilizada no PCR é específica para DNA, mas é possível 
analisar RNA mensageiros (mRNA) utilizando o método de PCR pela incorporação de uma 
etapa com uma transcriptase reversa (RT) de forma a converter mRNA em uma fita dupla 
complementar de DNA; esta técnica é conhecida como RT-PCR. A transcrição reversa e a 
PCR podem ser realizadas por uma única enzima, rTth, porque ela apresenta tanto atividade 
de transcriptase reversa como de polimerase. 
 Para alguns experimentos, é necessário e mais eficiente amplificar um número 
de produtos diferentes simultaneamente em uma única reação, usando diferentes primers. Isto 
é denominado PCR multiplexado. Para o PCR multiplexado, faz-se necessário otimizar a 
escolha dos primers1 e as condições da reação de modo a eliminar produtos de amplificação 
espúrios. A reação em cadeia da polimerase pode ser utilizada para: amplificação de DNA (na 
identificação e isolamento de uma ou poucas cópias de uma seqüência alvo específica de uma 
matriz complexa); na manipulação de DNA (os primers de PCR podem ser desenvolvidos 
para ter um sítio de restrição incorporado à extremidade 5’, desta forma torna-se possível 
utilizar o PCR para amplificar genes inteiros ou porções de genes para propósitos de 
engenharia genética); na clonagem de genes com primers degenerados (PCR é utilizada para 
clonar genes mesmo quando a seqüência exata do gene de interesse não é conhecida, por 
exemplo, quando a seqüência de um gene é determinada por tradução reversa da seqüência de 
                                                            
1 Há várias considerações no desenvolvimento de primers para PCR. Embora a extremidade 3’ do primer, 
sobretudo suas duas últimas bases, seja importante para a especificidade e logo deveria ser complementar à 
seqüência alvo, é possível acoplar seqüências não complementares ao terminal 5’, por exemplo, sítios de enzima 
de restrição (para facilitar a clonagem dos amplicons de PCR) ou promotores. Os pares GC são mais estáveis do 
que os pares AT (os pares GC têm três pontes de hidrogênio e os pares AT têm duas), e é preferível ter G’s ou 
C’s na extremidade 3’ do primer e um conteúdo GC de 45 a 55%. Existem programas de computador que 
ajudam a desenvolver primers mais eficientes para seqüências conhecidas. Idealmente a temperatura para ambos 
primers deveria ser a mesma (dentro da fixa de 1 a 2 °C) de maneira que ambos acoplamentos ocorram na 
mesma temperatura. De forma a prevenir o acoplamento entre primer, que reduziria a eficiência da amplificação, 
os primers não devem ser complementares entre si ou em relação a cada outro. 
 
12 
 
uma proteína); na recombinação e na mutagênese de sítios específicos; na clonagem de 
seqüências desconhecidas: Inverse-PCR (IPCR) e Rapid Amplification of cDNA Ends 
(RACE); no mapeamento genético utilizando PCR; na análise de expressão gênica; no 
seqüenciamento de DNA; e na análise forense e na análise de DNA antigo (a sensibilidade da 
PCR e sua habilidade para detectar uma molécula alvo em uma mistura complexa, e o fato de 
que a PCR é utilizada para amplificar produtos de amostras de DNA não clonáveis – quando o 
DNA não tem sido purificado ou quando ele é parcialmente degradado – tem feito da PCR 
uma ferramenta valiosa quando o material inicial é limitado ou de baixa qualidade. Por estas 
razões, a técnica de PCR tem semostrado especialmente útil na análise de DNA antigo 
isolado de, por exemplo, espécimes de museu, lâminas, mamutes congelados, ou insetos em 
âmbar). 
 A técnica de PCR é utilizada na ciência forense pelas mesmas razões que ela é 
aplicada na análise de DNA antigo. Ela ajuda na produção de material de alta qualidade 
suficiente para as análises subseqüentes. Por este motivo, a análise de marcadores baseado na 
técnica de PCR é muito mais rápida do que os métodos antigos, tais como a análise de RFLP, 
para confrontar amostras (tais como amostras de sangue ou esperma) com indivíduos. 
 A introdução da análise de STR baseada na técnica de PCR expandiu a 
utilidade de perfil de DNA. Eis os motivos: 
• O desenvolvimento de PCR melhorou a sensibilidade da análise; 
• O tempo por análise foi reduzido a menos de 24 horas; 
• O custo efetivo do método foi amplamente melhorado devido à redução do 
trabalho necessário; 
• Loci STR menores permitiram a análise de amostras de DNA degradados, que 
são freqüentemente encontrados pelos peritos forenses. Isto ocorre porque 
esses segmentos menores de DNA apresentam mais chances de estarem 
intactos após degradação do material; 
• Loci STR podem ser multiplexados juntos utilizando diferentes tipos de pares 
de primers para amplificar diversos loci em uma reação. A multiplexação foi 
posteriormente facilitada pelo desenvolvimento de primers marcados que 
podiam ser analisados em um seqüenciador automático; 
• A coleta de dados foi automatizada, e a análise de dados foi parcialmente 
automatizada. 
 
13 
 
 
5 Seqüenciamento: 
 O outro burro de carga foi o próprio método de seqüenciar DNA. Também 
aqui, a teoria química subjacente não era nova; o Projeto Genoma Humano usou o mesmo 
método desenvolvido por Fred Sanger em meados dos anos 1970. A inovação estava na 
escala, na mecanização do processo de seqüenciamento. 
 Os dois métodos básicos de seqüenciamento, Maxam-Gilbert e Sanger, diferem 
principalmente na forma que os fragmentos de DNA são produzidos. Ambos os métodos 
funcionam porque a eletroforese em gel produz separações de elevada resolução de moléculas 
de DNA; mesmo fragmentos que diferem por apenas um simples nucleotídeo podem ser 
resolvidos. O seqüenciamento de Maxam-Gilbert (também chamado método de degradação 
química) utiliza substâncias químicas para quebrar o DNA em regiões de bases específicas, 
resultando em fragmentos de diferentes tamanhos. Um refinamento do método de Maxam-
Gilbert, conhecido como seqüenciamento multiplexado, tornou os pesquisadores capazes de 
analisarem aproximadamente 40 clones de um único seqüenciamento em gel de DNA. 
 O seqüenciamento de Sanger (também chamado de terminação da cadeia ou 
método da dideóxi) utiliza um procedimento enzimático para sintetizar cadeias de DNA de 
comprimentos variáveis por meio de quatro diferentes reações, parando a replicação do DNA 
nas posições ocupadas por uma das quatro bases, e, portanto, determinando o tamanho dos 
fragmentos resultantes. Cada tubo de reação de seqüenciamento (T, C, G, e A) no diagrama da 
figura 2 contém: um molde de DNA, uma seqüência primer, e uma DNA polimerase para 
iniciar a síntese de uma nova fita de DNA a partir do ponto no qual os primers hibridizam 
com o molde; quatro trifosfato deoxinucleotídeos (dATP, dTTP, dCTP, e dGTP) para 
estender a fita de DNA; um trifosfato de deoxinucleotídeo (usando um elemento radioativo ou 
corante); e um trifosfato de dideoxinucleotídeo, que termina o alongamento da cadeia quando 
ele é incorporado. O tubo A tem didATP, o tubo C tem didCTP, etc. 
 Por exemplo, no tubo de reação A, a razão de dATP para didATP é ajustada de 
forma que o tubo tenha uma coleção de fragmentos de DNA com uma didATP incorporada 
para cada posição de adenina nos fragmentos moldes de DNA. Os fragmentos de tamanhos 
variados são então separados por eletroforese (1) e as posições dos nucleotídeos analisadas 
para determinar a seqüência. Os fragmentos são separados com base em seu tamanho, com os 
fragmentos mais curtos movendo-se mais rapidamente e aparecendo na base do gel. A 
seqüência é lida da base para o topo (2) (figura 2). 
 
14 
 
 
Figura 2: Seqüenciamento de DNA pelo método de Sanger: 
 
 
 A automação do seqüenciamento começou a ser desenvolvida no laboratório de 
Lee Hood, no Caltech. 
 Na verdade, o seqüenciamento automatizado nasceu das idéias de Lloyd Smith 
e Mike Hunkapiller. Quando trabalhava no laboratório de Hood, Hunkapiller procurou Smith 
para falar sobre um método de seqüenciamento que usava um corante diferente para cada tipo 
de base. Em princípio, a idéia prometia tornar o processo de Sanger quatro vezes mais 
eficiente: em vez de quatro reações de seqüenciamento separadas, cada uma numa banda de 
gel distinta, o código de cores permitiria realizar tudo num único conjunto de reações e obter 
o resultado numa única banda de gel. Smith mostrou-se inicialmente pessimista, temendo que 
as quantidades de corantes exigidas pelo método seriam pequenas demais para detectar. Mas, 
 
15 
 
sendo um especialista em aplicações de laser, logo concebeu uma solução usando corantes 
especiais que ficam fluorescentes sob raios laser. 
 Segundo o método de Sanger, cria-se uma série de fragmentos de DNA, que 
são selecionados pelo gel de acordo com o tamanho de cada um. Cada fragmento é marcado 
com o corante fluorescente que corresponde ao seu nucleotídeo dideóxi demarcador de 
cadeia; desse modo, a cor emitida pelo fragmento identifica qual é a base. Em seguida, um 
laser rastreia o fundo do gel, ativando a fluorescência, e uma célula fotoelétrica ali colocada 
detecta a cor emitida por cada pedaço de DNA. Essas informações são alimentadas 
diretamente num computador, evitando-se assim o extenuante processo de digitar dados que 
transtornava o seqüenciamento manual. 
 
Figura 3: Eletroferograma de uma análise de DNA mitocondrial: 
 
 
6 Futuro: 
6.1 Amplificação de quantidade traço de DNA: 
 Com os métodos antigos, anteriormente descritos, se necessitava tipicamente 
de 500 ng de material. Por outro lado, com a técnica da reação em cadeia de polimerase, 1 ng 
ou menos pode ser analisado. Geralmente, a perfil de STR baseado em PCR é sensível a cerca 
de 250 pg; no entanto, uma concentração de 0.5 a 1.0 ng é geralmente analisada. Para 
aumentar a sensibilidade de amostras de DNA abaixo deste limiar, podem ser empregados até 
34 ciclos. Isto dá um fator de amplificação teórico de 17.179.869.184 e permite analisar 
amostras que tem somente quantidades traço de DNA tais como superfícies que foram 
tocadas. Na verdade, é possível amplificar o DNA de uma única célula. A análise de vestígios 
de DNA em quantidades traço é denominada “low copy number” (LCN). Os relatórios de 
 
16 
 
análise de vestígios de LCN são diferentes dos relatórios de perfil de DNA convencional 
devido ao aumento da incerteza na origem do DNA e ao aumento de artefatos. 
 
6.2 Banco de dados: 
 Em 1990, o FBI montou uma base de dados de DNA, o Sistema Conjunto de 
Indexação do DNA [CODIS = Combined DNA Index System], que, em junho de 2002, 
continha 1.013.746 impressões genômicas. Dessas, 977.895 eram de criminosos condenados e 
35.851 provenientes de amostras obtidas no local de crimes não resolvidos. Desde a sua 
criação, o CODIS já efetuou 4.500 identificações que não teriam sido possíveis de outra 
maneira. 
 Uma das principais justificativas para uma base de dados nacional é o potencial 
de se fazer cold hits – identificações a partir exclusivamente de dados já cadastrados. Suponha 
que investigadores encontrem um pouco de DNA – sangue numa janela quebrada, sêmen 
numa peça íntima – no local de um crime e determinem a impressãogenômica dessa amostra. 
Suponha agora que eles não tenham obtido nenhum outro tipo de pista convencional. Porém, 
quando a impressão genômica é cadastrada no CODIS, o sistema acusa uma correspondência. 
Foi o que aconteceu em Saint Louis em 1996. A polícia investigava o estupro de duas jovens 
em regiões opostas da cidade e, embora as duas amostras de sêmen analisadas pelo método 
dos RFLPs mostrassem que o mesmo homem cometera ambos os crimes, não tinha sido 
possível identificar um suspeito. Três anos depois, as amostras foram re-analisadas usando as 
STRs e os resultados comparados com as impressões cadastradas no CODIS. Com isso, se 
encontrou o estuprador em 2001, certo Dominic Moore, cuja impressão genômica fora 
cadastrada no CODIS ao confessar três outros estupros em 1999. 
 O intervalo entre o crime e o cold hit pode ser ainda mais impressionante; 
alguns malfeitores devem ter levado um choque ao se depararem com o j’accuse molecular de 
vítimas há muito tempo enterradas. Na Grã-Bretanha, Marion Crofts, de catorze anos, foi 
estuprada e assassinada em 1981, muito antes de as técnicas de identificação genômica 
entrarem em uso. Felizmente, algumas provas materiais foram preservadas, tornando possível 
estabelecer uma impressão genômica em 1999. Mas as autoridades e a família pesarosa de 
Crofts acabaram desapontadas mais uma vez, ao serem informadas agora de que não havia 
impressão correspondente na Base Nacional de Dados de DNA do Reino Unido. Dois anos 
depois, em abril de 2001, Tony Jasinskyj foi preso por atacar sua esposa e uma amostra de 
 
17 
 
DNA foi extraída dele como procedimento de rotina. Após ser inserida na base de dados, a 
correspondência veio à tona; Jasinskyj era o estuprador desconhecido de vinte anos antes. 
 Assim, os períodos de prescrição visam a impedir erros judiciários. O DNA, 
entretanto, é uma testemunha de outra ordem. Amostras armazenadas em condições 
apropriadas permanecem estáveis por muitos anos, enquanto as impressões genômicas nunca 
perdem seu poder incriminativo. 
 O Departamento de Defesa Americano instituiu o Armed Forces Repository of 
Specimen Samples for Identification of Remains [Repositório das Forças Armadas para 
Amostras de Espécimes para Identificação de Restos Mortais]. Desde então, amostras de 
sangue e de DNA são obtidas de todos os novos membros das forças armadas, tanto os da 
ativa como os reservistas, e em março de 2001 o repositório continha mais de 3 milhões de 
amostras. 
 
6.2.1 Seleção de loci STR para multiplexação forense: 
 Loci STR consistem de segmentos repetidos de duas a oito bases. Eles são 
denominados diméricos, triméricos, e assim por diante. Loci diméricos não são utilizados para 
aplicações forenses devido ao grande número de bandas espúrias que se formam durante a 
amplificação, as quais são difíceis de interpretar. Loci triméricos, tetraméricos, e pentaméricos 
são menos sujeitos a este problema. 
 Diversos fatores são considerados na escolha de um loci STR: 
• Deseja-se um alto nível de variabilidade dentro de um locus de forma que o 
locus tenha uma baixa probabilidade de coincidência. 
• O comprimento dos alelos deve estar entre 90 e 500 pb. Tipicamente, quanto 
maior o peso molecular dos alelos, menor a precisão de sua medida. Alelos 
menores são menos afetados pela degradação. 
• Loci podem ser selecionados com base na localização cromossômica para 
garantir que loci próximos não sejam escolhidos. Na figura 4, há localização de 
alguns loci comuns. Como um guia rápido para a nomenclatura de localização 
do locus, aqueles que começam com D5 estão no cromossomo 5. 
• Robustez e reprodutibilidade de resultados são essenciais. 
• De forma a facilitar a interpretação, é desejável que os loci não repitam 
excessivamente. 
 
18 
 
 
 Sistemas multiplexados antigos foram baseados em uns poucos loci STR. O 
sistema de quatro locus quadruplex foi provavelmente o primeiro a ser largamente utilizado 
para propósitos forenses. A probabilidade de coincidência era baixa para os padrões 
modernos, na ordem de 10-4. Em 1996, um sistema de seis locus STR combinado com o teste 
do sexo da amelogenina foi introduzido. Esse sistema, conhecido como multiplex de segunda 
geração (SGM) tinha mais loci e incluía os loci complexos HUMD21S11 e 
HUMFIBRA/FGA, que são altamente polimórficos. A probabilidade de coincidência esperada 
foi diminuída para aproximadamente 1 em 50 × 106. Sistemas multiplexados com mais loci e 
maior poder de discriminação estão tornando-se cada vez mais disponíveis. 
 Com base nos exercícios iniciais da European DNA Profiling Group (EDNAP) 
e nas recomendações da European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) e nos 
trabalhos da Interpol, quatro sistemas foram definidos como padrão europeu de loci: 
HUMTHO1, HUMVWFA, HUMD21S11, e HUMFIBRA/FGA. Recentemente, três 
posteriores loci foram adicionados: HUMD3S1358, HUMD8S1179, e HUMD18S51. Um 
processo similar ocorreu no Canadá e nos Estados Unidos, onde a padronização foi baseada 
no sistema Conjunto de Indexação do DNA [CODIS = Combined DNA Index System] de 13 
loci. Os 13 loci designados pelo CODIS e os 8 loci (os sete mencionados acima mais a 
amelogenina) designados pelo ENFSI estão assinalados na figura 4. 
 No momento, há sete loci que são comuns entre os Estados Unidos e a Europa. 
As posições cromossômicas desses loci também são mostradas na figura 4. Os braços curtos e 
longos de um cromossomo são designados como p e q, respectivamente. Note que no sistema 
CODIS, há dois loci no cromossomo 5. 
 
6.2.2 Nomenclatura do locus STR: 
 Diferentes classes de loci STR têm sido definidas. Urquhart et al classificou os 
diferentes loci de acordo com a complexidade de suas seqüências. Um dos mais ubíquos loci 
STR usados é o HUMTHO1. Ele consiste de uma seqüência de repetição simples (TCAT)5-11 
com um alelo não consensual (TCAT)4CAT(TCAT)5. Loci STR compostos, tais como 
HUMVWFA31, consistem de seqüências repetidas (ATCT)2(GTCT)3-4(ATCT)9-13, enquanto 
que repetições complexas tais como HUMD21S11 são menos uniformes. Informações 
detalhadas podem ser obtidas do STRBase. 
 
19 
 
Figura 4: Perfis de STR de dois diferentes indivíduos: 
 
 
20 
 
Figura 5: Tabela de loci utilizados em determinados métodos multiplexados: 
 
 
21 
 
Figura 6: Análise de STR de um indivíduo homem. 
 
 
22 
 
Figura 7: Análise de STR de um indivíduo mulher: 
 
 
6.3 Patentes: 
 Hunkapiller deixou o laboratório de Hood em 1983 e foi trabalhar para a 
Applied Biosystems, Inc. (ABI), uma fabricante de instrumentos que acabara de ser fundada e 
que produziria a primeira máquina de seqüenciamento Smith-Hunkapiller. Desde então, a 
eficiência do processo aumentou imensamente: os géis (lentos e difíceis de manusear) foram 
descartados e substituídos por sistemas capilares de grande vazão – finíssimos tubos nos quais 
os fragmentos de DNA são separados em alta velocidade de acordo com o tamanho. Hoje, a 
última geração de seqüenciadores da ABI é de uma rapidez descomunal, sendo alguns 
milhares de vezes mais ágeis do que o próprio protótipo. Com um mínimo de intervenção 
humana (cerca de quinze minutos a cada 24 horas), essas máquinas conseguem seqüenciar até 
meio milhão de pares de bases por dia. 
 Estes loci estão incluídos no sistema multiplexado comercial fabricado pela PE 
Applied Biosystems, Promega Corporation, e outros. 
 
23 
 
 
7 Bibliografia Consultada: 
WATSON, James D. DNA: o segredo da vida. São Paulo: Companhia das Letras, 2005. 
 
U.S. DEPARTMENT OF ENERGY. DOE Human Genome Program: primer on 
molecular genetics. Washington: Office of Health and Environmental Research, 1992. 
 
BUCKLETON,John; TRIGGS, Cristopher M. Forensic DNA Evidence Interpretation. 
Wasshington: CRC Press, 2005. 
 
CREIGHTON, Thomas E. Encyclopedia of Molecular Biology. Nova Iorque: John Wiley & 
Sons, Inc., 1999.