Meios de cultura e coloração

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Preparação e distribuição de meios de cultura
Os meios comerciais devem ser hidratados; 
Devem ser pesados  papel manteiga/alumínio;
Frasco;
Hidratar em pequena quantidade;
Depois deve-se acrescentar o restante da água;
Levar o meio para fundir  aquecer;
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Preparação e distribuição de meios de cultura
Usar sempre luvas térmicas;
Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC;
Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de 0,22 micra, recomendado para partículas bacterianas;
Distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados;
Distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias  estéreis;
Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor;
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Meios de cultura - transporte
CARY BLAIR
Microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio;
A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles;
FUNÇÃO
Transporte de material fecal e conseqüente conservação dos microrganismos;
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Meios de cultura - transporte
SALINA TAMPONADA
Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável;
FUNÇÃO
Meio de transporte de fezes.
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Meios de cultura - transporte
MEIO STUART
A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles;
FUNÇÃO
Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos;
Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.
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Meios de cultura - manutenção
ÁGAR NUTRIENTE
Meio simples, de fácil preparação e barato;
FUNÇÃO
Várias aplicações  análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras;
Conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente;
Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos;
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR CHOCOLATE
Utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes;
Cresce quase todos os tipos de microrganismos;
À base do meio  adiciona-se sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta  hemácias lisam liberando hemina e hematina  compostos  crescimento dos m.o exigentes;
Observação: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada à aproximadamente 50ºC;
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Meios para crescimento e isolamento
THAYER-MARTIN CHOCOLATE
É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria sp;
Contém em sua fórmula antibióticos;
Inibem o crescimento de outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados;
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
Possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem
microrganismos Gram positivos;
Lactose ao meio  se o m.o é lactose positiva;
Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro.
FUNÇÃO
Selecionar e isolar espécies de Salmonella sp e Shigella sp, em amostras de fezes, alimentos e água.
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Meios para crescimento e isolamento
CALDO SELENITO
Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos;
FUNÇÃO
Isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos...
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Meios para crescimento e isolamento
CALDO TETRATIONATO
Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adição da solução de iodo inibe a flora intestinal normal de espécies fecais;
FUNÇÃO
Meio de enriquecimento para Salmonella spp.
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR MAC CONKEY
O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos;
A concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios;
Não é tão seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS;
FUNÇÃO
BGN (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose;
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR SANGUE
Base rica;
Ótimas condições de crescimento;
Formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. E Staphylococcus spp;
FUNÇÃO
Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos;
Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp;
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
Microrganismos presentes em amostras urina;
A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus sp;
FUNÇÃO
Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras;
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Meios para crescimento e isolamento
CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
Nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose;
 A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas;
A dextose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação;
Função 
Cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos;
Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos;
Realização de teste de coagulase em tubo;
Teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C;
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Meios para crescimento e isolamento
LÖWENSTEIN JENSEN
A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das Micobactérias;
FUNÇÃO
Isolamento primário das micobactérias;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR CITRATO SIMMONS
Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono;
Sais de amônia  alcalinizando o meio;
FUNÇÃO
Diferenciar gêneros e espécies de Enterobactérias e não fermentadores.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR BÍLE-ESCULINA
Capacidade de bactérias hidrolisarem esculina na presença  bile;
A esculina é um derivado glicosídico da cumarina;
A esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares;
As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS  crescem  presença de sais biliares;.
A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina;
A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro;
FUNÇÃO
Identificação dos Enterococcus spp., que são Bile-Esculina positiva;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR FENILALANINA
Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática;
FUNÇÃO 
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR TSI – TRIPLO AÇÚCAR FERRO
Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo);
 A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O
ágar fundido é deixado solidificar, formando uma superfície inclinada;
Essa configuração origina duas câmaras
de reação dentro do mesmo tubo;
A porção inclinada ou bico, exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico, é aeróbia. A porção inferior, denominada profundidade ou fundo, está protegida do ar e é relativamente anaeróbia;
FUNÇÃO
Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
TSI - LEITURA
Reações ápice/base:
Púrpura/amarelo = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativos);
Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açucares);
Presença de gás (CO²) = bolhas ou meio fragmentado;
H²S positivo = presença de precipitado negro;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR BASE URÉIA (CHRISTENSEN)
Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease;
Positivo  na alcalinização do meio;
Função 
BGN fermentadores e não fermentadores  Staphylococcus e Haemophilus.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PARA PROVA DE GELATINASE
Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que
liquefaz/hidrolisa gelatina;
FUNÇÃO 
Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PARA PROVA DE OXIDASE
O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria;
FUNÇÃO
Ajuda caracterizar espécies de Neisseria, distingui não fermentadores (oxidase positiva) de enterobactérias (oxidase negativa);
Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp.
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Interpretação
Oxidase positiva: roxo, bactéria não fermentadora;
Oxidase negativa: fermentadora, fazer testes bioquímicos (enterobactérias);
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PARA TESTE DE MOTILIDADE
A bactéria é móvel  flagelo;
Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos são móveis;
FUNÇÃO
Determinar se o microrganismo é o não móvel;
Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade);
MILI (Motilidade, Indol, Lisina);
MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactérias;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PARA PROVA DE TOLERÂNCIA AO NaCl 6,5%
A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns microrganismos crescerem em presença do sal;
Meio base utilizado é o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactérias; 
FUNÇÃO
Separa Enterococcus spp., que são NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que são NaCl 6,5% negativos;
Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR MUELLER HINTON
Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das principais bactérias;
FUNÇÃO
Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de difusão em disco e E-test para enterobactérias;
Não fermentadores, Staphylococcus sp e Enterococcus sp.
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Intepretação de entebactérias
Identificação das enterobactérias
Meios IAL ou Rugai
Ápice
LTD: reação positiva = verde garrafa;
Sacarose fermentação: reação positiva = amarelo.
Base
Glicose fermentação: reação positiva = amarelo;
Produção de gás: reação positiva = formação de bolhas;
Hidrólise da uréia: ração positiva = azul intenso;
H2S (gás sulfidríco): reação positiva = negra.
Fundo
Lisina: reação positiva = qualquer cor diferente de amarelo; Reação negativa = amarelo;
Mobilidade: reação positiva = turvação do meio e ou qualquer crescimento além da picada ou arrebentamento do meio.
Tampa
Indol: reação positiva = rosa ou vermelha após a adição do reagente de Kovacs.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
Kit EPM-MILI
Tubo EPM: após o inóculo, a tampa deve fica um pouco frouxa.
Provas
Glicose: prova positiva = base do tubo amarela;
H2S: prova positiva = cor negra.
Tubo MILI: após o inóculo, sua tampa deve ser bem fechada.
Provas
Mobilidade: reação positiva = crescimento para todos os lados;
Indol: reação positiva = negra;
Lisina: as enterobactérias capazes de descarboxilar a lisina presente no meio, primeiro descarboxila a glicose, onde reação positiva = qualquer cor diferente do amarelo; Reação negativo = amarelo claro.
Uréia: reação positiva = alcaliniza a base do tubo provocando viragem do indicador para azul.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
Prova do VM: testa a capacidade da bactéria em produzir ácidos orgânicos a partir da fermentação da glicose. Leitura 48 – 72 horas.
VM: reação positiva = coloração avermelhada.
	
Prova do VP: as bactérias utilizam à glicose presente no meio liberando um produto que é a acetoína.
VP: reação positiva: turvação.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
TSI
Verifica se a bactéria degrada carboidratos específicos incorporados ao meiocom ou sem produção de gás.
Gás: positivo = formação de bolhas;
H2S: positivo = negra.
Resultados
Vermelho o ápice: fermentação apenas da glicose, lactose e sacarose negativa a base é amarela.
Amarelo o ápice: fermentação da glicose, lactose e ou sacarose a base é amarela.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
Caldo indol-uréia
Esse caldo tem por finalidade diferenciar as enterobactérias com base na capacidade de produção de indol e de hidrólse da uréia.
Interpretação dos resultados
Uréia positiva: reação alcalina = vermelha;
Uréia negativa = amarelo.
Indol: reação positiva = anel avermelhado;
 Indol negativo = ausência de cor avermelhada.
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Testes necessários para a identificação de rotina dos BNFs
Tubo de OFglicose (com vaselina);
Oxidase;
PYR;
Lisina;
Arginina;
TSB para motilidade em lâmina;
Indol;
Esculina;
Disco de polimixina;
Tubo com TSI;
Placa de Mac Conkey;
Tubo com gelatina;
DNAse;
Tubo com caldo NaCl 6,5%
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COLORAÇÕES 
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Colorações diferenciais 
Reage de modo distinto em diferentes bactérias;
Servem para diferenciar as bactérias;
Ex.: Gram e BAAR;
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BAAR
BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO-RESISTENTES;
Coram fracamente pelo gram;
Ácido micólico de parede;
Circundados por uma parede celular hidrofóbica;
Resistem a descoloração; 
Misturas de álcool-ácido usadas na identificação;
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Coloração para cápsula
Chamada coloração negativa;
Método difícil;
Durante o procedimento  lavagem retira cápsula;
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Coloração para cápsula
Cápsulas geralmente não aceitam corantes biológicos;
Tinta nanquim;
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Coloração de esporos 
Verde malaquita  corante primário;
Lavagem;
Safranina  cora o restante da bactéria;
Bactéria  verde e rosa;
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Coloração dos flagelos 
Estruturas muitos pequenas;
Procedimento delicado para coloração;
Usa-se mordente e carbolfucsina;
Aumenta o diâmetro dos flagelos  visível ao microscópio óptico;
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Recomendações 
Toda amostra é potencialmente contaminada;
Manipulação de material biológico  EPI;
Procedimento com risco com respingos  cabine de segurança;
Não pipetar com a boca;
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Recomendações 
Não reencapar agulhas;
Descartar em recipiente adequado;
Material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte;
Determinar área limpa e contaminada;
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Recomendações 
Limpar e desinfetar todas as áreas de trabalho;
Manter bancadas organizadas;
Não estocar material contaminado;
Tirar jaleco quando sair do setor;
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Recomendações 
Lavar as mãos sempre;
Separar materiais em sacos de lixo;
Todos os reagentes identificados;
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Recomendações 
Ter manual de procedimento;
Estocar inflamáveis  local adequado;
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Acidentes 
Sempre pedir ajuda;
Não omitir fatos;
Material biológico  superfície  hipoclorito 2%;
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Acidentes 
Material biológico  pele  sabão e álcool 70%;
Material biológico no jaleco  lavagem;