07 - Enzimas

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Enzimas
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Vagalume
Enzima luciferase quebra a proteína luciferina na presença de ATP
Louis Pasteur (1850)
Açúcar  álcool catalisada por “fermentos”;
Fermentos = Enzimas  separáveis da estrutura das células de levedo.
Eduard Buchner (1897)
Extratos de levedos  açúcar até álcool  enzimas funcionavam mesmo quando removidas da estrutura celular.
Histórico
James Summer (1926)
Isolou e cristalizou a urease  avanço nas propriedades específicas das enzimas;
Cristais de urease  proteínas;
Todas as enzimas são proteínas.
 John Northrop e seus colegas (1930)
Cristalizaram a pepsina e tripsina bovinas  proteínas.
Histórico
J. B. Haldane (1930)
Tratado intitulado “Enzimas”;
Ligações fracas entre enzima e substrato  distorce a molécula do substrato e catalisa a reação.
Século XX
Pesquisas  reações do metabolismo celular;
Purificação, elucidação da estrutura molecular, mecanismo químico e compreensão geral.
Histórico
Quase todas as reações bioquímicas são catalisadas por enzimas
Com exceção de poucas moléculas de RNA que apresentam atividade catalítica, todas as enzimas são proteínas
Algumas requerem grupos não proteicos para sua atividade catalítica
Enzimas características
Reduzem a energia de ativação
Altamente eficientes: aceleram a velocidade das reações  108 a 1011 vezes;
Alto grau de especificidade
Mecanismo “turnover”: desempenha funções consecutivas;
Enzimas características
Cofatores
Algumas enzimas não requerem nada além dos seus resíduos de aminoácidos
Outras requerem cofatores 
Íons inorgânicos como Fe2+, Mg2+, Mn2+ , etc
Coenzimas
Molécula orgânica necessária ao funcionamento da enzima
Muitas derivados de vitaminas são coenzimas
Aceptores/doadores de átomos ou grupos funcionais;
Catálise: coenzima + substrato = alojados no centro ativo;
Encontra-se ligada à enzima
Coenzimas
Holoenzima: Enzimas conjugadas, formadas por apoenzima (porção proteica) e coenzima (porção não proteíca)
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 A maioria das vitaminas hidrossolúveis são componentes de sistemas de enzima essenciais. Várias estão envolvidas em reações de manutenção do metabolismo energético. 
Vitaminas são coenzimas
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Origem do termo vitamina 
Em 1911, um jovem químico do Lister Institute de Londres, Casimir Funk, isolou, do farelo de arroz, uma substância cristalizada que possuía uma função amina. Como essa substância se revelou capaz de prevenir e de curar o “beribéri” experimental, Funk criou o termo “vitamina”, para salientar que essa amina era indispensável à vida. 
Composta de carbono, hidrogênio e o oxigênio, possuem estrutura variada e de acordo com sua solubilidade se dividem Lipossolúveis e Hidrossolúveis. 
Lipossolúveis são: A (Retinol), D (Calciferol), E (Tocoferol) e K (Menaquinona)
Hidrossolúveis são: B1(Tiamina), B2 (Riboflavina), B6 (Piridoxina), B12 (Cianocobalamina) e Vitamina C (Ácido Ascórbico) as principais, sendo importantes também Niacina, Ácido Fólico, Biotina, Ácido Pantotênico, Colina. 
Vitamina 
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Ascorbic acid is a reducing agent (an antioxidant)
B series are components of coenzymes,
Must be modified before they can serve their functions
Structure of some water-soluble vitamins 
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As duas formas biologicamente ativas são a flavina mononucleotídeo (FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD), formadas pela transferência de um AMP do ATP à FMN. A FMN e FAD são capazes de aceitar reversivelmente dois átomos de hidrogênio, formando a FMNH2 ou FADH2. A FMN e FAD estão ligadas fortemente a flavoenzimas que catalisam a oxidação ou redução de um substrato. 
As formas de coenzima biologicamente ativa são a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) e seu derivado fosforilado, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+). O NAD+ e NADP+ servem como coenzimas nas reações de oxidação-redução nas quais a coenzima sofre redução do anel piridina para aceitar um íon hidreto (átomo de hidrogênio mais um elétron). As formas reduzidas do NAD+ e NADP+ são o NADH e NADPH, respectivamente. 
Componente da coenzima A, que tem papel importante na oxidação e síntese de acidos graxos
A importância das vitaminas no metabolismo celular
biocatalisadoras - diminuem a energia para que ocorra a reação
alta especificidade- reagem com o substrato, sem desgaste da enzima
sítios ativos – local da enzima onde ocorre a reação com o substrato 
produtos
 ENZIMA
 substrato
 sítios ativos
 PEPSINA
 proteína
 alta especificidade 
 peptídeos - catabolismo
Enzimas
Enzimas são nomeadas pelo sufixo “ase” ao seu substrato ou a palavra que descreve sua atividade
Transferases => reações de transferencias
Hidrolases => Reações de hidrólise
DNA polimerase => Reação de polimerização do DNA
Celulase => hidrólise de celulose
Nomenclatura
Reações não catalisadas tendem a ser lentas – muitas moléculas biológicas são bastante estáveis no ambiente intracelular
Sem catálise, as reações necessárias para digestão, contração muscular ou envio de impulsos nervosos não ocorreria em velocidade útil
Funcionamento das enzimas
O sítio ativo da enzima é contornado por resíduos de aminoácidos cujos grupos substituintes se ligam ao substrato e catalisam sua transformação
Funcionamento das enzimas
Ação das Enzimas
Especificidade: Interagem com um ou poucos substratos e catalisam poucos tipos de reação
Cofatores: São colaboradores não protéicos necessários para a atividade da enzima. Podem ser íons metálicos (Zn, Fe) ou moléculas orgânicas (vindos em geral de vitaminas como NAD+, FAD coenzima A)
	
Regulação: Enzimas podem ser ativadas ou inibidas de modo que a velocidade de formação do produto é adequado para o momento. 
Enzimas
região específica da superfície 
Constituída por grupos R de aminoácidos;
Confere especificidade à catalise enzimática.
Atividade catalítica – Sítio ativo
Emil Fischer (1894): “chave e fechadura”
Enzimas eram complementares ao tamanho, forma e natureza química do substrato;
“Chave e fechadura”  pouco eficiente!
Modelos de enzima e substrato
Koshland (1958): encaixe induzido
Altera o balanço de forças  nova conformação;
Substrato: conformação tensionada e distorcida.
Modelos de enzima e substrato
A enzima não é gasta durante o processo
Enzimas diminuem a energia de ativação
Catalisador:  velocidade da reação  NÃO afetam o equilíbrio.
Diagrama de coordenadas da reação:
Catalisadores aumentam a velocidade da reação diminuindo a energia de ativação
Os grupos funcionais catalíticos das enzimas reagem com o substrato => diminuição da energia de ativação das reações
Formação do complexo ES
Enzimas diminuem a energia de ativação
Existe uma barreira entre S e P que representa a energia necessária para o alinhamento dos grupos químicos reagentes, rearranjo de ligações, etc
As moléculas de substrato precisam ser excitadas até um nível maior de energia
Uma reação com vários passos, a velocidade total da reação é determinada pelo passo de maior energia de ativação
Valores de aumentos de velocidade de reações catalisadas por enzimas
A enzima é complementar ao estado de transição
As interações entre a enzima e substrato ocorrem no estado de transição
Baixa [S]
Velocidade é proporcional a [S]
Velocidade independe da [S]
Alta [S] excesso de S
As enzimas podem ficar saturadas pelo substrato
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É numericamente igual a [substrato] na qual a velocidade da reação é metade da Vmax
Característico de cada enzima
Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato
A velocidade máxima da reação (Vmax) será atingida quando quase todas as moléculas de enzima estiverem na forma do complexo ES. 
constantes de velocidade
Equação de Michaelis-Menten
V0 ou
V máx
[S]
Vo
Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimatica-mente e com um único substrato
Relação quantitativa entre a velocidade inicial (V0), a velocidade máxima (Vmax), [S], todas relacionadas pelo Km. 
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Quando V0 é metade da Vmax
O Km é equivalente à concentração de substrato onde V0 é igual à metade de Vmax 
Km
Afinidade da enzima pelo substrato
Km
Afinidade da enzima pelo substrato
Significa que...
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Sinergismo
Fatores que afetam a velocidade de reações enzimáticas
Fatores envolvendo componentes da reação
Concentração do substrato
Concentração da enzima
Fatores externos
pH
Temperatura
Presença de inibidores
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 Condições fixas de:
 - temperatura
 - [substrato]
 - [enzima]
Cada enzima tem seu pH ótimo
Veloc.
pH ótimo
Influência do pH na atividade enzimática
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Inibição Enzimática
Inibidores enzimáticos são agentes que interferem na catálise, diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas.
Inibidores enzimáticos são importantes agentes fármacos
Aspirina – inibe a enzima que catalisa o primeiro passo na síntese de prostaglandinas (compostos que produzem sensação de dor)
Quanto ao tipo:
competitiva
não-competitiva
 inibidor  a atividade de uma 
		 única enzima ou de um grupo 
		 restrito de enzimas
 irreversível
 reversível
inibidor  a atividade de todas as enzimas 
ex: agentes desnaturantes
inespecífica -
específica -
Inibição Enzimática
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Inibição Enzimática Reversível
inibidor forma com a enzima um composto instável
inibição NÃO envolve modificação covalente 
Tipos de inibidores reversíveis:
Competitivos
Não competitivos
Inibição Enzimática Irreversível
 inibidor se liga à enzima formando um complexo estável
 forma-se uma ligação covalente entre o inibidor e a enzima
COMPETITIVA: inibidor liga reversivelmente à enzima e compete com o substrato pelo sítio ativo. Formação do complexo EI que afetam negativamente a eficiência da enzima. 
NÃO COMPETITIVA: Inibidor e substrato ligam-se em locais diferentes da enzima. O inibidor pode ligar-se a enzima livre ou ao ES, impedindo a reação.
Inibição Enzimática Reversível
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Inibição Enzimática
50
Inibidor competitivo
	Estrutura semelhante à do substrato
 Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima
Inibição Reversível Competitiva
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 [substrato] necessária para que a enzima funcione normalmente
afinidade da enzima pelo substrato
Km da enzima
aparente
Inibição Reversível Competitiva
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Inibição Reversível Competitiva
Usada para tratar pacientes envenenados por metanol
Álcool desidrogenase: metanol formoldeído (metanal) 
Tóxico.
Cegueira – olhos são sensíveis ao formol
Etanol compete com metanol como substrato para enzima
 Álcool desidrogenase: etanol acetaldeído (etanal) 
Inibição Reversível Competitiva
Inibidor incompetitivo
NÃO se liga ao sítio ativo da enzima 
Inibição Reversível Incompetitiva
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Inibidor não tem semelhança estrutural com o substrato 
NÃO se liga no sítio ativo da enzima
Liga-se ao complexo ES
Aumento da [substrato] não diminui a inibição 
Km da enzima NÃO se altera
A VELOCIDADE máxima DIMINUI na presença do inibidor
Inibição Reversível Incompetitiva
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Diminui a concentração 
de enzima ativa
Velocidade Máxima 
 da Reação
Inibição Reversível Incompetitiva
57
Inibição Reversível Incompetitiva
58
Inibição Reversível Mista
Não se liga ao sítio ativo da enzima
Pode ligar-se tanto ao complexo ES quanto a E
Inibição Reversível Mista
Inibidor misto
	Não se liga ao sítio ativo da enzima
 Liga-se tanto a E quanto ao complexo ES 
Podem ser inibidas reversivelmente por inibidores competitivos que competem pelo sítio ativo da enzima, mas não são transformados pela enzima
Inibidores competitivos competem com o substrato pelo sítio ativo da enzima
Inibidores não competitivos ligam-se ao complexo ES e não se ligam ao sítio ativo da enzima
Quando o inibidor liga-se a enzima ou ao complexo ES, a inibição é dita mista
Inibição Reversível
Combinam-se com um grupo funcional da enzima
Destroem
Formam ligação covalente muito estável
Enzimas podem ser inativadas por modificações irreversíveis de um grupo funcional essencial para a atividade catalítica
Inibição Irreversível
Inibição Irreversível
Quimotripsina + DIFP inibe irreversivelmente a enzima
Enzimas alostéricas apresentam diferentes conformações induzidas por reguladores
Enzimas Alostéricas
Enzimas reguladoras determinam a velocidade de toda uma sequência metabólica, pois catalisa a reação mais lenta
Enzimas alostéricas que funcionam por meio de moduladores alostéricos
 Enzimas reguladas por meio de uma ligação covalente reversível
Enzimas Alostéricas
Enzimas alostéricas são geralmente maiores e mais complexas 
Em alguns sistemas multienzimáticos, a enzima reguladora é inibida pelo produto final da via metabólica em altas concentrações
Maioria das enzimas segue o padrão michaeliano, entretanto a maioria das enzimas reguladoras são alostéricas
Enzimas alostéricas possuem comportamento sigmoidal
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Allosteric enzyme kinetics
Sigmoidal dependence of V0 on [S], not Michaelis-Menten
Enzymes have multiple subunits
and multiple active sites
Substrate binding may be cooperative
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LIGAÇÃO ALOSTÉRICA: efetores (reguladores) ligam não covalentemente em local que não o sítio ativo, alterando afinidade da enzima pelo substrato e/ou a atividade catalítica. Efetores negativos e positivos
MODIFICAÇÃO COVALENTE: adição ou remoção de grupos fosfato de resíduos específicos de serina, treonina e tirosina.
Fosforilação e desfosforilação
Quinases e Fosfatases
Indução ou repressão da síntese
Leva horas para ocorrer aumento. Comum em enzimas de uso específico em uma fase ou momento (não constitutivas).
Regulação da atividade enzimática
Exemplos de modificações covalentes de enzimas
Regulação da atividade de glicogênio fosforilase .
Forma mais ativa (a)- resíduo de Ser fosforilado
Forma menos ativa (b)- Resíduos defosforilados 
Glicose -1-fosfato pode ser usada para síntese de ATP no músculo ou convertida em glicose livre no musculo
Precursos inativo zimogênio é hidrolisado para formar a forma ativa
Ex: Enzimas hidrolíticas do estômago e intestino
Tripsinogênio tripsina
Quimotripsinogênio quimotripsina 
Regulação enzimática por proteólise do precursor enzimático
Questões
Conceitue Km.
Quais os tipos de inibição enzimática
O que são enzimas alostéricas?