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ENZIMAS Profa Fatima Ventura Pereira Meirelles PONTO DE VISTA BIOLÓGICO/BIOQUÍMICO moléculas que permitem que as reações metabólicas ocorram a uma velocidade apreciável. PROTEÍNAS RNA ENZIMAS: DEFINIÇÃO PONTO DE VISTA TECNOLÓGICO catalisadores de processos de transformação de matérias primas em produtos úteis. ENZIMAS: DEFINIÇÃO VANTAGENS CATÁLISE ENZIMÁTICA Altas taxas de reações: 106 - 1012 vezes maior que a reação não catalisada Condições de operação brandas: - T baixas (< 100ºC); - Patm; - pH neutro • Grande especificidade: em relação a S e P • Geram poucos subprodutos • São catalisadores quirais • Podem ser imobilizadas para realização de processos contínuos e eficientes Biblioteca de proteínas E E S ES + ES Emil Fischer - Modelo da chave -fechadura Capacidade de regulação: - da atividade da enzima pela [S] e/ou [P]; pela [efetores] (geralmente alostéricos); por modificação covalente propriedades cinéticas das enzimas (pH, T, ...) - da quantidade de enzima síntese/degradação Enzimas não dirigem reações . Elas permitem que reações favoráveis ocorram mais rapidamente. VANTAGENS CATÁLISE ENZIMÁTICA LIMITAÇÕES CATÁLISE ENZIMÁTICA Nem todas as reações podem ser catalisadas enzimaticamente O catalisador é sensível a variações nas condições (pH, T,...) experimentais, exceto aquele provenientes de organismos extremófilos/adaptados è ENERGIA DE ATIVAÇÃO Ex: glicose CO2 e H2O G’< 0 (-686.000 cal/mol) instável (termodinamicamente) estável (cineticamente) v = f (nº de moléculas que alcançam o estado intermediário / unidade de tempo è ENERGIA DE ATIVAÇÃO Em sistemas biológicos T cte Ea (enzimas) Enzimas não alteram o G’ ou a K’eq, apenas a velocidade. Assim: No equilíbrio ][][ 11 PKvSKv rf K P S K K eq' [ ] [ ] 1 1 Na presença da Enzima, K1 e K-1 aumentam na mesma proporção de modo que K’eq e G’= cte. Enzimas não dirigem reações . Elas permitem que reações favoráveis ocorram mais rapidamente pelo abaixamento da energia de ativação LIPASE: O SÍTIO ATIVO Estrutura tridimensional do sítio ativo da lipase de P.aeruginosa (modelo proposto por Noble e col, 1993). Em destaque observa-se a posição da tampa constituída pela -hélice e do sítio ativo da enzima: SER82; HIS251; ASP229 (reproduzido de Jaeger e col., 1994). Esquema representativo das conformações “fechada” (A) e “aberta” (B) da lipase de Rhizomucor miehei adaptado de Jääskeläinen et al. (1998). ENZIMAS: MODO DE AÇÃO – ENCAIXE INDUZIDO CO-FATORES • Algumas enzimas requerem co-fatores • Grupamentos funcionais que participam da catálise enzimática. Podem ser: Co-enzimas Grupos prostéticos transitoriamente permanentemente associados à enzima associados à enzima são regenerados na podem ser regenerados em própria reação* reações paralelas ou acopladas * Exceto NAD+ (pode ser regenerado por outras reações) HOLOENZIMA = APOENZIMA+ COFATOR (ativa) (inativa) OBS : Muitas VITAMINAS, solúveis em água, são precursores destas moléculas e devem ser ingeridas pois o organismo não pode sintetizar. CLASSIFICAÇÃO INTERNACIONAL DAS ENZIMAS (nome das classes, números de códigos e tipos de reações catalisadas) 1 - Óxido redutases (reações de óxido-redução) 1.1. Agindo em > CH - OH 1.2. Agindo em > C = O 1.3. Agindo em > C = CH 1.4. Agindo em > CH - NH2 1.5. Agindo em > CH - NH - 1.6. Agindo em NADH;NADPH 2. Transferases (transferência de grupos funcionais) 2.1. Grupos de C 2.2. Grupos aldeídicos ou cetônicos 2.3. Grupos acila 2.4. Grupo glicosila 2.5. Grupo fosfato 2.6. Grupo contendo S 3. Hidrolases (reações de hidrólise) 3.1. Ésteres 3.2. Ligações glicosídicas 3.3. Éter 3.4. Ligações peptídicas 3.5. Anidridos ácidos 4. Liases (adição a duplas ligações - eliminação de grupos para formar duplas) 4.1. >C = C< 4.2. > C = O 4.3. > C = N 5. Isomerases (reações de isomerização) 5.1. Racemases e epimerases 5.2. Cis-trans isomerases 5.3. Oxidoredutase intramolecular 5.4. Transferase intramolecular 6. Ligases (formação de ligação com desdobramento do ATP) 6.1. C - O 6.2. C - S 6.3. C - N 6.4. C - C Ex: peptidil-L amino acido hidrolase/ Carboxipeptidase A ( EC.3.4.17.1) EC = Enzyme Commission 3 - hidrolase 4 - subclasse (C – N ) 17 - subclasse - metalocarboxipeptidase (Zn2+) 1 - número de série (arbitrário) Grande especificidade: em relação a S e P ESPECIFICIDADE: Alta Absoluta glicose glicose 6P frutose frutose 6P Hexoquinase manose manose 6P Glicose glicose 6P hexoquinase glicoquinase 1 E : 3 S 1S : 2E VANTAGENS CATÁLISE ENZIMÁTICA ESPECIFICIDADE SELETIVIDADE x ESPECIFICIDADE (Ader et al, 1997: Methods in Enzymology 286,351-386) VANTAGENS CATÁLISE ENZIMÁTICA ESPECIFICIDADE R O O O R O O R O R O O OH O R O R O O O R O OH OH OH O R O OH O R O OH OH OH OH LIPASE RE > 90% - 1,3 específica 70 < RE< 90% - 1,3 seletiva RE< 70% - não específica Em determinadas condições as proporções entre os diferentes produtos é variada RE = excesso regioisomérico (%r.e) = % 1,3 DAG - % 1,2 DAG = % 1(3) MAG - % 2 MAG Nomenclature Enzyme Names EC Number Common/ Recommended Name Systematic Name Synonyms CAS Registry Number Isolation & Preparation Purification Cloned Renatured Crystallization Reaction & Specificity Pathway Catalysed Reaction Reaction Type Natural Substrates and Products Substrates and Products Substrates Natural Substrate Products Natural Product Inhibitors Cofactors Metals/Ions Activating Compounds Ligands Functional Parameters Km Value Ki Value Turnover Number Specific Activity pH Optimum pH Range Temperature Optimum Temperature Range Disease & References Disease References Stability pH Stability Temperature Stability General Stability Organic Solvent Stability Oxidation Stability Storage Stability Enzyme Structure Sequence/ SwissProt link 3D-Structure/ PDB link Molecular Weight Subunits Posttranslational Modification Application & Engineering Engineering Application mailto:c.ebeling@uni-koeln.deWebmaster: Christian Ebeling - ENZIMAS - Curva de Progresso (diferentes S e E), curva de v x [E] e v x t, - CINÉTICA ENZIMÁTICA: Equação de Michaelis- Menten, curva de v x [S] , gráfico de Lineweaver- Burk, Importância do Km. Ordem de Reação, - ENZIMAS: Inibição, grau de inibição NO QUADRO CATÁLISE ENZIMÁTICA EQUAÇÃO DA VELOCIDADE ESTADO ESTACIONÁRIO (DEDUÇÃO NO QUADRO) ES é praticamente constante ao longo do tempo: d[ES]=0 dt vf (ES) = vd (ES) k1[E].[S] = (k-1 + kp) [ES] ou seja = [E].[S] = (k-1+ kp) = KM = [E].[S] ou [ES] = [E][S] ’ [ES] k1 [ES] KM Considerando que v = Kp [ES] [E]t = [E] + [ES] Vmax = Kp [E]t Substituindo [ES] ’ em V, dividindo ambos os lados por [E]t tem-se que v = Kp [S] [E]t KM + [S] Substituindo Vmax tem-se que v = Vmax [S] KM + [S] k1 kp E + S ESE + P k-1 • ESTADO ESTACIONÁRIO (DEDUÇÃO NO QUADRO) v = Vmax [S] KM + [S] k1 kp E + S ES E + P k-1 v Vmax Vmax/2 KM [S] EQUAÇÃO DA VELOCIDADE Invertendo a equação de Michaelis Menten: 1 = KM + 1 1/v v Vmax Vmax 1/ Vmax Lineweaver Burk k1 kp E + S ES E + P k-1 - 1/KM 1/[S] KM [S] v Ordem 1 Ordem 0 EQUAÇÃO DA VELOCIDADE KM • estabelece valor aproximado para o nível de S intracelular (é improvável que este nível seja >> ou << que KM) A: Se [S] >> KM v1 ([S] = KM) = Vmax /2 v2 ([S] = 1000 KM) * 1 Vmax v não pode exceder Vmax, não justifica o aumento [S] B: Se [S] << KM v seria muito sensível à variação de S e a maior parte do potencial enzimático seria desperdiçada. v seria << Vmax • KM é característico para cada enzima / substrato * permite a comparação de diferentes tecidos e organismos • Variação do KM permite alterar o modo de regulação de uma enzima (diferentes valores “in vivo” e “in vitro”) • Se conhecemos o KM podemos ajustar as condições para determinação do Vmax e conseqüentemente da [E], conhecido o Kp • Indica a ADEQUACIDADE entre S e E. S com baixo KM tem alta afinidade pela enzima e S com alto KM tem baixa afinidade pela enzima. ligação do I impede a ligação do S ligação de S e I são mutuamente excludentes E + S ES E + P + I EI v Vmax Vmax/2 KM Kmap [S] - 1/KM - 1/Kmap 1/[S] 1/v 1/Vmax v = Vmax [S] KMap + [S] Onde KMap = KM [1+ ([i]/ki)] INIBIÇÃO COMPETITIVA INIBIÇÃO COMPETITIVA - ligação do I impede a ligação do S - ligação de S e I são mutuamente excludentes • S e I competem pelo mesmo sítio (A) • OU ligação de I impede a ligação de S (em sítios não necessariamente iguais) COM MUDANÇA CONFORMACIONAL (B) SEM MUDANÇA CONFORMACIONAL (C) I S C B A não tem efeito na ligação do S E se liga tanto ao S quanto ao I sendo ESI incapaz de gerar P, o nível de ES no equilíbrio diminui pois existirá sempre alguma E na forma de ESI. É como se existisse menos enzima presente E + S ES E + P + + i I EI + S ESI - 1/KM 1/[S] 1/v 1/Vmaxap v Vmax Vmaxap Vmax/2 Vmax/2 KM [S] INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA v = Vmaxap [S] KM + [S] Onde Vmaxap = Vmax / [1+ ([i]/ki)] _ I se liga irreversivelmente à ES, formando ESI inativo _ A presença de ESI desloca a reação E + S ES para a direita, de modo que KM diminui E + S ES E + P + I ESI - 1/KMap - 1/KM 1/[S] 1/v 1/Vmaxap 1/Vmax v Vmax Vmaxap Vmax/2 Vmax/2 KM ap KM [S] INIBIÇÃO ACOMPETITIVA v = Vmaxap [S] onde KMap + [S] Vmaxap = Vmax / [1+ ([i]/ki)] KMap = KM / [1+ ([i]/ki)] Vm T Vm2 Vm1 1 1 T2 T1 Vm Tótima T Altera a constante de velocidade da reação Kp Equação de Arrhenius: Kp = F. e-A/RT onde F = cte, A = energia de ativação, T = temperatura absoluta e R = cte dos gases EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA Vm = Kp.Et Vm = F. Et. e-A/RT F.Et = G = cte T aumenta a Vm exponencialmente lnVm = -A . 1 + ln G R T Para cada T temos: lnVm2 = -A . 1 + ln G R T2 Vm2 lnVm1 = -A . 1 + ln G R T1 Subtraindo: lnVm2 = - A . 1 - 1 Vm R T1 T2 No caso das enzimas, o aumento da T leva à desnaturação. Admitindo que altere, apenas o fator G se modifica, EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 0 20 40 60 80 100 120 10 30 50 70 Lip ase (% ) Temperatura (ºC) 0 20 40 60 80 100 120 0 100 200 300 Ati vid ad e ( %) tempo (min) 22 30 37 45 55 EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA VER GRÁFICOS SEMELHANTES NOS ARTIGOS EM ANEXO (EAD) • Sobre a estrutura da enzima: faixas extremas desnaturação/inativação faixas intermediárias protonação e desprotonação da enzima. • Sobre a catálise: Uma vez que tanto a enzima quanto o substrato podem conter grupamentos ionizáveis, o pH pode influenciar na interação entre tais grupamentos e consequentemente na catálise. Ex: Enzima E tem no centro catalítico grupamento com pK = 6,0, substrato S tem grupamento ionizável com pK = 4,0: EH E- EH E- ativa 4 5 6 SH+ S- SH+ S S real De acordo com o esquema: A atividade será máxima em pH 5,0 • A possibilidade de existir mais de 1 grupamento ionizável dificulta a previsão do perfil de v x pH. • A estabilidade da enzima em relação ao pH depende de vários fatores, entre elee, podemos citar: Temperatura, força iônica, natureza do tampão, presença de conservantes e/ou íons contaminantes, [S] e/ou cofatores, [E] EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 40 Ati vid ad e (% ) tempo (min) FOSFATO 7 FOSFATO 8 TRIS 8 TRIS 9 CHES 9 CHES 10 0 20 40 60 80 100 120 1 3 5 7 9 11 Ati vid ad e ( %) pH CITRATO FOSFATO TRIS CHES EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA EFEITO DO pH NA ATIVIDADE E NA ESTABILIDADE ENZIMÁTICA VER GRÁFICOS SEMELHANTES NOS ARTIGOS EM ANEXO (EAD) FONTES DE ENZIMAS INDUSTRIAIS VEGETAIS Papaína - protease extraída do mamão e utilizada nos processos de amaciamento de carnes. Bromelina - protease extraída do abacaxi e utilizada nos processos de amaciamento de carnes. ou malto-amilase - enzima extraída a partir do grão de cevada germinado e utilizada nas indústrias cervejeiras, panificadora e de alimentos em geral. Desvantagem: a produção de uma quantidade relativamente pequena de enzima requer o cultivo de uma grande quantidade de plantas o processo industrialsó é economicamente viável em países onde os custos operacionais e da terra não sejam altos. • ANIMAIS Renina - obtida a partir da mucosa estomacal de bezerros e utilizada na manufatura de queijos. Pancreatina - obtida, em geral, do pâncreas suíno e usada no tratamento do couro, na hidrólise das proteínas do soro do queijo e na síntese de peptídeos. Pepsina - geralmente obtida do estômago do porco. Catalase - enzima obtida a partir do fígado bovino ou suíno, usada na remoção de H2O2 do leite. Desvantagem: Estas enzimas são obtidas em geral, a partir de subprodutos da indústria de carne, tendo portanto suprimento limitado no mercado. FONTES DE ENZIMAS INDUSTRIAIS • MICROBIANAS Alguns exemplos são as enzimas que atuam sobre: Monossacarídeos Glicose oxidase Glicose isomerase Dissacarídeos Lactase Invertase Polissacarídeos Amilases Celulase Pectinases Proteínas Proteases Lipídeos Lipases FONTES DE ENZIMAS INDUSTRIAIS • MICROBIANAS Vantagens: grande variedade de funções catalíticas; baixo custo de manutenção do microrga-nismo; frquência regular (não é sazonal); facilmente produzido em grande escala; enzimas usualmente mais estáveis que suas equivalentes em plantas e animais menor tempo de geração; requerimentos nutricionais relativamente simples; obtenção de maiores quantidades por manipulação genética ou variação das condições de cultivo; ... FONTES DE ENZIMAS INDUSTRIAIS MERCADOS TRADICIONAIS INDÚSTRIAS - ADITIVOS/ CATALISADORES DE PROCESSO −alimentícia −de bebidas −de ração −agropecuária −de detergentes −química - polímeros/biocatálise − farmacêutica −oleoquímica −de papel −de couro − textil USO ANALÍTICO − kits diagnóstico − sensores enzimáticos USO CLÍNICO − agente antiinflamatório − tratamento de ferimentos − agente antibacteriano − Antineoplásicas SÍNTESE ENZIMÁTICA TERAPIA ENZIMÁTICA - substituir enzima ausente ou deficiente MEIO AMBIENTE ENZIMAS NA TDR (FERRAMENTAS): - isolamento e purificação de ácidos nucléicos - clivagem de DNA - união de fragmentos de DNA - reação em cadeia da polimerase - transformação e outros métodos de transferência gênica - seleção e isolamento de recombinantes - sondas de ácidos nucléicos e hibridização - sequenciamento de DNA - mutagênese sítio dirigida NOVOS MERCADOS SOLVAY ENZIMAS MILAR Natureza Organismo do Produto Produtor Proteases Protease alcalina Bacillus licheniformis Protease bacteriana de alta alcalinidade Bacillus alcalophilus Protease fungica Aspergillus oryzae Protease bacteriana neutra Bacillus amiloliquefaciens Sistema enzimático Bacillus amiloliquefaciens Protease vegetal Papaya Sistema enzimático α-Amilases α-Amilase bacteriana termoestable Bacillus licheniformis α-Amilase bacteriana Bacillus amililiquefaciens α-Amilase bacteriana fungica Arpergillus oryzae α-Amilase bacteriana fungica Arpergillus oryzae α-Amilase bacteriana Bacillus amiloliquefaciens Glucoamilases Glucomilase Aspergillus niger var Sistema enzimático Pectinases Pectinase fungica Aspergillus niger var Pectinase fungica Aspergillus niger var Sistema enzimático Pectinase fungica Aspergillus niger var Pectinase fungica Aspergillus niger var Sistema enzimático Sistema enzimático Sistema enzimático Coagulantes Sistema enzimático Mucor miehei Outras enzimas Glicose isomerase Microbacterium arborescen Glicose oxidase Aspergillus niger var Sistema enzimático Trichoderma resei β-Glucanas Bacillus amiloliquefaciens Lactase Klueoveromyces lactis Celulase Aspergillus niger var Lipase Microbianos varios Invertase Saccharomyces cerevicea Dextranas Chaetonium gracile Xilanase Microbianos varios INDUSTRIAS: ADITIVOS/ CATALISADORES DE PROCESSO OPTIMASE 7,0 - 10 20 - 60 ºC OPTICLEAN 8,0 - 11,5 15 - 60 ºC FUNGAL PROTEASA 4,5 - 9,0 45 - 55 ºC HT PROTEOLÍTICO 6,5 - 9,0 30 - 55 ºC BEERZYME 6,5 - 9,0 30 - 55 ºC PAPAINA 3,5 - 9,0 10 - 90 ºC OPTIMASE PAG 6,0 - 10 15 - 60 ºC TAKATHERM 5,5 - 8,0 80 - 95 ºC TENASE 5,0 - 7,5 65 - 75 ºC FUNGAL AMILASA 4,0 - 6,0 45 - 55 ºC CLARASE 4,0 - 6,6 40 - 60 ºC TAKATEX 5,0 - 7,5 65 - 75 ºC DIAZYME 3,5 - 6,0 30 - 65 ºC DIAZYME GA-PU 4,5 - 6,0 30 - 65 ºC CLAREX 2,5 - 5,5 2 - 60 ºC REAREX 2,5 - 5,5 2 - 60 ºC MACEREX 3,0 - 5,5 10 - 60 ºC PECTINASE AT 2,5 - 5,5 37 - 60 ºC PECTINASE HPG 3,5 - 5,5 2 - 60 ºC TROPIMAX 2,5 - 5,5 20 - 60 ºC SUPEREX 3,0 - 5,5 10 - 60 ºC OLEOMAX 2,5 - 5,5 2 - 60 ºC MR 5,0 - 7,0 30 - 40 ºC TAKASWEET 6,5 - 8,0 55 - 65 ºC DEEO 3,5 - 7,5 20 - 70 ºC CELULASA 5,0 - 7,0 40 - 60 ºC GLUCANEX 6,0 - 7,0 50 - 70 ºC LACTASA GYNL 6,0 - 8,0 34 - 35 ºC CELULASA AC 3,5 - 7,0 25 - 60 ºC LIPASA 5,0 - 7,0 30 - 40 ºC INVERTASA 3,0 - 7,0 40 - 65 ºC DEXTRANASA 5,0 - 6,0 50 - 60 ºC XILANASA 4,8 - 8,0 30 - 60 ºC Pr od ut os L ác te os In dú st ria d e Al im en ta çã o Me di ci na Ál co ol In dú st ria A çu ca re ira In dú st ria P es qu ei ra Nome do Produto Fa ix a de P H Fa ix a de T em pe ra tu ra X ar op e de M ilh o Ce rv ej ar ia Pa ni fic aç ão Bi sc oi to s Vi nh os Pr oc es sa m en to d e Fr ut as e V er du ra s In dú st ria d o Pa pe l In dú st ria d e Co ur o Al im en ta çã o an im al De te rg en te s Te xt il Tr at am en to d e Ef lu en te s INDUSTRIAS: ADITIVOS/ CATALISADORES DE PROCESSO Enzima Modificação Novas Propriedades Lisozima T4 Isoleucina 3 por cisteína Aumento da termoestabilidade Tripsina Glicina 226 por alanina Mudança de especificidade Amilase Leucina 84 por triptofano Atividade reversa Enzima Microrganismo Companhia Renina (estômago de bezerros) Kluveromyces marxianus Aspergillus niger Escherichia coli Gist Brocades Genencor Pfizer Malto amilase (cevada) Bacillus subtilis Novo ENZIMAS: MUTAGENES SITIO DIRIGIDA ENZIMAS PRODUZIDAS POR TDR • Fontes de extremofílicos • Fundo de oceanos com altas pressões • Ambientes de alta concentração salina • Fontes termais • Exemplos − Lagoa quente, rica em S, que é convertido a ácido sulfúrico, por espécies de Archaea. – Lago hipersalino no Egito, rico em carbonato de sódio. O pH destas águas encontra-se na faixa de 10. Algumas Enzimas Termoestáveis de Interesse PROTEASES CELULASES QUITINASES ENZIMAS AMILOLÍTICAS XILANASES ENZIMAS DE ORGANISMOS EXTREMÓFILOS
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