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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁUNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁUNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁUNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BÁSICA CURSO DE MEDICINACURSO DE MEDICINACURSO DE MEDICINACURSO DE MEDICINA (BP335) MANUAL MANUAL MANUAL MANUAL TEÓRICOTEÓRICOTEÓRICOTEÓRICO----PRÁTICO DE PROCEDIMENTOS PRÁTICO DE PROCEDIMENTOS PRÁTICO DE PROCEDIMENTOS PRÁTICO DE PROCEDIMENTOS BÁSICOS EM MICROBIOLOGIA MÉDICABÁSICOS EM MICROBIOLOGIA MÉDICABÁSICOS EM MICROBIOLOGIA MÉDICABÁSICOS EM MICROBIOLOGIA MÉDICA 3ª EDIÇÃO REALIZAÇÃREALIZAÇÃREALIZAÇÃREALIZAÇÃOOOO ProfessorProfessorProfessorProfessoraaaa:::: Drª Cristina Leise Bastos Monteiro (Coordenadora) ProfessoraProfessoraProfessoraProfessora:::: Drª Laura Lúcia Cogo ProfessoraProfessoraProfessoraProfessora:::: Drª Izabel Galarda AcadêmicoAcadêmicoAcadêmicoAcadêmico:::: Fernando Carlos Bortolozzi Filho CURITIBA 2010 2 SUMÁRIOSUMÁRIOSUMÁRIOSUMÁRIO A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA E MICOLOGIA............................................................................... 3 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 5 CAPÍTULO 1: CONTROLE DE MICRORGANISMOS .............................................. 13 CAPÍTULO 2: TIPOS MORFOLÓGICOS DE BACTÉRIAS E GRUPAMENTOS BACTERIANOS............................................................................ 29 CAPÍTULO 3: MORFOLOGIA COLONIAL................................................................ 35 CAPÍTULO 4: VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE BACTÉRIAS NO AR E SUA CONTAGEM ATRAVÉS DE CULTIVO.............................................. 37 CAPÍTULO 5: PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS ................................................ 39 CAPÍTULO 6: MEIOS DE CULTURA........................................................................ 52 CAPÍTULO 7: ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS........................................... 55 CAPÍTULO 8: PROVAS BIOQUÍMICAS DIFERENCIAIS ......................................... 58 CAPÍTULO 9: MICROBIOTA NORMAL DO ORGANISMO HUMANO...................... 69 CAPÍTULO 10: DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ATRAVÉS DO ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE AGENTES ETIOLÓGICOS .................... 79 - PORÇÕES SUPERFICIAIS E PROFUNDAS.......................................................... 79 - OROFARINGE ........................................................................................................ 88 - TRATO GÊNITO URINÁRIO................................................................................. 106 - INTESTINAIS ........................................................................................................ 113 - FEBRE TIFÓIDE E PARATIFÓIDE ....................................................................... 126 - TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS .............................................. 131 CAPÍTULO 11: DOENÇAS SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS........................... 136 CAPÍTULO 12: MICOBACTERIOSES .................................................................... 152 CAPÍTULO 13: LEPTOSPIROSE ........................................................................... 170 CAPÍTULO 14: OS FUNGOS E AS MICOSES....................................................... 178 CAPÍTULO 15: HERPES-VÍRUS ............................................................................ 199 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 204 3 A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE A SEGURANÇA DOS ALUNOS NAS AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIABACTERIOLOGIABACTERIOLOGIABACTERIOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA “A segurança de todos depende dos cuidados individuais dos alunos e dos professores.” Seguem-se as orientações para os alunos executarem as tarefas dentro dos parâmetros de biosegurança médica: 1. É obrigatório o uso de avental (ou jaleco, guarda-pó, etc.) fechado na frente e de mangas compridas, para proteger a roupa e a pele dos braços. 2. É expressamente proibido comer, beber ou fumar dentro do laboratório. 3. Não usar anéis e pulseiras. 4. Prender o cabelo comprido. 5. Lavar as mãos antes e depois dos procedimentos. Após a lavagem das mãos utilizar álcool 70% para otimizar a desinfecção. 6. Evitar o contato da pele e mucosas com materiais clínicos tais como sangue, pus, escarro, fezes, urina, outras secreções e exsudatos. Tratar sempre todas as amostras como potencialmente infectantes, sendo que os maiores perigos estão relacionados com o vírus da hepatite B, HIV, bacilos da tuberculose e salmonelas. Observação: cada mL de sangue pode conter 100 milhões de vírus de hepatite B e uma só partícula provoca a hepatite. Caso ocorram respingos pelo material contaminado sobre a pele, fazer imediatamente a antissepsia do local. O avental respingado deve ser colocado em cartucho plástico para não contaminar outros objetos. 7. Não trabalhar nas proximidades de cadernos, mochilas e livros. As mochilas devem ser colocadas no fundo dos laboratórios no início das aulas práticas. 8. Só utilizar pipeta quando esta tiver mecha de algodão no bocal. A mecha tem dois objetivos: proteger o operador do risco de contaminação com material patológico ou culturas de microrganismos e preservar o material manipulado da contaminação pela saliva do operador (aerossóis). 9. Jamais colocar o tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a mesa. Durante os procedimentos o tampão deve ser segurado com o dedo mínimo. 4 10. Jamais colocar a pipeta usada sobre a bancada ou mesa de trabalho. Ela deve ser colocada em recipientes que contêm desinfetantes (Lisoform, hipoclorito de sódio a 2%, etc.), bem como algodão para vidro (para não quebrar a ponta da pipeta) disponível em cada mesa. 11. Evitar a formação de aerossóis, que são micropartículas que contém uma quantidade extremamente pequena de líquido (água, saliva, etc.) e algumas partículas infectantes (vírus, esporos bacterianos, etc.). Estes aerossóis podem cair sobre a mesa contaminando-a, ou ainda ficarem suspensos no ar e serem inalados, promovendo um possível ciclo de infecção. Tais partículas podem se formar em procedimentos como flambagem da alça metálica, flambagem de pinças, abertura brusca de tubos ou frascos com tampa de pressão, agitação de tubos com as mãos, centrifugação de tubos abertos, manipulação incorreta de seringas, homogeneizadores, etc. 12. Ao término do trabalho: a) Desinfetar a bancada com um desinfetante disponível (hipoclorito, álcool 70%, clorexedine, álcool iodado, etc.). b) Lavar as mãos e antebraços com água e sabonete líquido. Em seguida utilizar, de preferência, solução degermante à base de polivinilpirrolidona-iodo (PVPI) a 10%. Enxugar com toalha descartável. Em seguida aplicar álcool 70% nas mãos para dar continuidade à desinfecção. Observação: em caso de acidente, como de pipetas contaminadas, placas e frascos com material patológico ou cultura de microrganismos é obrigatório: a) Derramar sobre o material quebrado um desinfetante (por exemplo álcool 70% ou clorexedine). b) Cobrir comtoalha de papel. c) Deixar em contato, no mínimo, por uma hora antes de remover o vidro com uma pinça e com a mão enluvada absorver o líquido com papel toalha, acondicionar em sacos apropriados e a seguir autoclavar. ESTE MANUAL NÃO TEM FINS LUCRATIVOS USO PARA FINS ACADÊMICOS DENTRO DA UNIVERSIDADE (Concentrado de obras que não estão disponíveis nas bibliotecas da Universidade, por isso esse texto é disponibilizado aos alunos). 5 INTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO Micróbio: termo usado em 1878 por Charles Emmanocl Sedillot (cirurgião francês). Microbiologia: é a ciência que estuda os microrganismos (seres pequenos, geralmente microscópicos) e suas atividades. São os protozoários, fungos, algas, vírus e bactérias. Os microrganismos constituem um grande grupo heterogêneo, apresentando características variadas, tendo, no entanto, em comum o fato de conservarem ao longo do curso de evolução biológica, uma estrutura simples e indiferenciada, ou seja, possuem estrutura primitiva não apresentando tecidos ou órgãos especializados. O estudo dos microrganismos compreende o conhecimento de suas formas, estruturas, reprodução, metabolismo e identificação. Trata ainda da sua distribuição na natureza e as relações entre si e com os demais seres vivos. Estudam-se também as transformações físicas e químicas exercidas nos seus habitats, das quais resultam efeitos prejudiciais ou proveitosos para outros seres vivos. Em última análise os fenômenos chamados doenças infecciosas, do ponto de vista biológico, são simplesmente interações destrutivas entre vegetais e animais. A microbiologia pode ser estudada como ciência autônoma, mas também como instrumento de outras áreas biológicas. Foram os microrganismos que serviram, e servem cada vez mais, de modelos para as ciências modernas como: bioquímica, genética, biologia molecular, engenharia genética, etc. Para o estudo destas ciências é preciso estar familiarizado com os microrganismos. Os microrganismos possuem muitas características que os tornam seres ideais para a investigação dos fenômenos biológicos. Pode-se cultivá- los facilmente em tubos (recipientes pequenos) o que requer menor espaço para manutenção do que plantas e animais. Crescem rapidamente e se reproduzem a um ritmo extraordinariamente elevado. Algumas espécies bacterianas produzem cerca de 100 gerações num período de 24 horas. A cada 15 minutos surge uma nova geração e de cada célula resultam 2 células filhas em uma progressão geométrica sendo que no final de 24 horas teremos milhões de descendentes, o que não acontece com animais e plantas. 6 Áreas de aplicação da microbiologia O microbiólogo, de uma maneira geral, pode se especializar no estudo de certos microrganismos. Estritamente falando, bacteriologia é o estudo das bactérias (muitas vezes o termo é usado como sinônimo de microbiologia), micologia estuda os fungos, virologia estuda os vírus e ficologia estuda as algas. É freqüente a especialização em algum aspecto da microbiologia: citologia bacteriana, genética bacteriana, fisiologia dos fungos, etc. Existem numerosas áreas onde a Microbiologia aplicada tem grande significado. Microbiologia médica: os microrganismos muito estudados são os que causam doenças em humanos e são chamados de patogênicos. Este ramo da microbiologia também estuda a prevenção e controle de doenças, imunização, imunologia e os métodos diagnósticos. O microbiólogo também busca estudar os microrganismos em ambientes particulares: solo, ar, água, esgotos, etc. A educação de um microbiólogo abrange um conhecimento geral da maioria das subdivisões. Entretanto devido ao tremendo acúmulo de informações em cada especialização, o microbiólogo deve se limitar a um ou poucos ramos selecionados da microbiologia. Distribuição na natureza (habitat) Os microrganismos são encontrados praticamente em todos os ambientes, desde o solo e as massas de água (mares, rios), ar, até as superfícies internas e externas de humanos e outros animais, bem como de plantas. Aparecem em maior abundância onde encontram condições favoráveis, como substâncias nutritivas, umidade e temperatura adequada ao seu desenvolvimento. Os microrganismos, que são favorecidos pelas mesmas condições que a população humana, podem produzir modificações devido ao seu metabolismo, o que os torna patogênicos para o homem. Felizmente a maioria é inócua e habita a superfície do nosso corpo, trato digestório, boca, nariz, e outras cavidades naturais. Dispomos de meios para resistir à invasão daqueles que são potencialmente patogênicos. 7 Posição entre os seres vivos Após a descoberta dos microrganismos, ficou claro que eles mostravam todas as combinações possíveis das propriedades dos vegetais e animais, os dois reinos de seres vivos admitidos na época, aparecendo vários absurdos como por exemplo, os fungos foram classificados como vegetais porque eram imóveis, quase não apresentando outras propriedades dos mesmos sendo também que nenhum fungo possui clorofila. Para evitar a distribuição arbitrária dos grupos intermediários (entre plantas e animais), o cientista alemão Ernest Haeckel, discípulo de Charles Darwin em 1866, propôs o estabelecimento de um terceiro reino, para eliminar a confusão existente em relação à posição dos microrganismos e para lhes proporcionar uma posição no mundo vivente. Este terceiro reino foi chamado Protista (da palavra grega que significa primitivo ou primeiro). O Reino Protista compreendeu as algas, protozoários, fungos e bactérias. .Algumas vezes os seres classificados em protistas eram denominados Protistas superiores e Protistas inferiores fundamentando-se em sua estrutura celular. Os superiores possuem célula eucariótica, como os protozoários, fungos e algas, com exceção das algas azul- esverdeadas. Os protistas inferiores são procarióticos: 'bactérias e algas azul-esverdeadas. Desde o conceito original deste terceiro reino de seres vivos têm sido desenvolvidos numerosos critérios para determinar mais adequadamente onde classificar estas microvidas. Uma abordagem a respeito da classificação microbiana foi oferecida por Stanier e Van Niel em 1941. Eles propuseram outra designação para outro reino chamado Monera, que deveria conter algas azul-esverdeadas e as bactérias. As outras algas e protozoários deveriam permanecer como pertencentes ao reino Protista. Os vírus, no entanto, ainda permaneciam como um enigma. Em 1969 foi proposto por Whittaker um outro sistema classificatório de seres vivos, compatível com os recentes estudos ultraestruturais, bioquímicos, genéticos e os principais modos de nutrição: fotossíntese, absorção e ingestão. Os cinco reinos de Whittaker são: Plantae, Fungi, Animmalia, Protista e Monera. Os microrganismos são encontrados em três dos reinos: • Monera (bactérias e algas azuis esverdeadas); • Protistas (outras algas e protozoários); • Fungi (fungos: leveduras e bolores). 8 Classificação dos microrganismos A classificação dos seres vivos serve a vários propósitos, entre eles a de estabelecer critérios necessários para a identificação e acima de tudo, eliminar confusões. A classificação dos microrganismos apresenta problemas peculiares podendo se basear em muitas características. De uma maneira geral as classificações podem ser: Naturais ou Filogenéticas e Artificiais ou Chaves. Nas Chaves as características descritivas são organizadas de tal forma que um organismo em estudo será prontamente identificado. Os organismos agrupados numa chave não precisam necessariamenteapresentar relação filogenética; eles são listados juntos porque apresentam algumas características em comum, facilmente identificáveis. Será perfeitamente razoável, por exemplo, colocar numa chave um grupo de bactérias formadoras de pigmento vermelho, tais como Serraria marcescens e as Sulfobactérias púrpuras. Todavia, este agrupamento será de muita utilidade, pois um pesquisador com a responsabilidade de identificar uma cultura com pigmento vermelho, imediatamente terá seu trabalho reduzido a poucos tipos bacterianos. Na classificação filogenética, agrupa-se tipos aparentados, isto é, aqueles que tem um ancestral em comum. Durante os 100 anos da microbiologia como ciência, têm surgido muitas classificações. Infelizmente não existe um sistema classificatório inteiramente aceitável para todos os microrganismos, principalmente para as bactérias. Dependendo da autoridade consultada, são observadas várias inconsistências. De tempos em tempos são propostos novos sistemas não aceitos em sua totalidade internacionalmente. Classificação atual dos microrganismos Uma classificação proposta atualmente poderia ser a seguinte: 1. Monera: células procarióticas. a) Bactérias b) Cianobactérias c) Arqueobactérias 2. Protistas: Deve-se utilizar a terminologia moderna e mais amplamente aceita. O termo “protista” atualmente é empregado apenas para microrganismos eucarióticos. 9 a) Algas b) Protozoários c) Fungos Elementos diferenciais entre as células 1. NÚCLEO Procarióticos Eucarióticos Membrana Nuclear Ausente Presente Cromossomos Um, circular Um ou mais, lineares Aparelho mitótico Ausente Presentes Histonas Ausente Presentes Genes Agrupados Não agrupados 2. NATUREZA E ESTRUTURA CITOPLASMÁTICA Procarióticos Eucarióticos Correntes citoplasmáticas Ausentes Presentes Pinocitose Ausente Presentes Mesossomos Presentes Ausentes Ribossomos Dispersos no citoplasma Dispostos em membranas, retículos endoplasmáticos e cloroplastos Mitocôndrias Ausentes Presentes Cloroplastos Ausentes Podem estar presentes Complexo de Golgi Ausentes Presentes Vacúolos limitados por membranas Ausentes Presentes 10 3. ESTRUTURAS CELULARES EXTERNAS Procarióticos Eucarióticos Membrana plasmática Possui parte da maquinaria respiratória e fotossíntese Não desenvolve atividade respiratória ou fotossíntese. Parede celular de Peptídeoglicano Presente * Ausente Organelas locomotoras Fibrilas simples Multifibrilas com microtúbulos Pseudópodos Ausentes Presente em alguns * ausente em Mycoplasma sp. 4. RELAÇÃO GUANINA + CITOSINA Procarióticos Eucarióticos Mols de Guanina e Citosina 28 a 73 Cerca de 40 Bactérias O termo bactéria, derivado do grego "gotinhas" foi introduzido em 1828 pelo alemão C. G. Ehrenberg como nome genérico de alguns tipos bacterianos característicos. Bactérias são organismos microscópicos, unicelulares e procarióticos. Taxonomia bacteriana geral Desde a primeira tentativa conhecida de classificação das bactérias, realizada por Müller, em 1773, um grande esforço foi empregado na taxonomia bacteriana, mas até agora nenhum dos numerosos esquemas propostos recebeu aprovação universal. Há falta de concordância nas classificações, mas havendo um interesse em evitar confusão generalizada é preciso aceitar e permitir a evolução de algum plano razoavelmente exeqüível acompanhando naturalmente o progresso dos novos conhecimentos. Uma das classificações foi proposta pela Sociedade Americana de Microbiologia através de seu 11 Bergey' s Manual of Detenninative Bacteriology ao longo de muitas edições. A 9ª edição do manual de Bergey tem como título: "Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology". O manual de Bergey representa mais de 70 anos de evolução, sendo mais aceito que qualquer outro sistema. Devido às incertas relações filogenéticas das bactérias, o manual admite que sua principal aplicação seja determinativa, isto é, permitir aos pesquisadores determinar se ce11o microrganismo corresponde a uma espécie descrita. A 1ª edição data de 1923, já tendo alcançado a 9ª edição. Em cada edição subseqüente, têm sido feito vários avanços significativos, inclusive o acréscimo de novas espécies e excluindo outras. Atualmente um dos esquemas da classificação semi-oficial disponível é o que foi publicado na 9ª edição do Bergey's manual de 1984. É amplamente utilizada como padrão de referência na taxonomia bacteriana. Ele reconhece o reino Monera de Whittaker, chamando-o, no entanto, de Procaryotae, em virtude da natureza procariótica de suas células. Novos conhecimentos causarão uma grande diferença nas futuras publicações a respeito da classificação microbiana. Nos últimos anos o sistema genético das bactérias foi estudado ao nível molecular a fim de determinar a homologia entre o DNA das células. O parâmetro empregado com mais freqüência é a porcentagem de moléculas de guanina mais citosina no conteúdo total de DNA. A composição das bases do DNA é uma característica constante de uma determinada espécie e é expressa em porcentagem de guanina mais citosina sobre o total de mols das bases. Se dois organismos têm proporções muito diferentes de bases, obviamente não são muito relacionados. Centenas de espécies têm sido caracterizadas desta maneira modernamente. Em 1980 o Comitê Internacional sobre Sistemática Bacteriológica, publicou uma lista de aproximadamente 2500 espécies, substituindo uma lista anterior de 30000. Desde 1º de janeiro de 1980 apenas a nova lista de nomes é considerada válida. A substituição das denominações abandonadas, o acréscimo de novas ou quaisquer outras alterações, exigem publicações no International Journal of Systematic Bacteriology. Bactérias: Uma chave classificatória para bactérias estabelece 4 grupos bacterianos, em função do metabolismo de movimentação e das características da parede celular. 12 Vírus: Complexo molecular vivo, possuindo DNA ou RNA. *Os dados citados foram compilados de textos dados em aula. 13 CAPÍTULO 1CAPÍTULO 1CAPÍTULO 1CAPÍTULO 1:::: CONTROLE DOS MICRORGANISMOS É indispensável o conhecimento do controle das populações microbianas para todos os profissionais da saúde. A medicina progredia à medida que surgiam novos conhecimentos sobre o domínio dos microrganismos, reduzindo infecções e a transmissão de doenças contagiosas, executando cirurgias assépticas, etc. Os microbiologistas conseguiram estudar as espécies bacterianas, após as aplicações artificiais de condições desfavoráveis à sua multiplicação. Através dos processos de esterilização dos objetos utilizados, meios de cultura estéreis e técnicas de assepsia, obtiveram populações bacterianas puras e, estas sim, puderam ser estudadas em todos os detalhes: morfológicos, estruturais, fisiológicos, obter dados sobre seus fatores de virulência e outros. O uso de materiais esterilizados é condição indispensável para o desempenho dos trabalhos microbiológicos. Antes de iniciar o estudo dos métodos de controle dos germes, é importante conceituar vários deles, tais como: esterilização, desinfecção (desinfetantes), anti-sepsia (anti-sépticos), assepsia, saneamento e sanitização. Esterilização: deve resultar na destruição total de todas as formas de vida presentes no material submetido ao processo em questão. Desinfecção: é o processo que remove a maioria dos microrganismos viáveis, reduzindoa “bioburden” (carga de organismos viáveis). A desinfecção, na maior parte das vezes, é conseguida pelo uso de substâncias químicas chamadas desinfetantes, destinadas a destruir os germes potencialmente patogênicos, mas que são ineficientes contra a maioria dos esporulados. O calor em temperaturas de 60 a 100oC também tem ação desinfetante, pois não destrói todos os esporos. Anti-sepsia: é o conjunto de meios usados para evitar a proliferação de germes, inativando ou destruído-os. O termo anti-sepsia é geralmente usado referindo-se aos tecidos vivos, como anti-sepsia da pele, anti-sepsia de feridas, etc., reservando-se o termo desinfecção para objetos inanimados. A anti-sepsia é obtida pela ação de substâncias químicas chamadas anti-sépticos. Assepsia: conjunto de procedimentos que impede a penetração de microrganismos em local que não os contenha. Saneamento: mantém a microbiota dentro dos valores populacionais previamente estabelecidos por instituições de saúde. 14 Sanitização: usada em restaurantes e indústrias de alimentos, refere-se à eliminação dos microrganismos em utensílios e equipamentos para impedir a deterioração ou transmissão de infecções pelos produtos alimentares. ESTERILIZAÇÃO É importante o conhecimento das diferentes técnicas de esterilização, para saber qual delas aplica-se melhor, para casos específicos, e que cause dano mínimo ao material envolvido. Para pessoas da área de saúde, é indispensável também conhecer os efeitos que alguns agentes esterilizantes (agentes químicos, radiações) exercem sobre o corpo humano. Os meios mais utilizados para esterilização são os meios físicos, tais como temperaturas elevadas e as radiações. Além destes, é possível eliminar a microbiota presente em um líquido ou gás, por processos mecânicos, como a filtração. Como agentes químicos podem ser usados muitos compostos. A escolha dos agentes e dos diferentes métodos, depende do resultado que se deseja e do material ou local em que o processo vai ser aplicado. Segue-se o esquema e a descrição de alguns processos. Esterilização e Desinfecção por Meios Físicos � Calor - Calor Seco • Flambagem • Forno de Pasteur (estufa) • Incineração - Calor Úmido • Pasteurização • Tyndallização ou Tindalização • Água Fervente • Autoclavação 15 � Filtração - Velas • Chamberland – porcelana porosa • Berkefeld – infusórios - Discos • Vidro • Amianto – Seitz - Membranas • Acetato de celulose: Millipore e HEPA • Nitrato de celulose - Algodão – para gases (ar) � Radiações - Ultravioleta (UV) – NÃO IONIZANTES - Gama (γ) - IONIZANTES Esterilização e Desinfecção por Agentes Químicos � Agentes Químicos: - Líquidos – álcoois, detergentes, álcalis, glutaraldeído. - Gasosos – brometo de metila, óxido de etileno, formaldeído. - Sólidos – pastilhas de formalina. Esterilização e Desinfecção por Meios Físicos A ação letal do calor é uma relação tempo-temperatura afetada por numerosos fatores que devem ser levados em consideração, na seleção da intensidade térmica e na duração da exposição, para reduzir a população bacteriana ao nível desejado. 16 CALOR SECO a) Flambagem É a exposição do objeto à chama de bico de Bunsen ou lamparina. Na técnica bacteriológica utiliza-se a flambagem para esterilizar a alça de platina pelo aquecimento até o rubro. As pinças, as pipetas, as bocas dos tubos e balões em que se faz a semeadura são aquecidos na chama (chamuscadas) sem, no entanto, levá- las ao rubro. b) Ar Quente – Forno de Pasteur O Forno de Pasteur moderno é uma estufa de forma retangular de paredes duplas, isolada termicamente e aquecida por eletricidade. A temperatura desejada é regulada e mantida por um termostato. Em seu interior existem prateleiras móveis. Na porção superior possui orifícios para ventilação e colocação de termômetro graduado em 200oC. Observação: o aparelho e seu funcionamento serão mostrados em aula. A exposição ao ar quente constitui método usado correntemente em bacteriologia, para a esterilização de materiais secos, tais como: tubos, ampolas, placa, provetas, objetos metálicos, óleo mineral, vaselina sólida, parafina, talco, areia, etc. A vidraria seca será esterilizada no forno a 170 – 180oC por uma hora. O papel que protege o material e os tampões de algodão adquire cor parda, porém não devem escurecer demais ou tornarem-se quebradiços. Deixar o forno esfriar espontaneamente. A destruição dos microrganismos ocorre por desidratação e oxidação dos constituintes celulares. Limitações: não se pode esterilizar a seco a vidraria fina como balões volumétricos e pipetas graduadas de precisão, líquidos diversos, meios de cultura, borracha, etc. c) Incineração O método de incineração, do ponto de vista microbiológico, consiste em destruir os microrganismos junto com os materiais orgânicos onde eles se localizam. São materiais removidos dos curativos, peças anatômicas, animais de experiência infectados e mortos, etc., (há os incineradores usados na queima de lixo não hospitalar). Os incineradores que possuem uma só câmara de combustão são ineficazes e inadequados. Isto porque os materiais não são destruídos por completo, contaminando a atmosfera por microrganismos e substâncias tóxicas. O incinerador 17 deve ter, além da câmara de combustão principal, uma câmara de combustão secundária. Ideal é quando a 1a câmara está a 800oC e a segunda aquecida no mínimo a 1000oC. A incineração tem-se tornado um problema social e político em muitas comunidades, principalmente européias. Isto porque, a queima em altas temperaturas de matéria orgânica e plástico, gera substâncias altamente tóxicas, tais como as dioxinas. “Incineradores, na verdade, são indústrias de “ultragifte” – ultravenenos – expressão cunhada pela comunidade científica para designar dioxinas e furanos.” Observação: o criminoso Agente Laranja usado na Guerra do Vietnã era rico em dioxinas (Fonte: Proteção no 11 – vol. 03). CALOR ÚMIDO a) Pasteurização Ato de pasteurizar. Processo pelo qual um determinado material (o leite, por exemplo), é aquecido a uma temperatura não elevada (62,8oC por 30 minutos ou 71,7oC por 15 minutos) e a seguir submetido a resfriamento brusco (em torno de 4oC), obtendo-se assim a morte dos germes patogênicos, no caso do leite: Salmonella, brucelas, estreptococos, bacilos da tuberculose, mas não a eliminação total dos germes contaminantes (bactérias esporuladas). É um processo de desinfecção. b) Tyndallização ou Tindalização É uma esterilização fracionada. Tyndall, o idealizador do processo, verificou que o aquecimento descontínuo, ou seja, aquecimento a 100oC, durante 1 hora, em 3 dias consecutivos, intercalados por períodos de incubação em temperatura ambiente, conseguia esterilizar a solução em estudo. Os esporos resistentes germinam durante o tempo de incubação e são destruídos nas subseqüentes exposições ao calor. A temperatura de tindalização varia de acordo com o material a esterilizar. Alguns meios de cultura bacteriológicos, soluções de carboidratos, soluções de vitaminas ou enzimas, etc., serão aquecidas à temperatura que não altere as suas propriedades. 18 c) Água em Ebulição Os materiais ou objetos contaminados não podem ser esterilizados com segurança pela simples exposição à água em ebulição. Embora as células vegetativas das bactérias possam ser destruídas em poucos minutos, alguns esporos resistirão durante muitas horas. A imersãoem água fervente quando usada para esterilização de instrumentos cirúrgicos, seringas de injeção, etc., oferece o risco de contaminação por esporulados. Só deve ser usada em circunstâncias emergenciais. Pela fervura do material mergulhado em água ou exposto ao vapor em autoclave com válvula aberta (vapor fluente) só se consegue uma desinfecção e não esterilização. d) Autoclave (temperatura superior a 100oC) É um método em que se utiliza vapor d’água sob alta pressão, de tal modo que é o meio mais prático, rápido e barato de esterilização. O aparelho que utiliza-se nesse procedimento chama-se autoclave. Há vários modelos: horizontais, verticais, aquecidas a gás ou eletricidade, ou ainda, alimentadas por vapor gerado em caldeiras separadas. Autoclave de Chamberland: caldeira de paredes resistentes, tampa com borracha apertada por parafusos. Orifícios para o manômetro, válvula de segurança e torneira. Autoclave usa vapor d’água sob pressão regulada. É uma câmara de vapor saturado equipada com dispositivos que permitem a manutenção do vapor em determinada temperatura e pressão por quaisquer períodos de tempo, dependendo da natureza do material a esterilizar, do tipo do continente e de seus volumes. Por exemplo: tubos de ensaio com meios líquidos podem ser esterilizados em 10 a 15 minutos a 121oC. Os mesmos líquidos em balões de 10 litros requerem 1 hora ou mais sob a mesma temperatura e pressão. Materiais utilizados em Biologia Molecular necessitam de 40 minutos de autoclavação (para agir no DNA). Modo de proceder: o material a esterilizar é embrulhado em papel ou sacos plásticos (como os de microondas) formando pacotes. Os pacotes são colocados dentro de uma cesta metálica, esta repousa sobre um suporte, evitando o contato com água do fundo da autoclave. Iniciar o aquecimento com torneira aberta. Quando a água começar a ferver, há emissão de um jato intermitente de vapor e ar. Quando todo o ar for expulso, começa a sair um jato contínuo de vapor, neste momento fecha-se a 19 torneira. Com a continuação do aquecimento, haverá aumento de pressão acusado pelo manômetro. Ao ser atingida a temperatura desejada, 120oC por exemplo, marca-se o tempo. Após esse período desliga-se a corrente elétrica. Para abrir a autoclave, espera-se até que o manômetro abaixe para zero. Só então se abre a torneira. O material sai da autoclave impregnado de umidade. Deve-se colocá-lo na estufa ± 60oC para a secagem. Há autoclaves mais modernas em que o material já sai seco, como a que existe no departamento de Bioquímica da UFPR. Observação: a autoclave e seu funcionamento serão mostrados em seminários, acompanhando os processos de preparação de material para a esterilização. Desvantagens e Limitações: alguns materiais não miscíveis na água, como gorduras, óleos, vaselina líquida e sólida e parafina, que consequentemente não podem ser autoclavados. Tais materiais não são atingidos pelo vapor, e os microrganismos poderão sobreviver. Algumas substâncias são alteradas (metais que oxidam) ou destruídas. O talco e a areia umedecidos são difíceis de secar. Vantagens: 1. Aquecimento rápido. 2. Grande poder de penetração em material denso. 3. Maior condutibilidade. 4. Não deixa resíduos tóxicos. 5. Mais econômico. 6. Termocoagulação das proteínas, catalisada pela água. O calor úmido desnatura proteínas, quebrando ligações químicas envolvidas na manutenção da conformação espacial das proteínas, causando sua coagulação. Grau de Umidade (%) Temperatura de Coagulação da Ovoalbumina 50 25 18 06 00 56 80 90 145 170 20 Eficiência Comparativa do Calor Seco e do Calor Úmido como Esterilizantes � O calor úmido tem um poder de penetração superior. � A penetração do calor seco é menor, sendo necessário, portanto, esterilizar o equipamento e utensílios a temperaturas mais elevadas e por períodos mais longos. � Esta diferença de poder de penetração do calor em estado seco ou úmido é exemplificada pela verificação de que, em um fardo de flanela exposto ao calor seco a 150oC durante 4 horas, a temperatura atingida no centro sobre apenas a 83oC, ao passo que, à temperatura de 120oC em autoclave durante 1 hora e meia, a temperatura central chega a 117oC. Fardo de Flanela Temperatura Central Calor Seco – 150oC – 4 horas 83oC Calor Úmido – 120oC – 1 hora e meia 117oC Microrganismo Calor Úmido 120oC Calor Seco 120oC Clostridium botulinum 20 minutos 120 minutos Bacillus anthracis 15 minutos 120 minutos (150oC) Calor Úmido (tempo em minutos para várias temperaturas) Microrganismos 100oC 105oC 115oC 120oC Bacillus subtilis Clostridium botulinum Bactérias do solo Anaeróbios – putrefação Bactérias termófilas 300 530 780 420 400 40 20 30 06 11 Testes para Controle de Eficiência da Autoclave Em geral, é necessário fazer o controle de esterilidade enquanto a autoclave está em operação, em vez de tentar reconhecer falhas, através do isolamento de microrganismos no material processado. 21 Embora a temperatura e a pressão sejam indicadas pelo termo-manômetro, todos os laboratórios microbiológicos fazem testes confirmatórios de esterilidade do material processado. Para tanto se pode recorrer a métodos físicos e biológicos. Nos métodos físicos usa-se: 1. Indicadores que têm por base a reação de um composto químico quando expostos a um parâmetro necessário à esterilização. Geralmente vêm em forma de fitas ou selos que mudam de cor na temperatura estabelecida. 2. Substâncias químicas em pó (acondicionadas em ampolas de vidro) cujo ponto de fusão é conhecido. Após a autoclavação, observar a substância que deve aparecer fundida. Observação: para cada método de esterilização existem indicadores químicos específicos. No método biológico usam-se esporos bacterianos altamente resistentes como os do Bacillus stearothermophillus. Os esporos podem vir acondicionados em frascos com meio de cultura ou impregnados em tiras de papel de filtro seco, numa concentração de 106 esporos em ambos os casos. Os esporos do Bacillus stearothermophillus morrem quando submetidos a 121oC por 15 minutos. Colocar os esporos na autoclave em pontos críticos, centro e fundo da cesta, pontos em que a temperatura desejada é obtida com maior dificuldade. Após a autoclavação, incubar a 55 a 57oC os esporos em caldo (ou no caso de usar as tiras, transferi-las para um caldo) durante 24 a 48 horas. Caso haja turvação, indica que o bacilo proliferou e que a autoclavação foi insatisfatória. Os bioindicadores existem no comércio sob o nome de Esporofars®, Steritest® e outros. FILTRAÇÃO A filtração é o método de escolha para esterilizar soluções contendo substâncias termossensíveis como o soro sanguíneo, plasma, solução de vitaminas, solução de enzimas, solução de alguns carboidratos, fluidos para inoculação, colírios, etc. Líquidos injetáveis são primeiramente filtrados e depois autoclavados para evitar pirogênios. Estes são componentes termoestáveis da degradação das bactérias. 22 As técnicas de filtração são também usadas para recuperar pequenas quantidades de bactérias presentes em grandes volumes de líquido, como, por exemplo, água. Nestes casos, após a filtração, a membrana é colocada em meio de cultura adequado, as bactérias vão proliferar dando colônias que podem ser quantificadas, estudadas e identificadas. A filtração pode ser aplicada na descontaminação de gases como o ar. O exemplo disto é dadopelo uso de tampões de algodão que obturam a boca de tubos, balões vazios ou contendo meio de cultura. O algodão é suficientemente poroso para permitir a entrada de ar e impedir a entrada de germes. Outro exemplo é a filtração do ar nas câmaras assépticas, salas de cirurgia, etc. Numerosos são os dispositivos e materiais usados na técnica da filtração, como por exemplo: a) VELAS - Chamberland: porcelana. - Berkefeld: terra infusórios. b) DISCOS - Vidro. - Amianto. c) MEMBRANAS - Acetato de celulose, também chamados de filtros moleculares. Exemplo: Millipore. Atualmente são as mais usadas nas técnicas de filtração. Elas apresentam a vantagem de poder ser autoclavadas. Há as descartáveis. Podem filtrar diversos líquidos: água, álcool, éter, toluol, xilol, metano, etano, acetileno, parafina, naftalina, terpeno, etc., sem sofrer degradação. Tamanho dos poros: 0,05 a 10 µm (micrômetros). Cada cm2 contém milhões de poros, 80% da membrana é espaço aberto e 20% de material sólido, com isto o fluxo é em torno de 40 vezes mais rápido que pelos demais filtros. Ultrafiltração Elford – colódio – membrana Gradocol (de nitrato de celulose). Poros: 10 a 10.000 ηm (para determinar o tamanho do vírus). 23 Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) de Acetato de Celulose Utilizados para produção de fluxo de ar estéril em câmaras bacteriológicas assépticas, salas de cirurgia, etc. Há produção de fluxo de ar não turbulento ou laminar. Eficiência = 99,97% RADIAÇÕES NÃO IONIZANTES (U.V.) As radiações na forma de luz ultravioleta têm sua atividade melhor na faixa de 250- 260 ηm, comprimento de onda de absorção máxima pelas bases púricas e pirimídicas do DNA, formando dímeros, inibindo a replicação do DNA. É comum seu emprego para esterilização do ar em hospitais e também em laboratórios de microbiologia, nas câmaras assépticas, onde as condições de assepsia devem se manter rigorosamente controladas. Emprega-se esse tipo de radiação para reduzir a população microbiana da superfície dos equipamentos ou do ar. O seu poder de penetração é mínimo. Uma camada fina de vidro ou água pode impedir a ação da luz U.V. O uso de raios U.V., em medicina, é limitado por danificar a córnea e a pele. Raios Gama e Raios X Os raios gama são atualmente muito usados para esterilizar grandes quantidades de itens de pequeno porte tais como agulhas, seringas, equipamentos endovenosos, cateteres e luvas. O material é esterilizado já acondicionado na sua embalagem final. O processo é 100% eficiente e ininterrupto. Não é uma técnica aplicável para uso descontínuo, pois não é possível ligar ou desligar. Os raios gama e os raios X criam radicais livres ativos (OH- e H+) pela hidrólise da água. Estes radicais altamente reativos quebram as ligações covalentes do DNA, alterando as estruturas do DNA e das proteínas. Vantagens - esterilização fria (indústria alimentícia e farmacêutica); - alto poder de penetração. Desvantagens - alto custo; - operadores altamente especializados; 24 - acarreta sérios danos à saúde, tais como: a) alterações celulares (neoplasias malignas, como a leucemia); b) lesões de gônadas (alterações cromossômicas). ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO POR AGENTES QUÍMICOS A esterilização por produtos químicos é indicada apenas para os materiais que não podem ser submetidos ao calor. A escolha de um agente químico dependerá da finalidade do uso. Não existe uma substância ideal capaz de agir em todos os casos. Alguns são muito ativos, mas tóxicos para os tecidos vivos, portanto usados apenas em objetos inanimados. Outros apresentam instabilidade quando em solução. Alguns são rapidamente inativados em contato com matéria orgânica. A maioria dos agentes químicos age como desinfetante ou anti-séptico, somente alguns são capazes de esterilizar, embora se saiba que os produtos químicos podem agir como bacteriostáticos ou esterilizantes dependendo da concentração e do tempo de ação. Ácido fênico em solução de 0,2% age como bacteriostático e a 5% é esterilizante. Alguns produtos químicos são mais utilizados que outros devido a vários fatores: facilidade de obtenção, menor custo, maior estabilidade quando em solução e seu poder germicida. Assim temos: Produto Químico • Deve ter - Atividade antimicrobiana de largo espectro. - Estabilidade e homogeneidade quando em solução. - Inocuidade para o homem. - Boa solubilidade. • Deve não ser - Corrosivo. - Irritante. • Deve - Não deixar resíduos. 25 - Não alterar materiais como borracha, plástico, etc. Na aplicação de qualquer agente químico é necessário observar-se as seguintes variáveis: a) Concentração; b) Tempo; c) Temperatura; d) pH; e) Limpeza. AGENTES QUÍMICOS Agentes químicos são comumente empregados para a esterilização ou desinfecção de equipamentos: • Líquidos: ácidos e álcalis fortes, glutaraldeído, compostos fenólicos, álcoois e compostos quaternários de amônio. • Gasosos: ozônio, brometo de metila, β-propionalactona, óxido de etileno, óxido de propileno e formaldeído. • Sólidos: pastilhas de formalina. Óxido de Etileno É um gás incolor, não corrosivo e que se liquefaz a 10,9oC, sendo o líquido bastante solúvel em gás e solventes orgânicos. Concentrações acima de 100 mg/L são tóxicas ao ser humano, causando irritações dos olhos e pulmões; náuseas, edema pulmonar e danos à pele. O gás é altamente inflamável e explosivo, não se podendo trabalhar em temperaturas elevadas, no máximo 60oC. Aplicações industriais são baseadas no uso de misturas contendo 10% de óxido de etileno e 90% de CO2 ou 50% de óxido de etileno e 50% de formato de metila. O gás tem elevado poder de penetração em material orgânico, incluindo plásticos, borrachas, madeira, papel, tecidos (lã), couro, produtos desidratados, equipamentos de 26 anestesia e seringas sem danificá-los, o que recomenda muito o seu emprego. Pode ainda ser utilizado em metais, vidros e materiais elétricos. O uso de óxido de etileno requer equipamentos adequados de alto custo. O aparelho esterilizador a ETO é formado de um conjunto de três unidades: - Uma autoclave (câmara grande) tendo o gás ETO e vapor d’água. - Um painel de controle onde está conectado o cilindro de mistura de gases. - Uma câmara secadora onde o material, após a esterilização, é obrigatoriamente submetido à aeração, que consiste na circulação de ar filtrado. O ar passando pelos materiais faz a remoção dos resíduos de gás retido nos mesmo. Tendo condições adequadas de temperatura, pressão de vapor d’água, tempo e concentração do gás, o ETO é muito eficiente. Condições: • Temperatura entre 49 e 60oC; • Tempo de exposição de 2 a 12 horas; • Concentração do gás 450 mg/L; • Umidade de 20 a 40%. Óxido de Etileno Vantagens Desvantagens a) Bactericida, viricida, esporicida; b) Temperatura baixa 47-60oC; c) Grande variedade de materiais; d) Equipamento anestesia, seringa. a) Alto custo; b) Tóxico; c) Inflamável. O óxido de etileno atua como alquilante, inativando as enzimas e outras proteínas que têm átomos de H lábeis, como em grupos sulfidrila. O anel da molécula do óxido de etileno se rompe para formar –CH2 –CH2O que se insere entre átomos de enxofre e hidrogênio do grupo sulfidrila: H2C H2C + R.SH R.SCH2.CH2.OHO (enzima ativa) (enzima inativa) 27 Formaldeído O formaldeído, de estrutura simples (HCOH), é estável em altas concentrações e temperaturas elevadas, mas é extremamente tóxico, seus vapores são irritantes às mucosas. Em temperatura ambiente o formaldeído polimeriza-se, formando uma substância sólida, incolor – paraformaldeído – que libera formaldeído pelo aquecimento. Formalina é a solução aquosa de formaldeído (37 a 40%), forma em que é comercializado. O formaldeído é utilizado na forma gasosa para esterilizar áreas fechadas, como quartos de doentes contagiosos, após a desocupação. A umidade e temperatura têm grande influência sobre sua ação antimicrobiana, temperatura ideal de 22oC e umidade de 60 a 80%. Tem a desvantagem do baixo poder de penetração. A sua ação é com os grupos amino, hidroxila, carboxila e sulfidrila, introduzindo um radical (CH2), alterando a estrutura das proteínas e ácidos nucléicos. Glutaraldeído Age de modo semelhante ao formaldeído, mas é menos tóxico e dez vezes mais eficiente. Age lentamente porém efetivamente. Usado na desinfecção de endoscópios e equipamentos de terapia respiratória. Outras substâncias de interesse na prática médica ���� Álcoois: os mais usados são o álcool etílico e o isopropílico. O álcool etílico é muito usado na degermação da pele e desinfecção de superfícies, algumas vezes em combinação com iodo. Requer presença de água (álcool a 70%) para sua atividade máxima. O álcool desestrutura os lipídios da membrana celular e desnatura as proteínas bacterianas. ���� Ácidos e Álcalis: a variação acentuada de pH pode resultar em cessação do metabolismo e morte do microrganismo. A ação dos ácidos depende do seu grau de ionização: da concentração hidrogeniônica no caso dos ácidos minerais ou da natureza de suas moléculas no caso dos ácidos orgânicos. A ação dos álcalis depende do seu grau de 28 dissociação, da concentração de íons hidroxila e do íon metálico do álcali. O hidróxido de cálcio é um deles. É de alto poder desinfetante, usado em quartos de doentes, excretas, vagões, etc. ���� Oxidantes: inativam as células oxidando os grupos sulfidrila livres. São: peróxido de hidrogênio, iodo, cloro e compostos que liberam lentamente o cloro (cal clorada). O iodo é anti-séptico muito utilizado nas práticas médicas. É de efeito imediato. É encontrado em duas formas: Tintura de Iodo e iodóforos. Os iodóforos são complexos de iodo com detergentes ou outras moléculas carreadoras. Os iodóforos liberam iodo lentamente, não irritam a pele, não tem odor irritante e não tingem os tecidos. O iodo reage especificamente com resíduos de tirosina das proteínas e inativa as enzimas que contém pontes de dissulfeto. ���� Detergentes: são agentes surfactantes ativos e podem ser aniônicos ou catiônicos. a) Detergentes aniônicos têm hidrocarboneto de cadeia longa de carga elétrica negativa, por exemplo: os sabões e produtos sintéticos semelhantes aos sabões. Os produtos sintéticos são mais solúveis e mais baratos que os sabões convencionais. b) Detergentes catiônicos de carga elétrica positiva. Os mais usados são os detergentes de compostos quaternários de amônio. Estes compostos têm amplo espectro bactericida e bacteriostático mesmo em altas diluições contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. Os detergentes agem sobre os lipídeos da membrana celular alterando sua função ou desintegrando-a. também desnaturam as proteínas. Os compostos quaternários de amônio são muito solúveis em água, são pouco tóxicos e não corrosivos, como o cloreto de benzalcônio, muito utilizado na anti-sepsia da pele. ���� Metais Pesados: os mais usados são mercúrio e prata. Ambos possuem boa atividade antimicrobiana. O mercúrio quando combinado a outras substâncias, apresenta-se menos tóxico ao organismo humano que o próprio metal. Por exemplo: mercúrio cromo, Mertiolato. A prata combinada com proteínas é antisséptico de mucosas do nariz e garganta: Argirol, Protargol. Estes metais agem inativando as enzimas bacterianas através do grupo sulfidrila. 29 CAPÍTULO 2CAPÍTULO 2CAPÍTULO 2CAPÍTULO 2: : : : TIPOS MORFOLÓGICOS DE BACTÉRIAS E GRUPAMENTOS BACTERIANOS Objetivos a. Observar e comparar a morfologia das diversas bactérias em lâminas focalizadas. b. Identificar nas preparações microscópicas focalizadas a forma da célula e o grupamento. c. Verificar se nos grupamentos há ou não arranjos sempre com o mesmo número de células. d. Observar estruturas bacterianas no interior das células (esporos, granulações). Tipos Morfológicos Embora existam milhares de espécies bacterianas, as suas células podem agrupar- se em três tipos morfológicos fundamentais: a) Arredondada; b) Alongada; c) Ondulada. COCOS Forma arredondada (perfeitamente esféricas, elípticas, em chama de vela e riniformes. * VER PRANCHAS DE MORFOLOGIA NAS AULAS PRÁTICAS Esférico: Completamente arredondado. Exemplo: Staphylococcus aureus. Coco-oval (alongado) Exemplo: Streptococcus pyogenes. 30 Pneumococo (em forma de gota, chama de vela) Exemplo: Streptococcus pneumoniae. Fonte: Fernando Bortolozzi Gonococo e Meningococo: Forma riniforme (em forma de feijão ou rim) Exemplos: Neisseria gonorrhoeae (G) Neisseria meningitidis (M). BACILOS Forma alongada ou cilíndrica. Bastonetes. (variações: quanto ao comprimento, espessura e forma das extremidades). Obs: Os bacilos eram também denominados bastonetes até alguns anos atrás. No entanto, a denominação “bastonete” é de uso mais aconselhável para os neutrófilos imaturos que saem da medula óssea mielóide e vão para a corrente sanguínea suprir necessidades fisiológicas durante uma infecção (desvio à esquerda, como será visto nas aulas de Patologia Médica Molecular – BP337). Portanto para bactérias alongadas, prefere-se o termo BACILO. VARIAÇÕES BACILARES: � Finos e curtos: têm extremidades arredondadas. Exemplo: Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas, Mycobacterium. � Finos e longos (forma filamentosa). Parece um fio de cabelo. Exemplo: Leptotrix buccalis, Lactobacillus sp. � Curtos, espessos e extremidades rombadas. Exemplo: Bacillus. � Finas longas e extremidades agudas. 31 Exemplo: Fusobacterium nucleatum. � Curta e arredondada (cocobacilo). Exemplo: Brucella, Haemophilus sp. * VER PRANCHAS DE MORFOLOGIA NAS AULAS PRÁTICAS Nos bacilos, sempre o comprimento predomina sobre a espessura no mínimo uma vez e meia, ao contrário dos cocos, nos quais essas dimensões permanecem quase iguais. FORMAS ONDULADAS Forma ondulada, espiralada ou helicoidal. Compreende: a) Espirilos b) Espiroquetas c) Vibriões a) Espirilo: possui corpo rígido, movendo-se à custa de flagelos. Exemplo: Spirillum b) Espiroqueta: corpo flexível e móvel com o auxílio de filamentos axiais presentes sob a camada externa. Exemplo: Treponema pallidum 32 c) Vibrião: em forma de vírgula, apenas um seguimento de espiral. Exemplo: Vibrio cholerae Imagens: Tortora, 2005 Outros: Entre espirilos e espiroquetas aparecem diferenças notáveis de comprimento, espessura, número e amplitude de espiras. � Algumas possuem pequeno número de espiras,abertas e irregulares. Exemplo: Borrelia. � Outras têm espiras numerosas, regulares e apertadas à semelhança de dentes de serra. Treponema pallidum Leptospira interrogans 33 GRUPAMENTOS BACTERIANOS Ao lado da forma da célula, é importante o conhecimento das diferentes disposições que as bactérias apresentam, chamadas de grupamentos, pelos quais podem-se diferenciar gêneros bacterianos. Estas associações são explicadas por peculiaridades dos processos de multiplicação. Podem ocorrer os seguintes arranjos: Imagens: Fernando Bortolozzi e Tortora, 2005 h NOMENCLATURA DO GRUPAMENTO FORMATO EXEMPLOS Diplococos (dois a dois) 1 2 1. Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitis (GONOCOCO e MENINGOCOCO) 2. Streptococcus pneumoniae (PNEUMOCOCO) Estreptococos (cadeias) Streptococcus pyogenes Estafilococos (irregular ou cacho de uva) Staphylococcus aureus Tétrades (cocos de 4 em 4 elementos, simetricamente) Micrococcus Sarcina (8 elementos, formando cubos simetricamente) Sarcina (não visível no plano do MO) Quanto às células alongadas, os grupamentos não apresentam tanta importância: 1. Diplobacilos (dois a dois): 2. Estreptobacilos (em cadeia): Imagens: Tortora, 2005 (Geralmente esporulam) 34 3. Alguns bacilos podem agrupar-se em paliçada, quando o movimento pós- divisional é de deslizamento: Mycobacterium tuberculosis (PALIÇADA) 4. Globias: bacililos agrupados em formas concêntricas que se assemelham a um globo. Mycobacterium leprae (GLOBIA) Imagens: Fernando Bortolozzi 5. Um outro movimento pós-divisional é em dobra, onde as células formam ângulo à semelhança de letras e o conjunto lembra letras chinesas: Corynebacterium diphteriae 6. As formas onduladas apresentam-se individuais, não formando grupamentos. Observação: em uma preparação microscópica, observar a morfologia celular e o grupamento predominante. Formas de Involução e Pleomórficas Pleomórficas: são bactérias sem parede e justamente por isso não têm forma definida ORIGINALMENTE (não se enquadram em cocos, bacilos, espirilos etc., uma vez que nunca tiveram forma definida). Independe das condições do meio. Exemplos: Haemophilus, Mycoplasma, Proteus, Chlamydia e o bacilo diftérico. Involutivas: Bactérias em degeneração, aberrantes ou intumescidas. Quando em meio inadequado (pH, O2, toxinas, composição do meio, produtos tóxicos vindos do próprio metabolismo bacteriano, etc.), esses microrganismos perdem sua forma original. Um dia foram cocos, bacilos, etc. As células deste tipo mostram aspectos de intumescimento, aberrantes e em degeneração, como por exemplo, a Yersinia pestis. 35 CAPÍTULO 3CAPÍTULO 3CAPÍTULO 3CAPÍTULO 3: : : : MORFOLOGIA COLONIAL Objetivos 1. Identificar as principais características culturais de bactérias; 2. Avaliar a importância destes dados na sistemática bacteriana, facilitando a caracterização e a identificação das bactérias. Introdução Fornecendo as mesmas condições de cultivo relacionadas à composição do meio de cultura, atmosfera, temperatura, pH, etc, as bactérias apresentam uma notável constância de caracteres. Podem-se considerar as seguintes características coloniais pela variação de: tamanho, cor, forma, tipos de bordas, elevação, superfície, consistência, transparência, brilho, cromogênese (pigmento solúvel ou não). Definição Colônia é o crescimento dos microrganismos em meio sólido. Em condições ideais, a colônia representa a descendência de uma única célula. Características das Colônias • Tamanho: puntiformes (menores que 0.5mm) até alguns centímetros de diâmetro. • Cor: amarelo ouro, amarela citrina, amarela clara, vermelha, rosada, branca, castanha, alaranjada, etc., com pigmento difusível ou não. • Forma: Circular Irregular Rizóide ou arborescente 36 • Bordas: Lisa Denteadas Lobadas Onduladas • Elevação: Convexa alta Convexa baixa Acuminada Espraiada Centro-saliente Umbilicada Centro-deprimida Papiliforme • Superfície: Lisa, rugosa, pregueada, raiada Com círculos concêntricos • Consistência: Cremosa, viscosa, granulosa, seca • Transparência: Opaca, translúcida, transparente • Brilho: Fosca, brilhante 37 CAPÍTULO 4CAPÍTULO 4CAPÍTULO 4CAPÍTULO 4: : : : VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE BACTÉRIAS NO AR E SUA CONTAGEM ATRAVÉS DE CULTIVO Observação A partir deste capítulo as aulas práticas serão participativas ou demonstrativas dependendo da disponibilidade de material para sua execução (meios de cultura, material patológico, soros aglutinantes, placas, pipetas, etc.) Objetivos 1) Avaliar o ambiente quanto à presença e número de bactérias viáveis não exigentes, aeróbias e mesófilas, para justificar a necessidade de assepsia nos trabalhos bacteriológicos. 2) Prevenção de contaminação em salas de curativos, cirurgias, etc.. 3) Estudar as diferentes características coloniais. Contagem Meio de cultivo: ágar simples (ASI) distribuído em placas de Petri de 10 cm de diâmetro. Técnica 1. Expor à contaminação, pelo ar, as placas abertas em diversos locais da sala de aula por 30 minutos (por exemplo); 2. Fechar e incubar a 36oC durante 48h; 3. Contar as colônias desenvolvidas; 4. Calcular a quantidade de bactérias por m2 de acordo com os seguintes dados: 38 a. Área da placa de 10 cm de diâmetro = 0,007854 m2. b. Tempo de exposição: 30 minutos. Exemplo: 10 UFC →→→→ 0,007854 m2 x →→→→ 1 m2 x = 1.273 UFC/m2 em uma hora: 1.273 →→→→ 0,5 hora x →→→→ 1 hora x = 2.546 UFC/m2/h UFC = Unidades Formadoras de Colônia 39 CAPÍTULO 5CAPÍTULO 5CAPÍTULO 5CAPÍTULO 5: : : : PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS Objetivos Familiarizar o aluno com as técnicas de preparações microscópicas, visando à observação dos microrganismos. Pelas características vistas, iniciar a identificação das bactérias. Introdução Existem muitos tipos de preparações microscópicas, variando com a necessidade de obter dados como: mobilidade, estruturas celulares, propriedades tintoriais, etc,... A bacterioscopia pode ser feita com o objetivo de observar bactérias: 1. Vivas: pelos exames a fresco. 2. Mortas: em preparações coradas. Preparações a Fresco • Campo Claro - Entre lâmina e lamínula. - Gota pendente. • Campo Escuro - Entre lâmina e lamínula. Servem para observar a mobilidade e/ou presença de bactérias. Preparações Coradas • Coloração Negativa – usando contraste. • Coloração Simples – um corante. • Coloração Composta ou Diferencial – dois ou mais corantes diferentes. A coloração negativa e a coloração simples são usadas para observar a presença de bactérias e sua morfologia. A coloração composta é usada para evidenciar estruturas celulares e as propriedades tintoriais. 40 Preparações a Fresco Nas preparações a fresco os materiais líquidos como urina, exsudatos, LCR, meios de cultivo líquidos, podem ser examinados tais como se apresentam ou centrifugados e examinando-se o sedimento. Quando setem material espesso (patológico ou de cultivo), deve-se diluí-lo em soro fisiológico estéril. Podem-se examinar as bactérias ao natural, com pouca luminosidade, mas como as suas células têm um índice de refração próximo ao da água, algumas vezes torna-se difícil observá-las. Nesses casos recorre-se aos corantes vitais, atóxicos (para não prejudicar a mobilidade). Os mais usados são: azul de metileno, vermelho neutro, azul de Nilo, entre outros, em solução aquosa a 1%. Técnica de preparação entre lâmina e lamínula 1) Sobre uma lâmina colocar uma ou duas gotas do líquido a examinar; 2) Cobrir com lamínula. Observar ao microscópio com quantidade reduzida de luz e objetiva de pequeno aumento (10x) para uma visão panorâmica. Em seguida passar para 40x aumentando convenientemente a intensidade da luz. Observação: para evitar a dessecação do material, pode-se cercar as gotas com Vaspar (mistura de vaselina e parafina). A lamínula colocada ficará aderida ao Vaspar, fechando a preparação. Na falta de Vaspar pode-se utilizar vaselina sólida ou lanolina. Técnica de preparação em gota pendente Usa-se para esta técnica a lâmina escavada de Koch (lâmina com ± 3 mm de espessura com concavidade central). 1. Untar as bordas da concavidade com Vaspar. 2. Sobre uma lamínula colocar uma pequena quantidade do líquido a ser examinado. 3. Inverter a lâmina escavada sobre a lamínula e pressioná-la levemente para aderir ao Vaspar. 4. Voltar rapidamente a lâmina à sua posição normal. 41 VISTA DE CIMA CORTE TRANSVERSAL (APÓS A MONTAGEM) Lâmina Vaspar Lâmina Lamínula Vaspar Gota Pendente Escavação (concavidade) Preparação a fresco em campo escuro Serve para a mesma finalidade que as técnicas precedentes, mas especialmente usada para observar bactérias muito delgadas, que são invisíveis em campo claro. Utilizada para observar a presença de espiroquetas em materiais como serosidade de cancro sifilítico (Treponema pallidum) ou urina suspeita de conter Leptospira (urina recém emitida e centrifugada, utilizar o sedimento). O campo escuro ao microscópio é obtido usando-se um condensador especial (como o cardióide) que impede a penetração de raios diretos de luz sobre o material examinado. As bactérias são iluminadas lateralmente, contrastando com o fundo escuro. A técnica de montagem da preparação é a mesma que entre lâmina e lamínula. Preparações Microscópicas Coradas São as mais usadas em bacteriologia, onde as bactérias estão mortas e artificialmente coradas. Este tipo de preparação, que compreende a coloração de Gram, é muito importante na identificação presuntiva de microrganismos. A morfologia da célula, sua disposição e propriedades tintoriais são freqüentemente suficientes para definir o gênero. Etapas das preparações coradas: 1) Esfregaço 2) Fixação (a quente ou a frio) 3) Coloração 42 1. Esfregaço: consiste em depositar o material a examinar no centro de uma lâmina e espalhá-lo numa espessura apropriada. Deixar secar espontaneamente ou numa estufa a 37oC. Se o material a examinar pela bacterioscopia for muito espesso (patológico ou cultivo), deve ser diluído em salina ou água estéril. Se for material líquido e pobre em microrganismos, deve ser centrifugado (urina, por exemplo); derrama-se o sobrenadante e examina-se o sedimento. 2. Fixação: tem por objetivo fixar o material à lâmina para que não se desprenda durante os procedimentos ulteriores. A fixação pode ser feita a quente ou a frio. Em ambos os casos há coagulação de célula bacteriana que a faz aderir à lâmina. A Quente • Pode ser feita “serrando” com a lâmina a chama da lâmpada ou bico de Bunsen, duas a três vezes, com a face que contém o material voltada para cima, para não ter contato direto com a chama. • Derrama-se álcool sobre a preparação e inflama-se. Observação: a exposição excessiva ao calor deforma a morfologia da bactéria e com aquecimento insuficiente haverá desprendimento do material. A Frio • Para não alterar muito a morfologia bacteriana ou quando há interesse de observar o aspecto citológico do material, como exsudatos, sangue, líquor, etc., usa-se fixação a frio, cobrindo o esfregaço com substâncias químicas: - Mistura de álcool e acetona. - Formol. - Solução de cloreto de mercúrio, etc. 3. Coloração propriamente dita: seguir as instruções do método de coloração a ser usado. Nos casos em que se queira observar apenas a presença de bactérias ou conhecer a sua morfologia ou grupamento, recorre-se à COLORAÇÃO SIMPLES, onde se usa um corante qualquer: azul de metileno, fucsina, violeta de genciana, etc. 43 Coloração Simples Técnica 1. Cobrir o esfregaço com o corante e deixar agir um minuto; 2. Lavar com água; 3. Secar. Examinar no MO com a objetiva de 100x em imersão. Coloração Composta ou Diferencial Nestas colorações participam fundamentalmente quatro componentes, cuja natureza química varia com o método escolhido. 1. Corante principal: é o primeiro a ser empregado determinando a característica tintorial (como por exemplo, violeta de genciana na coloração Gram). 2. Mordente: é a substância que reforça a ação do corante principal (iodo no Gram). 3. Diferenciador: é o elemento que descora seletivamente as bactérias (álcool no Gram). 4. Corante secundário ou de fundo: é o que cora os elementos descorados pelo diferenciador (fucsina no Gram). O corante de fundo tem que ter cor contrastante com o corante principal. A coloração diferencial universalmente aceita, e usada em todos os laboratórios de bacteriologia, é a coloração de Gram, que separa as bactérias em dois grandes grupos: 1) Gram positivas. 2) Gram negativa. A propriedade tintorial revelada pelo Gram está relacionada à composição química da parede celular bacteriana. 44 COLORAÇÃO DE GRAM Técnica 1. Cobrir o esfregaço com Violeta de Genciana e deixar agir. (1 minuto) 2. Derramar o corante e cobrir com lugol. (1 minuto) 3. Lavar com água. 4. Descorar pelo álcool (tempo crítico) - (15 segundos) 5. Lavar com água. 6. Cobrir com fucsina de Ziehl diluída 1:10. (30 segundos) 7. Lavar com água. 8. Secar. Observação: existem diversas modificações do método de Gram. Alguns laboratórios substituem a Violeta de Genciana (penta e hexametil pararosanilina) por Cristal Violeta (hexametilpararosanilina) que tem poder corante superior. As bactérias submetidas ao método de Gram comportam-se da seguinte maneira: (Fonte: Tortora, 2005) Etapa Gram POSITIVA Gram NEGATIVA Até a 3a etapa Após a 5a etapa Após a 7a etapa Violeta Violeta Violeta Violeta Incolor Vermelha 45 GRAM – GRAM + Microscopia: Rosa Microscopia: Roxo Possui uma parede celular mais diversificada, sem lipoteicoato Possui filamentos de teicoato, ligados à muranato ± 1-2 camadas de peptidoglicano (5-10%) (+ FINAS) 15 a 20 camadas de peptidoglicano (90%) (+ ESPESSAS) Mais lipídeo (20%) e muitos aa Tem pouco lipídeo (2%) e poucos aa Possui uma 2ª membrana ancorada às camadas de peptidoglicano (chamada membrana externa) externa à parede celular Tem adjacente à membrana plasmática uma parede celular Formam ESFEROPLASTOS: quando a bactéria perde a parece celular. Quando restam partes da PC, em local e condições adequadas, essa PC pode ser refazer. Formam PROTOPLASTOS:é a membrana de uma bactéria gram +. Se perdê-la, não consegue refazê-la. Porém sobrevive só com o protoplasto. Mais polissacarídeos e presença de lipídeo A formando os lipopolissacarídeos (LPS***) Menos polissacarídeos CORRELAÇÕES CLÍNICAS: Fonte: Robbins, 2005 *** LPS: são pirogênios exógenos (geram calor) – No organismo humano, podem ser produtores de febre. Quando os macrófagos fagocitam os produtos bacterianos, produzem altas concentrações de fator de necrose tumoral. O TNF estimula a produção de Interleucina 1 (IL-1) por outros macrófagos e alguns leucócitos. Esses mediadores estimulam a expressão de receptores no endotélio para que os neutrófilos migrem, via rolamento, para o tecido conjuntivo em combate às bactérias patogênicas. Além disso, a IL-1 e o TNF estimulam a produção de PGE-2 (prostaglandina E2) no hipotálamo, que controla a temperatura corporal via AMPc. Com o aumento da temperatura corporal, proteínas do choque térmico são expressar e ativam a resposta e a atividade linfocitária. Ou seja, a elevação da temperatura corporal melhora a resposta imune do indivíduo frente a bactérias patogênicas. Outros efeitos do TNF e da IL-1 (quando elevados) são a sonolência e a inapetência, o que explica porque o paciente geralmente fica acamado durante uma infecção. Detalhes serão vistos na disciplina de Patologia Médica Molecular (BP337). * Espaço periplásmico: é o espaço entre as camadas de peptidoglicano. É um importante local de produção de enzimas, entre elas a β-LACTAMASE. Uma enzima muito importante, pois ela influencia na terapêutica antibiótica. β-lactâmicos são uma classe de antibióticos, diga-se de passagem, os antibióticos mais utilizados no tratamento de infecções (leia-se penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos, etc). Esses antibióticos são assim chamados porque em sua composição têm um anel beta-lactâmico. Essas bactérias que produzem β- 46 lactamases, são capazes de destruir esse anel dos antibióticos por hidrólise, deixando o mecanismo de ação antimicrobiano inativo. Ou seja, É UM IMPORTANTE MECANISMO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS! As principais bactérias que a produzem são os estafilococos (Staphylococcus aureus principalmente), Haemophilus influenzae, Moraxella e a maioria dos BGNs intestinais como a Escherichia coli. Estreptococos geralmente não são capazes de produzir β-lactamases. No entanto, em uma infecção tipo tonsilite por Streptococcus pyogenes (Estreptococo beta hemolítico do grupo A de Lancefield produtor de estreptolisina), por exemplo: esta bactéria não produz β-lactamases, mas algumas bactérias da microbiota residente as produzem. Essas enzimas degradam o fármaco que iria matar a bactéria causadora da infecção e o medicamento acaba falhando. Por isso, muitas vezes, mesmo para infecções estreptocóccicas, deve ser prescrever um antibiótico JUNTO COM UM INIBIDOR DAS BETA LACTAMASES. Até porque clinicamente não se sabe se trata-se de uma infecção por estafilococos, estreptococos, Haemophilus, Moraxella, etc. Prescreve-se um antibiótico β-lactâmico com um inibidor de β-lactamases que faz inibição enzimática e deixa essas penicilinases sem atividade catalítica. Ex: Clavulanato, Sulbactam, etc. Eles inibem as β-lactamases e deixam o antibiótico agir (penicilina). Além disso, muitas vezes, a própria bactéria causadora da infecção pode ser produtora dessas enzimas. Medicamentos com inibidores de β-lactamases: � Amoxicilina + Clavulanato de Potássio (Clavulin®). Antibiótico de primeira escolha para infecções de vias aéreas superiores. O clavulanato inibe as β-lactamases e a amoxicilina, uma vez que não será destruída pela ação dessas enzimas, dará cabo das bactérias. Há vários esquemas de posologia que serão vistos nas disciplinas clínicas. � Amoxicilina + Sulbactam (Trifamox IBL®) Mecanismo de ação dos β-lactâmicos: Inibição da síntese de peptideoglicano. Existem enzimas responsáveis pela síntese de peptideoglicano, as PBP (Penicillium Binding Proteins), são transpeptidases e carboxipeptidases, proteínas fixadoras de penicilina. O mecanismo é simples, esses antibióticos inibem essas enzimas (que geralmente se localizam na superfície externa da MP), deixando a parede celular frouxa. Mas, além disso, esses antimicrobianos fazem a inativação dos inibidores das enzimas autolíticas na PC. Exemplos de bactérias Gram positivas e Gram negativas mais comuns: Cocos Gram positivos Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Enterococcus, Sarcina Cocos Gram negativos Neisseria (gonorrhoeae e meningitidis), Moraxella, Veillonella Bacilos Gram positivos Bacillus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Listeria Bacilos Gram negativos Enterobacteriaceae (Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Proteus, etc), Bordetella, Brucella, Pseudomonas, Alcaligenes O comportamento tintorial frente ao Gram está relacionado intimamente a outras propriedades das bactérias. De tal modo que, ao verificarmos a Gram positividade ou Gram negatividade, teremos informações referentes à natureza química da parede celular e do seu comportamento frente aos agentes antimicrobianos (antibióticos, corantes, etc.). 47 COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN: A Evidenciação de Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAARs) Certas bactérias, como o bacilo da tuberculose e da hanseníase, dificilmente tomam as cores da anilina, mas uma vez coradas por técnicas apropriadas fixam fortemente o corante, a ponto de resistir à ação de descorantes como o álcool e ácidos minerais fortes e diluídos. Daí o uso corrente do método de Ziehl-Neelsen ou de suas numerosas modificações para identificação das bactérias, que assim se comportam e por isso são chamadas Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). Para vencer a resistência à coloração, aumenta-se a concentração do ácido fênico (mordente) da solução corante, prolonga-se a exposição ao corante (5 a 10 minutos) e aplica-se o calor (aquecimento) durante o tempo de coloração. No descoramento são usados o álcool e soluções de ácidos minerais, tais como o ácido nítrico, sulfúrico ou clorídrico. O fenômeno de ácido-álcool resistência é atribuído à presença de um alto teor de lipídeos, sobretudo na parede celular, que se opõe à penetração do corante. Composição dos Reativos Usados no Ziehl-Neelsen • Fucsina fenicada � Fucsina básica 0,3 g � Álcool 95o 10 mL � Fenol fundido 5 mL � Água destilada 95 mL Observação: em outras colorações usa-se o fenol aproximadamente em quantidade 5 vezes maior. • Diferenciador � Álcool etílico 95o 99 mL � Ácido clorídrico 1 mL • Corante de fundo � Solução de azul de metileno. 48 Técnica 1. Fixar o esfregaço pelo calor. 2. Cobrir com fucsina de Ziehl e aquecer até o desprendimento de vapores, a partir deste momento, contar 5 minutos. Não ferver nem deixar secar. Quando cessar a emissão de vapores, aquecer a lâmina novamente. 3. Lavar com água. 4. Descorar com álcool ácido, até não sair mais o corante. 5. Lavar com água. 6. Corar com azul de metileno, 1 minuto. 7. Lavar, secar. Os bacilos álcool-ácido resistentes aparecem em cor vermelha, cor da fucsina, e os outros elementos coram-se em azul, cor do azul de metileno (no caso do escarro: cocos, outros bacilos, leucócitos, células epiteliais, filamentos de muco, etc.). COLORAÇÕES DE ESPIROQUETAS Os espiroquetas são microrganismos muito delgados (a maioria tem cerca de 0,2 µm de espessura), helicoidais, de corpo flexuoso e deformável durante o movimento. A maior parte cora-se com dificuldade, devido à natureza lipídica das estruturas mais superficiais:
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