DNA e Métodos - Diagnóstico Molecular de Doenças Infecciosas

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Aplicações do Diagnóstico Molecular: 
• Câncer 
• Doenças genéticas 
• Análise forense 
• HLA – transplantes 
• Farmacogenômica e Teragnóstico 
• DIP (~ 80%). 
Doenças com diagnóstico demorado, por 
métodos indiretos, caros, ou sem diagnóstico 
laboratorial 
-> Culturas de alto risco: Francisella tularensis 
(febre dos coelhos), Brucella species, 
Coccidioidis immitis (coccidiomicose, BSL-3) 
• Diagnóstico sensível de fase aguda 
• Discriminação de infecção passada 
• Sem reatividade cruzada. 
 
Etapas do Diagnóstico Molecular em 
doenças infecciosas 
Extração; 
Amplificação; 
Detecção. 
Extração do DNA 
Tampão de lise: 
Proteinase K 
Detergentes 
Purificação: 
Fenol/Clorofórmio 
Salting-out 
 
Detecção dos produtos de PCR: Eletroforese 
em gel de agarose. 
Sensibilidade da PCR: 1 célula por volume de 
amostra. 
 
 
PCR Multiplex 
Detecção simultânea de mais de uma 
sequência alvo 
Compatibilidade dos pares de primers 
Produtos amplificados de tamanho diferente, 
entre 100-500 bp (na detecção por 
eletroforese) 
Redução dos custos 
Padronização mais complexa 
Captura Híbrida: O sistema da Captura 
Híbrida® é uma amplificação do sinal usando 
captura por anticorpo e detecção por sinal 
quimioluminescente. Os passos básicos da 
Captura Híbrida® são os seguintes: 
Liberação dos ácidos nucleicos As amostras 
clínicas são combinadas com uma solução 
alcalina que lisa virus ou bactérias a libera o 
DNA alvo. Não são necessárias preparações 
especiais da amostra. 
Hibridação de sondas de RNA com o DNA alvo 
O DNA alvo é combinado com as sondas de 
RNA criando híbridos RNA:DNA. 
 Captura dos Híbridos Inúmeros híbridos 
RNA:DNA são capturados em uma fase sólida 
DNA e Métodos 
 
Diagnóstico Molecular das Doenças Infecciosas 
sensibilizada com anticorpos anti híbridos 
RNA:DNA. 
 Marcação Os híbridos RNA:DNA capturados 
são detectados com vários anticorpos 
conjugados à fosfatase alcalina. O sinal 
resultante pode ser amplificado ao menos 
3000 vezes. 
Detecção A fosfatase alcalina é detectada com 
o substrato quimioluminescente dioxetano. A 
luz produzida é medida em um luminometro 
em Unidades Relativas de Luz (RLUs). 
 
Métodos isotérmicos com dupla 
desnaturação enzimática e alinhamento de 
primer 
RPA: Um complexo primer/recombinase 
detecta dsDNA  E permite a ligação do primer 
 Proteínas ligadoras de ssDNA estabilizam a 
ligação. 
HDA: Uma helicase desnatura o DNA. E 
permite a ligação do primer. Proteínas 
ligadoras de ssDNA estabilizam a ligação. O 
restante ocorre como o PCR convencional. 
 LAMP: 6 sítios de reconhecimento do DNA 
alvo, 4 primers. O Amplicon é deslocado pelo 
primer de fora (outer). A extremidade 5' dos 2 
primers de dentro (inner) reconhece 
sequências no amplicon gerando estruturas 
em altere (dumbbell). 
Técnicas Análogas ao NASBA: Self-Sustained-
Sequence Replication (3SR). Transcription 
Amplification System (TAS). Transcription-
Mediated Amplification (TMA). 
 
Real time PCR 
Detecção: • SYBR Green e outros • Sonda linear 
• Sonda TaqMan • Molecular beacon. 
 
Epidemiologia Molecular 
DNA fingerprinting: Sondas que detectam loci 
múltiplos. Alec Jeffreys et al., 1985, Inglaterra. 
Sequências do íntron da mioglobina.