1a Avaliação 2022 1

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SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA, BIOTECNOLOGIA E ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS - UFSJ 
Separação e Purificação de Produtos Biotecnológicos 
1ª Atividade Avaliativa – 2022 / 1 Valor = 25 
Valor = (alunos matriculados em RER 
/ Regime Especial) = 35 
Nome: 
 
Nota: 
Disponibilizada: 20/05/2022 às 17:30 , horário de Brasília 
Data limite para envio: 23/05/2022 às 17:30 horas, horário de Brasília 
Atenção: 
1. Analise as figuras e leia atentamente o que a questão está solicitando. 
2. Gentileza, responder dentro da área demarcada para tal fim. Utilize os retângulos para 
responder. 
 
3. Respostas fora da área demarcada não serão corrigidas. 
 
4. Cada questão terá um máximo de palavras que poderá ser utilizada na sua resolução. 
Fique atento para não ultrapassar o limite máximo de palavras estabelecido para 
cada questão. As palavras excedentes não serão incluídas na correção. 
 
 
5. As questões deverão ser resolvidas na ordem! E o enunciado das questões não 
deverá ser apagado, ele deverá constar na resolução enviada para correção. 
 
6. Conforme o plano de ensino, as avaliações deverão ser enviadas exclusivamente via 
portal didático. Não poderão ser enviadas como rascunho! Atente-se ao prazo para 
a entrega da avaliação. Certifique-se de anexar o arquivo correto. Não será 
permitido envio após o término do prazo, em hipótese alguma. 
 
 
7. Avaliações enviadas para o e-mail da docente não serão corrigidas. 
 
8. Atenção ao anexar o arquivo, certifique-se de que o arquivo enviado é o correto. 
 
 
9. Apenas justificativas técnicas serão consideradas. Falta de verba, falta de tempo, erro 
experimental, troca de reagentes não são justificativas plausíveis. 
 
10. Cite as fontes consultadas para responder as questões, não esqueça de: i) Reescrever 
com suas próprias palavras, ii) Utilizar o tempo verbal adequado, iii) Avaliar 
criticamente a informação, iv) Sempre citar a fonte. 
 
 
11. Reflita sobre o que você leu na literatura, responda com suas palavras de forma 
objetiva e com informações pertinentes a questão. Utilize linguagem clara, objetiva 
e empregue corretamente os termos técnicos. 
 
12. Caso haja respostas iguais” as questões serão anuladas. “iguais” significam respostas 
com semelhanças significativas, como: A mesma frase escrita trocando a ordem do 
sujeito e predicado, será considerada igual, apenas a ordem foi invertida. 
 
13. A interpretação das questões faz parte da avaliação. Nenhuma dúvida será esclarecida 
durante o período determinado para a realização da avaliação. Caso alguma questão 
não tenha sido formulada corretamente, ela será anulada e o valor correspondente a 
questão será redistribuído igualmente entre as demais questões da avaliação. 
 
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SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS 
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA, BIOTECNOLOGIA E ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS - UFSJ 
 
Questão 01. Você está trabalhando no desenvolvimento do processo de purificação de 
um biopolímero hidrofóbico, insolúvel em água, produzido e armazenado no citoplasma 
da bactéria Gram positiva XTM 94 . O objetivo do protocolo é extrair o biopolímero e 
duas enzimas; sendo uma enzima intracelular e a outra enzima ligada a membrana 
celular da bactéria. Para escolher as melhores condições de extração do biopolímero e 
das duas enzimas foram realizados alguns experimentos, conforme apresentado na 
Figura 1.1. 
 
Figura 1.1 Fluxograma dos métodos de rompimento celular utilizados para romper a bactéria XTM 94 e 
extrair as biomoléculas: Biopolímero, proteína e proteína ligada á membrana. Recuperação obtida para 
cada um dos dois métodos de rompimento para as três biomoléculas de interesse. Os resultados 
apresentados para concentração de células viáveis, proteína total, e biopolímero foram realizados no 
homogeneizado celular, ou seja no material obtido após o rompimento celular. 
 
Os experimentos de rompimento celular utilizando o moinho de bolas e o método 
químico foram realizados conforme descrito na literatura. Os parâmetros que afetam o 
rompimento celular foram considerados e escolhidos corretamente pela equipe 
envolvida no desenvolvimento do protocolo. 
Ao analisar os resultados obtidos na Figura 1.1, o Gestor da equipe pediu para melhorar 
a extração do biopolímero e das duas enzimas. A equipe se reuniu e discutiu como 
melhorar a extração das três biomoléculas de interesse. Foi decidido que as células 
seriam submetidas a uma etapa de permeabilização celular, utilizando enzimas antes de 
serem submetidas ao rompimento celular. 
Resultados obtidos a 
partir do material 
resultante do rompimento 
celular 
90 
 
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Figura 1.2 Fluxograma utilizando o método de permeabilização enzimática anterior aos métodos de 
rompimento celular mecânico e químico utilizados para romper a bactéria XTM 94 e extrair as 
biomoléculas: Biopolímero, proteína e proteína ligada á membrana. Recuperação obtida para cada um dos 
dois métodos de rompimento para as três biomoléculas de interesse. Os resultados apresentados para 
concentração de células viáveis, proteína total, e biopolímero foram realizados no homogeneizado 
celular, ou seja no material obtido após o rompimento celular. 
 
 
Considere que todos os parâmetros empregados no método mecânico, químico e 
enzimático foram corretos, as enzimas não desnaturaram durante o processo, e o 
método para quantificação do biopolímero e proteína total foram realizados 
adequadamente e os resultados estão corretos. A porcentagem de proteína total foi 
calculada levando em consideração a massa total de proteína da bactéria XTM94. 
Após analisar, atentamente, os dados da Figura 1.2, o gestor solictou que vocês 
utilizassem um detergente não iônico no tampão de lise celular. Ele disse para vocês 
verificarem na literatura a faixa de concentração do detergente aniônico utilizada para 
este fim e refazerem o rompimento celular. Ele pediu que novo experimento utilizasse 
o melhor método de rompimento celular, aquele que foi mais efetivo para o 
rompimento celular. Ainda de acordo com o gestor, o novo tampão de lise utilizado, 
provavelmente, não aumentará a taxa de rompimento celular, mas favorecerá a 
recuperação do biopolímero e da enzima ligada à membrana. 
Questão 1.2 - Qual método apresentou maior eficiência de rompimento celular? (0,5 
ponto) Qual ou quais dados permitem concluir que este método é mais eficiente para o 
rompimento celular? (4,5 pontos) 
 
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Número máximo de palavras = 200 
 
Um dos seus colegas de trabalho, após deixar a sala do gestor , lhe pediu para explicar: 
Questão 1.2 Por que a adição do surfactante não iônico irá melhorar a extração do 
biopolímero e da proteína adsorvida à membrana? Descreva o mecanismo pelo qual o 
novo tampão de lise irá aumentar a recuperação das duas biomoléculas citadas 
anteriormente? (5 pontos) 
Número máximo de palavras = 200 
 
Questão 2 Você estava participando de uma reunião para discutir as melhores condições para purificar um 
lipopolissacarídeo obtido a partir do cultivo submerso de uma nova espécie de fungo filamentoso. Uma das 
propostas apresentadas foi utilizar um sistema de duas fases aquosas formadas por etanol e Na2HPO4. A 
Figura 2.1 apresenta as fases do sistema. 
 
Figura 2.1 Diagrama de fases do sistema formado por etanol e Na2HPO4 . 
 
a) Após a proposta de utilizar um sistema formado por etanol e Na2HPO4, foi questionado 
o seguinte: Um sistema de duas fases aquosas pode ser formado a partir de etanol e 
Na2HPO4? (0,5 ponto) Justifique (valor 4,5 pontos). 
Número máximo de palavras = 200 
 
Questão3 Anticorpos monoclonais são medicamentos utilizados para o tratamento de 
diversas doenças como câncer e doenças autoimunes. Você está trabalhando no 
processo de purificação de um anticorpo monoclonal humanizado TP a partir do cultivo 
de células CHO. O anticorpo TP é expresso e secretado pela célula para o meio de cultivo. 
A operação unitária utilizada para clarificar o anticorpo TP, foi o sistema aquoso de duas 
 
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fases formado por sal e polietilenoglicol. O sistema aquoso de duas fases foi formado 
utilizando polietilenoglicol 5000 e fosfato monobásico de sódio. Diferentes condições 
utilizando diferentes concentrações de NaCl e pH, pH 6 e 8 foram testadas para verificar 
a melhor condição. O coeficiente de partição (Kp) do anticorpo monoclonal TP foi 
calculado. A Figura 3.1 apresenta o Log Kp obtido nas diferentes condições utilizadas. 
 
 
Figura 3.1 Influência do pH e da concentração de NaCl na extração do anticorpo monoclonal TP utilizando 
o sistema de duas fases aquosas formado por PEG 5000 e tampão fosfato de sódio. Retângulos preto 
representam o sistema de duas fases com pH 6,0, e retângulos cinza representam o sistema de duas fases 
aquosas com pH 8,0. 
 
A) De acordo com a Figura 3.1, qual foi a melhor condição, pH e força iônica, para 
purificar o anticorpo TP (0,5 pontos)? Justifique (4,5 pontos) 
Número máximo de palavras = 200 
 
B) Para qual fase o anticorpo monoclonal TP migrou? (0,5 pontos) Como você concluiu 
isto? Justifique utilizando, Apenas, os dados da Figura 3.1. (valor 4,5 pontos). 
Número máximo de palavras = 200 
 
C) De acordo com os dados da figura 3.1 a adição de NaCl ao sistema favoreceu a 
migração do anticorpo monoclonal para qual fase? (0,5 pontos) Justifique (4,5 pontos) 
Número máximo de palavras = 200 
 
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D) Explique o provável mecanismo pelo qual o NaCl exerceu o efeito na partição do 
anticorpo monoclonal (5,0 pontos) 
Número máximo de palavras = 100 
 
E) Utilizando os dados do enunciado da questão e as respostas ao questionamento 
desenvolva o fluxograma de purificação do anticorpo monoclonal TP, desde o cultivo 
celular até o final do sistema aquoso de duas fases. Uma parte do fluxograma já foi 
apresentado na figura abaixo. Você deverá finalizar o fluxograma utilizando os 
retângulos à direita, informe em qual fase estará presente o anticorpo monoclonal TP. 
(valor 5,0 pontos) 
 
Apenas finalize o fluxograma 
 
Questão 04 Você está desenvolvendo um protocolo para purifica a enzima XTZ, 
conforme a literatura a enzima é uma hidrolase com massa molar de 45 kDa, ponto 
isoelétrico 7,0, a faixa de pH de estabilidade da enzima é de 5 a 9,0, a temperatura de 
estabilidade é de 20 a 40 oC. A enzima foi expressa em Escherichia Coli, e a localização 
da enzima é intracelular. O cultivo foi realizado em biorreator com agitação mecânica e 
regime de alimentação batelada alimentada. As células foram recuperadas utilizando a 
microfiltração tangencial, e após a recuperação a lise foi efetuada utilizando o 
homogeneizador de alta pressão e o tampão de lise escolhido foi o tampão fosfato de 
sódio 50 mM pH 8,0. A precipitação utilizando sulfato de amônio foi escolhida para 
clarificar a enzima XTZ. Como você não sabia a concentração de sulfato de amônio 
necessária para precipitar a enzima XTZ. Você realizou uma extensa pesquisa 
bibliográfica. A literatura, descreve o seguinte protocolo para precipitação da enzima 
XTZ a partir do extrato celular, Quadro 3.1. 
 
 
 
 
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Quadro 3.1 Procedimento descrito na literatura para precipitar a enzima XTZ 
 
A enzima XTZ foi extraída a partir de cultivo de Escherichia coli utilizando tampão fosfato de sódio 50 
mM pH 7,0 e homogeneizador de alta pressão. O material proveniente do rompimento celular foi 
centrifugado e o sobrenadante foi denominado de extrato bruto. O extrato Bruto foi submetido a 
precipitação fracionada com sulfato de amônio. Foram utilizadas duas concentrações de sulfato de 
amônio 30 e 80%. A quantidade de sal necessária para atingir a concentração de 30% foi adicionada ao 
extrato bruto, homogeneizado e mantido em agitação a 20 oC durante 6 horas. Decorrido o tempo, a 
mistura foi centrifugada (10.000 x g, 20 min, 4 oC). O precipitado foi separado do sobrenadante, e 
ambos foram denominados precipitado 1 e sobrenandante 1, respectivamente. Ao sobrenadante 1 foi 
adicionado a quantidade de sulfato de amônio necessária para atingir a concentração de 80%. Essa 
mistura foi homogeneizada e mantida em agitação a 20 oC durante 6 horas. Ao término do tempo, a 
mistura foi centrifugada (10.000 x g, 20 min,4 oC). O precipitado e sobrenadante obtidos a partir desta 
etapa foram denominados de precipitado 2 e sobrenadante 2. A Tabela 3.1 apresenta a recuperação 
da enzima XTZ. 
 
Tabela 3.1 Atividade enzimática total da enzima XTZ obtida durante a precipitação com sulfato de 
amônio. 
Amostra Atividade enzimática total Proteína total 
Extrato bruto 10.000 500.000 
Sobrenadante 1 9.900 450.000 
Precipitado 1 100 50.000 
Sobrenadante 2 350 5.000 
Precipitado 2 9.500 445.000 
 
 
Após analisar os dados da literatura você decidiu realizar a centrifugação conforme 
descrito na literatura, Quadro 3.1. Brevemente, o extrato celular obtido por você 
(10.000 L) foi precipitado com 30 e 80% de sulfato de amônio, cada etapa da 
precipitação foi realizada durante 6 H a 20 oC. Os precipitados foram separados do 
sobrenadante utilizando as mesmas condições da centrifugação descritas na literatura 
(10.000 x g, 20 min, 4 oC). A concentração de proteína e atividade enzimática específica 
das amostras foram calculadas e a partir destes dados foram determinadas a atividade 
enzimática total e proteína total. As análises foram realizadas corretamente. Os dados 
obtidos estão apresentados na Tabela 3.2. 
Tabela 3.2 Atividade enzimática total da enzima XTZ obtida durante a precipitação com sulfato de amônio, 
obtida por você durante o experimento 
Amostra Atividade enzimática total Proteína total 
Extrato bruto 10.000 500.000 
Sobrenadante 1 9.950 495.000 
Precipitado 1 50 5.000 
Sobrenadante 2 4.500 490.000 
Precipitado 2 4.000 5.000 
 
A) A partir dos dados da questão e da teoria de precipitação por salting out, calcule a 
quantidade de sulfato de amônio para cada uma das precipitações utilizadas por você a 
partir do volume de extrato bruto utilizado (conforme descrito no enunciado da 
 
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questão). Considere que o sobrenadante 1 sofreu um acréscimo de 15 em relação ao 
volume do extrato bruto. Atenção!! deixe TODOS os cálculos REALIZADOS POR VOCÊ de 
forma clara e organizada. Respostas apenas com a quantidade final não serão 
CONSIDERADAS. (valor 5 pontos) 
Apresente os cálculos de forma organizada e completa 
 
B) Considerando que não houve erro de procedimento durante o processo de 
precipitação, e quantificação da atividade enzimática e proteínas totais, ou seja, o 
resultado obtido e apresentado na Tabela 3.2 está correto. Como você pode explicar o 
resultado apresentado na Tabela 2, com base no mecanismo de precipitação por salting 
out? (valor 5 pontos) 
Número máximo de palavras = 200