3 - Crescimento_microbiano

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CRESCIMENTO 
MICROBIANO
• Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados
• Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas
• Outros são tão exigentes quanto o homem
• Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário 
o cultivo em laboratório:
- Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais
- Cultivo in vivo: quando não se conhece as exigências nutricionais
Exemplo de microrganismos que precisam de hospedeiro para ser cultivado: 
- Mycobacterium leprae (causador da hanseníase)
- Glomus clarum (fungo simbionte)
Microrganismos e exigência nutricional
 Cultivo in vitro (laboratorial): são utilizados meios de cultura que simulam 
e até melhoram as condições naturais.
 Macronutrientes: principais elementos químicos para o crescimento das 
células são denominados (C, N, H, O, S, P).
 O carbono é um dos elementos mais importante para o crescimento 
microbiano.
MACRO E MICRONUTRIENTES
Compostos orgânicos: são os que contém carbono
Exceção - CO2
Macronutrientes: 
- Necessários em grande quantidade. 
- Tem papel importante na estrutura e metabolismo.
Micronutrientes: 
- Necessários em quantidades mínimas.
- Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas
Matéria seca
Água
C
N
H
P, S, K, Na ...
célula
MACRO E MICRONUTRIENTES
MACRONUTRIENTES: C, N, H, O, S e P
Fonte de carbono:
- Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):
carboidratos
lipídeos 
proteínas
- CO2 (microrganismos autotróficos): 
É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou de outros
compostos inorgânicos.
 Fonte de Nitrogênio:
- É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.
(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)
moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos)
moléculas inorgânicas (NH3, NO3
-, N2)
• Hidrogênio:
- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e 
gases) 
• Função:
Manutenção do pH
Formação de ligações de H entre moléculas 
Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração
• Oxigênio:
- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, 
glicerídeos)
- É obtido a partir das proteínas e gorduras.
Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de 
energia.
MACRONUTRIENTES: C, N, H, O, S e P
 P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP
 S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas
 K – Estabilidade dos ácidos nucléicos, bomba de Na/K
 Mg – Estabilidade dos ribossomos
 Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos
 Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. 
Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15 % de sal.
 Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das 
proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
Outros macronutrientes:
MACRONUTRIENTES: C, N, H, O, S e P
• Metais em quantidades muito pequenas (traços) na composição de um 
meio de cultura:
Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)
- Nem sempre sua adição é necessária
- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra
pura podem apresentar deficiências desses elementos.
Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte o N2 para NH3
durante a fixação do nitrogênio.
MICRONUTRIENTES
• Água:
- Componente absolutamente indispensável 
(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)
No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.
Outros aditivos:
Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, 
provocar inibição, estabilizar o pH: 
• Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos
EDTA, ácido cítrico, polifosfatos.
• Inibidores
Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger
Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico
ÁGUA E OUTROS ADITIVOS
• Tampões
- Carbonato de cálcio
- Fosfatos
- Proteínas
Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.
Ex: celulose induz a celulase
pectina induz a pectinase
amido induz a amilase 
Antiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma
– Remoção de células, perda do produto, contaminação
– Redução do volume do meio
álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas
ÁGUA E OUTROS ADITIVOS
Classes
Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)
Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, 
leite, solo e rúmem de bovino)
 Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.
 Não existe um meio de cultura universal, e sim vários tipos de
meios para diversas finalidades
 Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário:
 Conhecimento de suas exigências nutricionais;
 Fornecimento de nutrientes - forma e proporção adequada.
MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as 
necessidades nutricionais
Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais.
3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de 
suplementos orgânicos.
Até 1880 os
microrganismos eram
cultivados em meios
líquidos.
Robert Koch introduziu os
meios de cultura sólidos,
os quais permitiram o
estudo de espécies
isoladas (culturas puras).
MEIOS DE CULTURA
• Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem 
centenas de formulações para inúmeras finalidades.
Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies
Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex.
Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey
MEIOS DE CULTURA
Microplacas com diferentes 
meios de cultura para 
identificação de enterobactérias.
MEIOS DE CULTURA
• Normalmente imitam o habitat normal
Ex.
Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado 
no meio de cultura.
Meio definido para quimioautotróficas Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas
MEIOS DE CULTURA
• Todos os fungos são heterotróficos
Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos 
providos pela peptona e extratos de carne ou soja.
Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do 
que os meios para bactérias. 
Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.
MEIOS DE CULTURA
• Os protozoários são heterotróficos aeróbios com exigências 
nutricionais complexas
Muitos não são cultivados in vitro.
Os que são necessitam muitos complementos, como emulsões de tecidos cerebrais, soro 
fetal, infusão de fígado e células bacterianas.
Ex: Tetrahymena pyriformis necessita de um meio contendo 10 aminoácidos, 7 vitaminas e 
sais inorgânicos.
Tetrahymena pyriformis não é patogênico 
mas é utilizado em pesquisas médicas e 
biológicas. 
MEIOS DE CULTURA
MEIOS ESPECIAIS
 Meios para anaeróbios: adição de agentes redutores (tioglicolato de sódio)
 Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros.
Ex. meio ágar verde brilhante para salmonella
 Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista.
Ex. meio com sangue para distinguir as hemolíticas.
 Meios seletivos/diferenciais: ao mesmo tempo seletivo e diferencial, útil em saúde 
pública e em diagnóstico deinfecção
Ex. Meio McConkey que contém sais de bile e cristal violeta.
 Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espécie 
sem inibir as demais. 
Ex. isolar bactérias que oxidam fenol, fornecendo fenol como única fonte 
de carbono.
MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
seletivo
DIFERENCIAL
SELETIVO E DIFERENCIAL
MacConkey – inibe G+ (seletivo), G-
(fermentadora ou não – diferencia)
FATORES FÍSICOS:
 Temperatura
 Oxigênio 
 pH
 Pressão osmótica
 Radiação eletromagnética
CONDIÇÕES AMBIENTAIS
Temperatura
Grupos
1. Psicrófilos – temperatura ótima abaixo de 
15 oC, suscetíveis de crescer a 0 oC.
2. Mesófilos – temperatura ótima 20o - 40 oC, 
maioria dos patógenos humanos. 
3. Termófilos – temperatura ótima acima de 
45 oC.
A velocidade de crescimento duplica a 
cada aumento de 10 ºC.
CONDIÇÕES AMBIENTAIS
Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio 
aerotolerante
oxigênio e o crescimento microbiano
Meio gelatinoso com 
indicador redox:
Rosa quando oxidado
Incolor quando reduzido
Durante as reações de redução do O2 
são formados vários intermediários 
tóxicos.
Ex: H2O2, OH°, O2
-
Os microrganismos aeróbios e 
facultativos utilizam enzimas como a 
catalase para destruir as formas 
tóxicas
CONDIÇÕES AMBIENTAIS
CONDIÇÕES AMBIENTAIS
Sistema para cultivo de anaeróbios
CONDIÇÕES AMBIENTAIS
Sistema para cultivo de aeróbios
Equipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura
CONDIÇÕES AMBIENTAIS
pH
• Ao contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento encontra-
se no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá,
• Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto 
em todas as condições de pH.
• Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os 
metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos.
- Necessário a adição de um tampão ao meio.
CONDIÇÕES AMBIENTAIS
Pressão osmótica
• Não devem existir grandes diferenças na 
concentração de solutos dentro e fora da 
célula, pois podem desidratar-se ou 
romper-se.
Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores 
de sais mais elevados.
CONDIÇÕES AMBIENTAIS
– PADRÃO DE CRESCIMENTO
• Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células 
• Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão
Varia de minutos até dias
Depende muito das condições ambientais
CRESCIMENTO MICROBIANO
O padrão de crescimento é o exponencial
CRESCIMENTO MICROBIANO
O ciclo de crescimento
• A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma 
população microbiana
• O crescimento de microrganismos apresenta um ciclo típico com todas as 
fases de crescimento.
CRESCIMENTO MICROBIANO
1) Fase Lag
Período de adaptação da cultura
• Mudança de meio, preparação do complexo enzimático
• Reparação das células com danos.
2) Fase exponencial
Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo.
• A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as 
velocidades de crescimento são bastante variáveis:
- Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos
- Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores
CRESCIMENTO MICROBIANO
3) Fase estacionária: 
Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial não 
pode ocorrer indefinidamente.
• Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos.
Divisão = morte → crescimento líquido nulo
Ainda pode ocorrer catabolismo e produção de metabólitos secundários
4) Fase de morte (declínio):
• A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as 
células ao processo de morte.
A morte celular é acompanhada da lise celular
CRESCIMENTO MICROBIANO
Avaliação ou Quantificação ou Medida do Crescimento:
• Podem ser realizadas pelos seguintes métodos:
1) Peso seco total das próprias células
filtração, secagem e pesagem
2) Peso de algum componente celular
extração, secagem e pesagem
3) Variação no número de células
a) contagem de células totais (direta)
b) contagem de células viáveis (indireta)
CRESCIMENTO MICROBIANO
• Vantagens: método rápido e fácil
• Desvantagens:
Não distingue as células vivas das mortas
Pode-se omitir células pequenas
Células móveis precisam ser imobilizadas
CONTAGEM
Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada)
Ex.: Câmara de Neubauer
CRESCIMENTO MICROBIANO
CONTAGEM DAS CÉLULAS VIÁVEIS
Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.
CRESCIMENTO MICROBIANO
São empregadas várias diluições decimais 
porque é difícil prever o número de viáveis.
É contada a placa com 30 a 300 colônias
• Diluição das suspensões celulares
Amostras concentradas precisam ser diluídas
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO - Outros métodos
- Turbidimetria
As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio
Pode ser medida com um espectrofotômetro
• O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão
Turbidez X quantidade de células
CRESCIMENTO MICROBIANO
- Contagem eletrônica
CRESCIMENTO MICROBIANO