Preparação de amostras para microscopia

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Etapas 
O processamento inicia-se a partir de amostras biológicas 
recém-coletadas e termina com essas amostras desidratadas, 
preservadas em estado estático e prontas para serem 
visualizadas. 
1) Fixação 
É o processo de preservação células e tecidos. A fixação 
química é um dos métodos de fixação mais utilizados. As 
soluções fixadoras são compostos químicos que reagem com 
as estruturas celulares e teciduais, preservando-as para evitar 
a degradação celular como a digestão por bactérias 
decompositoras. Portanto, a fixação tem por objetivo manter a 
mesma organização estrutural apresentada in vivo e minimizar 
o aparecimento de detalhes que não sejam da estrutura 
normal. 
 
O glutaraldeído tem grande habilidade de formar ligações 
cruzadas irreversíveis com proteínas, logo, a solução mostra-se 
eficaz em estabilizar estruturas celulares. No entanto, a taxa 
de penetração do glutaraldeído é baixa, dessa forma, é 
importante que os tecidos sejam cortados em pequenos 
fragmentos. 
O tempo de fixação primária é variável, por exemplo: a fixação 
de suspensões celulares pode ser feita em apenas 30 minutos, 
enquanto fragmentos de tecidos requerem um tempo maior. 
O tetróxido de ósmio atua como fixador secundário para 
microscopia eletrônica por meio de sua reação com moléculas 
de lipídios. 
2) Desidratação 
A etapa tem como objetivo a retirada de água do material 
biológico. A desidratação de amostras para microscopia de luz 
é feita por imersão do material em uma série de álcoois 
graduados. Para microscopia eletrônica, podem ser utilizados, 
além do álcool, acetona ou óxido de propileno. 
 
3) Diafanação 
Também conhecida como clareamento, é necessária apenas na 
preparação de amostrar para microscopia de luz, a qual usa 
parafina ou paraplast. Tem como objetivo retirar o álcool da 
amostra e para isso são utilizados solventes com densidade 
maior que o álcool, como o xilol. 
4) Inclusão 
A amostra é imersa em um molde contendo o meio de inclusão 
em estado líquido que, ao se solidificar, forma um bloco 
contendo o material. A inclusão para microscopia de luz é feita 
em parafina ou paraplast, mas também são usadas resinas 
plásticas. Para a microscopia eletrônica, são utilizadas resinas 
epóxi. 
Tanto para microscopia de luz quando para a eletrônica, a 
inclusão é precedida por uma etapa denominada infiltração, 
quando o material fica imerso em uma mistura do meio de 
inclusão com solvente, facilitando a etapa de inclusão. Após a 
polimerização do meio de inclusão em estufa, o molde é 
retirado, obtendo-se um bloco que contém o espécime incluído. 
 
5) Microtomia e ultramicrotomia 
A etapa de microtomia consiste na obtenção de cortes 
delgados, com espessura apropriada para observação do 
material biológico. 
Para microscopia de luz, utiliza-se o micrótomo, equipamento 
que gera cortes com espessura da ordem de micrômetros. A 
espessura obtida é geralmente 5 micrômetros para a parafina 
ou paraplast e 1-3 micrômetros para resinas plásticas. As 
secções são coletadas em lâminas de vidro e coradas. 
Para microscopia eletrônica, são utilizadas duas etapas: 
i) o material é cortado em micrômetro convencional obtendo-
se cortes com espessura de 1 micrômetro, denominados cortes 
semifinos. Os cortes são coletados, montados, corados e 
observados em ML para escolha da área de interesse. 
ii) o bloco é preparado para a ultramicrotomia, esculpido no 
formato de um pequeno trapézio, com a face que contém a 
Soluções
Microscopia de luz
Formaldeído, ácido acético, 
ácido pícrico, formol, 
bicloreto de mercúrio e 
dicromato de potássio.
Microscopia 
eletrônica
Fixador primário: glutaraldeído
Fixador secundário: tetróxido 
de ósmio.
área de interesse pronta para os cortes em um ultramicrótomo. 
O equipamento utilizado gera cortes com 80 nanômetros de 
espessura chamados de cortes ultrafinos, que são coletados 
em grades de metal. 
6) Coloração/contrastação 
É necessário o uso de corantes para materiais processados 
para microscopia de luz, logo, uma vez obtidos os cortes em 
lâminas, estes são corados. Amostras incluídas em 
parafina/paraplast devem passar por desparafinização antes da 
coloração para que o corante possa penetrar na célula. 
Após a coloração, os cortes são cobertos por lamínula de vidro, 
a qual é fixada com um meio adequado. Após a secagem, as 
lâminas estão prontas para serem analisadas ao microscópio 
de luz. 
Para microscopia eletrônica, são utilizados metais pesados que 
proporcionam maior contraste, numa etapa conhecida como 
contrastação. As técnicas têm por finalidade acentuar as 
diferenças de densidade das estruturas subcelulares, gerando 
imagens elétron-densas ou elétron-lúcidas. As substâncias mais 
aplicadas são o acetato de uranila e o citrato de chumbo. 
Interpretação das secções observadas ao microscópio 
Dependendo do plano de corte, são mostrados aspectos 
morfológicos diferentes da mesma amostra. Em trabalhos de 
pesquisa, os cortes seriados (microtomia sequencial de todo o 
fragmento) ou semisseriados (em intervalos regulares) são 
muito utilizados no estudo da morfologia das células e tecidos 
em condições normais e patológicas. Além disso, análises 
morfométricas podem ser realizadas em cortes seriados ou 
semisseriados com o objetivo de quantificar, por exemplo, 
células em degeneração, tipos celulares infiltrados em 
processos inflamatórios e distribuição de patógenos em 
materiais infectados.