RELATÓRIOS PRIMERS, PCR E SEQUENCIAMENTO

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UNIVERSIDADE ESTADUAL 
DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA 
GRADUAÇÃO BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
DISCIPLINA METODOLOGIA BÁSICA 1/2022 
Campos-RJ 
Junho, 2022. 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIOS DE AULA PRÁTICA: 
CONSTRUÇÃO DE PRIMERS 
REAÇÃO EM CADEIRA DA POLIMERASE (PCR) 
SEQUENCIAMENTO 
 
 
 
 
 
 
 
AMANDA MELLO DA SILVA OLIVEIRA 001161203353 
 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório um: 
CONSTRUÇÃO DE PRIMERS 
INTRODUÇÃO 
 Os avanços tecnológicos proporcionou a formação de áreas da biologia que utilizam 
informática para ampliar as pesquisas na área. Com a bioinformática, hoje é possível obter 
dados online referentes a sequencias de DNA e proteínas através de sites criados com o 
objetivo de serem bancos de dados que podem ser acessados por diferentes pessoas de forma 
remota, como o GenBank (NCBI). O site, além de armazenar dados de genes de interesse, 
agrupa informações associadas sobre o gene pesquisado. O gene de interesse para essa 
pesquisa foi gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), uma proteína codificada conhecida por seu papel 
fundamental na via glicólise e gliconeogênese. 
 
METODOLOGIA 
Sem Regiões Conservadas 
Buscar a sequencia de interesse e construir primers. 
 Buscar a sequência no site GenBbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) 
 Sequência utilizada: GAPDH 
 Entrar no site NCBI Reference Sequence Database e pesquisar a sequência escolhida. 
 
 Fazer a escolha do modelo experimental, para esse relatório foi escolhida a sequência 
Homo sapiens gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), variante de transcrição 
3. mRNA 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
 
 
 Ao selecionar o modelo, clicar em FASTA para obter a sequencia do gene e assim salvar 
as informações em um documento word. 
 
 
 Entrar no site Primer3Plus ( https://www.primer3plus.com/index.html) 
 Colar a sequencia obtida na área adequada. Certificar que em Tasks está selecionado 
generic e na área Sequencia ID colocar o nome do primer, nome escolhido “Primer 
Metodologia.” 
 
 
https://www.primer3plus.com/index.html
 
 
 Na barra “General Settings” colocar as seguintes configurações: 
- Product Size Ranges: 500-1500 (Pois a sequencia escolhida possui 1377 pb) 
- Primer Size: min 18, Opt 20 e máx 38 
As configurações restantes foram mantidas com os dados já fornecidos pelo site. 
Em seguida, clicar em “Pick Primers”. 
 
 
 
Left Primer 1 – Primer Foward 
 
Start: Posição onde começa o primer. 
Length: Tamanho do primer. 
Tm: Temperatura Melting 
Any: Qualquer estrutura secundária que possa ser formado com ele mesmo ou outro primer. 
End: Estrutura secundária na extremidade 3’, como o primer escolhido não forma estrutura 
secundária, fica 0. A partir da extremidade 3’ que DNA polimerase inicia a adição de 
nucleotídeo, caso houvesse alguma estrutura secundária poderia ocorrer a perda da eficiência 
do PCR. 
TB: Ligação em qualquer região não especifica do template. Valor em questão é considerado 
baixo, caso contrário o Primer3 não desenharia esse primer. 
HP: Hairpin, a estrutura secundária do primer se anelando a ele mesmo. 
3’ Stab: Valor de estabilidade da extremidade 3’. 
Penalty: Valor de penalidade, um score do prime desenhado. Quanto menor, melhor. 
 
Right Primer 1 – Primer Reverso 
 
 
O PCR é realizado com o fragmento Foward (azul) e Reverso (amarelo). Após identificar, basta 
copiar e colar ambos os fragmentos em um documento word e realizar o pedido para o 
fornecedor. 
Left Primer: GATTTGGTCGTATTGGGCGC 
Right Primer: CCACAGTCCATGCCATCACT 
 
 
 
Regiões Conservadas 
Buscar regiões mais conservadas do primer que possui variadas sequências no banco de dados, 
garantindo que o primer desenhado não tenha variação de nucleotídeos nas sequencias. 
 Buscar outra sequencia do mesmo gene alvo no site NCBI. A sequencia escolhida foi 
Homo Sapiens mRNA variante 1. 
 Entrar no site Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uK/Tools/msa/clustalo/) 
 Selecionar “RNA” no campo “Ente ror past a set of” 
 Na caixa “Sequences in any supported format” seguir a seguinte formação. 
 
>sequencia1 
Colar a sequencia que irá ser investigada. 
 
>sequencia2 
Colar a sequencia escolhida do mesmo gene alvo. 
 
Em seguida, clicar em “Submit”. 
 
 
 Ao desenhar o primer para diferentes sequencias de um determinado alvo, o esperado 
é que haja sobreposições entre as sequencias. 
 
Sequencia alinhada 
 
Sequencia não alinhada 
 
 
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
 Para selecionar a sequencia de interesse, clique em “Download Alignment File” em 
seguida copia e cola a região alinhada de uma das sequencias em um doc word – a 
sequencia 1 foi selecionada. 
 
 Novamente no site Primer3Plus, copiar e colar a sequencia alinhada, manter as 
configurações e clicar em “Pick Primers”. 
 
Validação in-silico utilizando BLAST do NCBI 
1. Na página do resultado de Primer no Primer3Plus, clicar em “Send selected Primers to 
Primer3Manager”. 
2. Clicar em “BLAST Primer at NCBI” 
 
Em BLAST, o sistema fará a comparação da sequência de primers com o banco de 
dados do NCBI para verificar se há alguma similaridade significativa. 
3. Clicar em “Blast” 
 
 
4. Em “Filter Results” buscar pela espécie de modelo usada. (Homo sapiens) 
 
 
 
Como já era esperado, não foi encontrada nenhuma similaridade significante. 
 
 
Para adquirir o primer do RT-qPCR 
 No site Primer3Plus selecione “qPCR” no campo “Load Server Settings” 
 Cole a sequencia, selecione “Pick hibrydization probe” e mantenha as configurações 
em “General Settings”. 
 
 
 Clique em “Pick Primers” para obter o resultado. 
 
 
Para solicitar os primers de interesse aos fornecedores, clique em “Send select primers 
to Primer3Manager” e em “Order Primers” 
Relatório dois: 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 
 
INTRODUÇÃO 
PCR Convencional 
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica utilizada para amplificar 
moldes de DNA por meio de componentes sintéticos do replissomo de um segmento 
específico do genoma, ou seja, ocorre a criação de múltiplas cópias da amostra de DNA de 
forma in vitro. Para realização do PCR, além do molde do próprio genoma que será estudado, é 
necessária a utilização de iniciadores e polimerases específicos, e nucleotídeos livres. A PCR é 
muito utilizada em pesquisas de laboratórios médicos e biológicos para diagnósticos e 
detecção de doenças hereditárias e infecciosas, sequenciamento de genes, testes de 
paternidade e criação de organismos transgênicos. 
O processo da PCR envolve três etapas: “desnaturação”, onde a sequencia é 
amplificada e desnaturada ao ser aquecida, e também ocorre a separação da dupla fita de 
DNA. Etapa de “anelamento”, nessa fase um primer é utilizado para complementar à fita 
oposta da sequencia de DNA após serem separadas. E por fim, a fase de “extensão” onde a 
DNA-polimerase adiciona bases complementares, formando então uma nova fita. 
 
PCR Real Time (RT - qPCR) 
A Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT - qPCR) é um procedimento 
semelhante a técnica de PCR convencional conhecida, porém possui a vantagem de quantificar 
em tempo real do DNA amplificado em cada ciclo de amplificações. Uma singularidade dessa 
técnica é o uso de um agente fluorescente que permite o monitoramento da reação ciclo a 
cilo. Os resultados obtidos nessa técnica são analisados nas curvas de melting. O 
desenvolvimento da RT – qPCR foi utilizada em vários procedimentos nas áreas da saúde, 
forense e agricultura o que, rapidamente, chamou a atenção de pesquisados que buscaram 
aperfeiçoar ainda mais a técnica. 
 
Diferenças entre PCR convencional e RT – qPCR 
 A PCR convencional tem alta precisão na amplificação de uma sequencia de DNA. No 
entanto há necessidade de conhecer a sequencia que será amplificada para a sintetização dos 
primers específicos. Além disso, possui uma sequenciade amplificação limitada sendo difícil de 
ser aplicada a PCR com sequencias maiores do que 5000pb. 
 Além da amplificação simultânea já mencionada, a RT-qPCR apresenta simplicidade, 
especificidade, rapidez, elevada produção contínua e detecção de quantidades relativamente 
pequenas de DNA alvo. 
Protocolo para RT-qPCR 
1. Iniciar fazendo a limpeza das micropipetas e do fluo com álcool, ligar o fluxo e UV e 
aguardar por 30 minutos. É importante garantir que todas as ponteiras e eppendorfs 
utilizados sejam estéreis, e utilizar luvas sem talco. 
2. Ligar o computador do equipamento de PCR, montar a placa no software, abrir 
protocolo padrão de termociclagem, ligar o equipamento de PCR e aguardar até que 
ocorra o reconhecimento pelo computador. 
3. Fazer a diluição das amostras de cDNA para curva padrão (importante para testar a 
eficiência dos primers) – Retirar sempre 3 µl da concentração inicial e adicionar 27 µl 
de água MilliQ para fazer a amostra diluída 10 vezes, em tudo de 200 µl. 
Estoque a 100 µM: fazer a diluição relacionando à quantidade em nmol, multiplicando 
po 10 vezes, em microlitros de água MilliQ. Ao utilizar o estoque, realizar a diluição 10 
vezes. 
Para o uso a 10 µM: 10 µl de primer estoque a 100 µM + 90 µl de água MilliQ. 
4. Fazer a preparação do Master Mix para PCR 
Cálculo da quantidade de poços necessários: 
 
n = (amostras x diluições x réplicas) + controle negativo (NTC) + 1 (segurança p/viés de 
pipetagem) 
5. Selar a placa e centrifugar rapidamente (dar um spin). Colocar a placa no equipamento 
de PCR e iniciar o protocolo de termociclagem. 
 
1) 50 °C – 2 minutos 
2) 95 °C – 2 minutos (Hot start para ativação da enzima Taq polimerase) 
3) 95 °C – 15 segundos 
4) 60 °C – 1 minuto (Plate read) 
5) “GO TO 3”, “44 more times” (para 44 ciclos) 
6) Melt CURVE: 50 °C – 95 °C; incrementar 0,5 °C por 10 segundos (Plate 
read) 
7) FIM. 
 
Protocolo de PCR convencional realizado na aula prática 
Objetivo 
Amplificar o DNA. 
Materiais e Reagentes 
 Água milq 13,3 µL 
 Cloreto de Magnésio 1,5 µL 
 Tampão da própria enzima - 10 vezes 
 Primer f/r - 10 µM 
 Taq Polimerase - 25 µM 
 Amostra CDNA 
 dNTP - 10 µM 
 Eppendorf 
 Vórtex 
 Termociclador 
Metodologia 
1. Descongelar os materiais que serão utilizados – menos a Taq polimerase que não pode 
ser descongelada. Utilizar o vórtex para agitar as amostras para sair os resquícios na 
tampa do enperdoff. 
2. Utilizar essa sequência para preparar o mix: a) primer f/r; b) dNTP; c) Taq Polimerase; 
d) Tampão 1 x; e) Cloreto de Magnésio e f) Água Ultra pura 
3. Calcular a reação: 
Primer ___________________ 1 µL 
CDNA ___________________ 6 µL 
Taq Polimerase ____________ 0,2 µL 
Tampão __________________ 2,5 µL 
Cloreto de Magnésio _______ 1,5 µL 
Água Ultra pura ___________ 13,3 µL 
DNTP 1m mM _____________ 0,5 µL 
Reação total ______________ 25 µL 
4. Fazer a identificação da amostra. 
5. Pipetar 6 µL de CDNA, 1 µL de primer, 0,5 µL de dNTP, 2,5 µL de tampão e 1,5 µL de 
cloreto de magnésio. 
6. Retirar a enzima Taq polimerase do congelador, pipetar 0,2 µL da enzima e adicionar 
13,3 µL de água ultra pura. Antes de adicionar água, agita-la. 
7. Ligar o termociclador e colocar a amostra apenas quando chegar a temperatura de 
95°C. Ocorreram as seguintes etapas: 
 
ETAPA 1: Desnaturação – 95 °C por 30 segundos 
ETAPA 2: Anelamento – 60 °C por 40 segundos 
ETAPA 3: Extensão – 72 °C por 1 minuto 
 
- As etapas repetiram 35 vezes (35 ciclos); 
- O último ciclo ocorreu a 72 °C por 3 a 10 minutos. 
- O processo durou 1h42 minutos. 
 
 
 
 
 
 
Resultado e Discussão 
 
Figura 1: Resultado do PCR convencional realizado em aula no Gel de Agarose. 
 Com as mudanças da temperatura e da quantidade utilizada de cDNA, foi possívem 
amplificar a banda esperada de aproximadamente 700 bp. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório três: 
SEQUENCIAMENTO 
 
INTRODUÇÃO 
 
 O processo para que se determine uma sequencia exata de nucleotídeos em uma 
molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico) é denominado sequenciamento. Quando um 
fragmento de DNA é sequenciado, é possível ter conhecimento das quatros bases 
nucleotídicas presentes dentro da molécula de DNA: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. 
Essas bases no DNA contem informações importantes referentes ao genoma como 
propriedades hereditárias e bioquímicas, sendo possível assim entender a construção e 
estrutura das células do organismo estudado. 
 
 
MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO 
 
 O método de sequenciamento de Sanger atualmente é o mais utilizado. Nessa técnica 
ocorre a conversão de uma molécula de DNA sequenciada para fitas simples que serão 
utilizadas como molde para sintetizar fitas complementares. Cada fita sintetizada terá um 
nucleotídeo específico diferente no final da sua cadeia. Então o resultado dos fragmentos de 
DNA é separado e analisado na eletroforese. 
 Outra técnica recente de sequenciamento é a Next-Generation Sequencing (NGS). 
Nesse método ocorre o sequenciamento de várias moléculas diferentes simultaneamente, 
podendo o genoma inteiro ser sequenciado em questão de dias. Além de ser um procedimento 
com baixo custo em relação a outros métodos, tem a vantagem de gerar dados em larga escala 
e precisão. 
 
 
ANÁLISE DE BIOINFORMÁTICA PÓS SEQUENCIAMENTO 
 
 A bioinformática organiza e analisa as informações obtidas no sequenciamento. A 
sequencia pré-determinada executa algoritmos de bioinformática, conhecidos como pipelines, 
que orientam e processam os dados NGS através de uma série de conversões de dados 
utilizando componentes de softwares, bancos de dados e ambientes operacionais. Os pipelines 
se apresentam como plataformas específicas de acordo com a necessidade de cada 
laboratório, no entanto seguem etapas básicas. (figura 2) 
 
 
Figura 2: Fluxograma das etapas dos pipelines na análise bioinformática pós-sequenciamento. 
 
 É necessário que sejam realizadas validações certas para que a análise dos resultados 
de NGS tenha mais precisão e confiança. Todo processo é um trabalho em grupo onde o 
pipeline de informática e a plataforma correspondente trabalham juntamente com outros 
equipamentos como sequenciadores, computadores, e outros. 
 Nesses procedimentos é fundamental uma abordagem multidisciplinar, envolvendo 
profissionais experientes nas áreas de bioinformática, engenharia de softwares, médicos, 
analistas, entre outros. 
 
 
 
 
Geração da 
sequencia de 
dados de 
Interesse 
• Processo de conversão das informações ópticas ou químicas em 
informação binária para que assim as sequencias de nucleotídeos sejam 
identificadas. As sequencias são armazenadas em arquivos FASTQ. 
Alinhamento das 
Sequencias 
• Processo onde os pequenos fragmentos de DNA sequenciado se alinham 
com o genoma de referência. As informações de alinhamento são 
armazenadas em arquivo BAM. 
Chamada de 
Variantes 
• Processo de identificação das bases que diferem do genoma de referência. 
O produto final da chamada de variantes é um arquivo no formato VCF. 
Anotação das 
Variantes 
• Processo onde as variantes são selecionadas e filtradas para classificação e 
interpretação, utilizando as informações disponiveis em bancos de dados 
de sequenciamento e variantes. 
 
Seleção das 
Variantes e 
Elaboração do 
Laudo Clínico. 
• Na etapa de anotação são identificadas as variantes clinicamente 
significantes para revisão e interpretação. Para essa etapa é importante 
que os pipelines estejam alinhados e validados. Após serem selecionadas, 
as variantes são classificadas de acordo com as diretrizes da ACMG. 
REFERÊNCIAS 
Biometrix. (18 de Maio de 2018). Acesso em 20 de Junho de 2022, disponível em 
Sequenciamento de DNA: desvendando o código da vida: 
https://www.biometrix.com.br/sequenciamento-dna-desvendando-codigo-da-vida/ 
EMBL-EBI. (s.d.). Multiple Sequence Alignment. Acesso em16 de Junho de 2022, disponível em 
Clustal Omega: https://www.ebi.ac.u/Tools/msa/clustalo/ 
NCBI. (s.d.). National Library of Medicine. Acesso em 16 de Junho de 2022, disponível em 
http://ncbi.nlm.nih.gov 
Oliveira, T. M. (2010). PCR em tempo Real: métodos e aplicações . Aveiro, Portugal. 
Torres, J. d. (s.d.). Protocolo para PCR Real Time. 
Untergasser, A., & Nijveen, H. (s.d.). Primer3Plus. Acesso em 16 de Junho de 2022, disponível 
em http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi 
Varsomics. (19 de Outubro de 2020). Acesso em 20 de Junho de 2022, disponível em Pipelines 
de bioinformática: o que são e como implementar? : https://blog.varsomics.com/o-
que-sao-pipelines-de-bioinformatica/