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Cromatografia Cromatografia Base do método: diferenças na velocidade de movimentação de solutos passando por uma fase estacionária. Ou seja, a cromatografia consiste na separação de componentes de uma mistura complexa, efetuada através da distribuição dos componentes dessa mistura em duas fases (fase móvel e fase estacionária), que estão em contato. CLASSIFICAÇÃO: Planar: ● F. M. líquida ○ Cromatografia em papel ○ Cromatografia em camada delgada Coluna: ● F. M. gasosa ○ Cromatografia gasosa ● F. M. Líquida ○ Cromatografia em coluna ○ CLAE MECANISMOS DE INTERAÇÃO: Adsorção ● A F.M. é constituída por um solvente orgânico ou por uma mistura de solventes orgânicos; ● A F.E. é composta por partículas de sílica ou alumina. Aplicações: ● Química orgânica: separar e purificar reagentes e materiais obtidos por síntese. ● Análises Clínicas: separar esteróides de urina ou de sangue, etc. Partição A fase estacionária é um líquido imiscível com a fase móvel. Aplicações típicas da Cromatografia por Partição de Alta Eficiência: Campo Misturas separadas Farmacêutico antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Bioquímico aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídeos Produtos alimentícios adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Industrial químico aromáticos condensados, tensoativos, propelentes, corantes Poluentes pesticidas, herbicidas, fenóis, bifenilas policloradas (PCBs) Químico forense Drogas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Médico clínico ácidos bílicos, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos Troca iônica: A fase estacionária é uma resina catiônica ou aniônica. Aplicações: ● Desionização da água e de licores açucarados de frutos; ● Despigmentação de substâncias; ● Separação de: ○ metais de transição; ○ aminoácidos proteicos; ○ fármacos e seus metabólitos. Exclusão: ● A separação é efetuada de acordo com o tamanho das moléculas; ● A fase estacionária tem poros de tamanho controlado; ● Moléculas grandes movem-se rapidamente através da coluna pois não entram nos poros; ● A técnica é utilizada na análise de compostos de alta massa molecular. Bioafinidade: Somente componentes que possuem bioafinidade (ex: enzimas) com a fase estacionária são retidos. ------------------------------------------------------------- CROMATOGRAFIA PLANAR Uma placa de camada delgada é utilizada como fase estacionária. Os analitos são arrastados através da fase estacionária pela fase móvel. Fase móvel = Eluente Fator de retenção de um composto (Rf) = razão entre a distância percorrida pela banda do componente e a distância percorrida pelo eluente. Rf = dc/ds dc = distância percorrida pelos componentes ds = distância percorrida pelo eluente (FM) Exemplo: Aplicações da cromatografia planar: ● Estabelecer a identidade dos compostos; ● Determinar o número de componentes de uma mistura; ● Determinar o solvente apropriado para separação em cromatografia de coluna. Reveladores não destrutivos: ● Luz UV (254 nm) ● Vapor de Iodo Reveladores destrutivos: Solução reveladora Composição Revelação Ácido Fosfomolíbdico Solução 10% em etanol Uso universal Vanilina 15 g de vanilina, 250 mL de etanol e 2,5 mL de H2SO4 Uso geral. Variedade de colorações em diferentes grupos funcionais Permanganato de Potássio KMnO4 (1 g), Na2CO3 (2g), Uso geral H2O (100 mL) Anisaldeído EtOH (200mL), H2SO4 (10 mL) e panisaldeído (10 mL) Compostos carbonílicos Vantagens da cromatografia planar: fácil execução, rapidez, baixo custo ● Desvantagens: método qualitativo e de baixa reprodutibilidade ------------------------------------------------------------- CROMATOGRAFIA EM COLUNA Fase estacionária: coluna Fase móvel: eluentes Cromatografia gasosa Para que uma substância possa ser “arrastada” por um fluxo de gás ela deve se dissolver (pelo menos parcialmente) nesse gás. Ou seja, os constituintes precisam ser voláteis ● Os constituintes devem ter ponto de ebulição de até 300 °C, e serem termicamente estáveis. Fase Móvel: Gás de Arraste ● Requisitos: ○ Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento; ○ Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Recorte do cromatógrafo a gás onde a amostra é introduzida: – Vaporiza amostra (solvente + compostos alvo); – Mistura vapor com fase móvel (gás de arraste); – Transfere vapor para dentro da coluna. Temperatura do injetor: deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize imediatamente, mas sem decomposição; Volume injetado depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra. Eficiência de resultados (exemplos): Vantagens: ● Alta resolução (análise de muitos componentes de uma única amostra); ● Sensibilidade; ● Pequenas quantidades de amostra. Desvantagens: ● Substâncias voláteis e estáveis termicamente; ● Requer preparo da amostra (interferências e contaminações); ● Tempo e custo elevado. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis termicamente. 80% dos compostos apresentam essas características; o campo de aplicação de HPLC é extremamente vasto. Exemplos de aplicações: Indústria Analitos Alimentos Açúcares, ácido benzóico, parabenos, vitaminas, proteínas, peptídeos, aminoácidos Tintas Resinas, tensoativos, biocidas Química Polímeros Clínicas Metabólitos, proteínas, peptídeos, aminoácidos Farmacêutica Princípios ativos Instrumentação: Fase Móvel = Líquido Requisítos: ● Alto grau de pureza; ● Miscível com a amostra e não decompor seus componentes; ● Não alterar a fase estacionária; ● Baixa viscosidade; Exemplos de aplicações: Campo Misturas típicas separadas Farmacêutico antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Bioquímico aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídeos Produtos alimentícios adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Industrial químico aromáticos condensados, tensoativos, propelentes, corantes Poluentes pesticidas, herbicidas, fenóis, bifenilas policloradas Químico forense drogas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Médico clínico ácidos bílicos, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos Vantagens: ● Versatilidade; ● Sensibilidade; ● Pequenas quantidades de amostra. Desvantagens: ● Alto custo de equipamento e manutenção; ● Falta de detector universal sensível. Diferenças entre CG e CLAE:
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