Bases Moleculares HIV

Prévia do material em texto

hiv
• Qual é o tropismo celular?
"Macrófagos e as células da linhagem mieloide são as células iniciais infectadas com HIV que fornecem um reservatório para o vírus além do acesso ao cérebro" - Microbiologia Médica, Capítulo 46: O Papel dos Vírus nas Doenças| Patrick R. Murray, PhD, Ken S. Rosenthal, PhD and Michael A. Pfaller, MD.
“o HIV infecta as células mieloides e linfoides sob o revestimento mucoso" -Microbiologia Médica, Capítulo 46: O Papel dos Vírus nas Doenças| Patrick R. Murray, PhD, Ken S. Rosenthal, PhD and Michael A. Pfaller, MD.
Apresenta afinidade por células que tem receptores CD4 Linfócitos T auxiliares (Th – T helper) e macrófagos (monócitos)
• Como ocorre a replicação?
- Adesão a cél. do hospedeiro (1) - Introdução do RNA viral (2) - Transcrição Reversa (RNA -> cDNA) (3) - Integração do DNA viral ao DNA do hospedeiro (4) - Transcrição e Tradução de proteínas virais (5) - Montagem e liberação de novos vírus (6)
• Quais são os marcadores da infecção?
Com uma semana há aumento do RNA viral, e com 2ª semanas tem-se o marcador P24 (teste sorológico – detecção de antígeno), com 3ª semanas temos o IgM (teste sorológico – detecção de anticorpo) e por volta da 4ª semana detecção do IgG total (teste sorológico – detecção de anticorpo).
• Quais técnicas são utilizadas para a detecção de cada marcador de infecção? Explique cada técnica resumidamente.
- ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay:
Imunoensaio marcado; permite a detecção de anticorpos (Ac) e antígenos (Ag) específicos no soro/plasma sanguíneo.
Ensaio Imunoenzimático: Produto final (cor) surge por ação da enzima que converte o substrato incolor em um produto colorido.
 Nos ELISAs do tipo INDIRETO e DIRETO a atividade enzimática (cor) é proporcional à concentração de Ag ou Ac da amostra. No ELISA do tipo COMPETIÇÃO a cor é inversamente proporcional a [Ag] ou [Ac].
1ª e 2ª geração – Indireto IgG:
 
3ª geração – Indireto IgM / IgG: (Janela imunológica – 20 a 30 dias)
• 4ª geração – Indireto IgM / IgG e Direto Ag p24: (Janela imunológica – 15 dias)
Diagnóstico Rápido: Resultado em 30 minutos Presencial Amostra: Saliva, Sangue, Soro/Plasma S > 99,5% e E > 99%
WESTERN BLOT/IMUNIBLOT:
Consiste em um ensaio Imunoenzimático (marcado);
◻ Proteínas (Ex. virais) são separadas por diferença de peso molecular e transferidas para membranas de nitrocelulose / PVDF;
É a técnica empregada na confirmação de testes positivos pela alta especificidade. (Ex: HIV)
Amostra: soro do paciente para detectar anticorpos (IgG). 
• Defina janela imunológica
O período de janela diagnóstica é o tempo decorrido entre a infecção e o aparecimento ou detecção de um marcador da infecção, seja ele RNA viral, DNA pró-viral, antígeno ou presença de anticorpos.
• Qual é o objetivo da técnica de genotipagem?
O objetivo é o monitoramento de HIV, utilizado quando há falha no tratamento. 
✔ Identifica quais são as mutações potencialmente responsáveis pela falha da terapia com ARV.
- Gene pol (RT e Protease)
✔ Metodologia: Sequenciamento Automático de DNA
- RNA 🡪 cDNA 🡪 PCR 🡪 Sequenciamento do gene pol. 
TRATAMENTO:
● Inibidores da Transcrição Reversa: bloqueia RT do HIV.
● Inibidores de Protease: impede ação da Protease na clivagem da cadeia proteica p/ formação de partículas de HIV.
● Inibidores de entrada: impede a infecção de novas células pelo HIV.
● Terapia Combinada: associação de 2 ou mais antirretrovirais.
• Relacione : citometria de fluxo e T CD4+/TCD8+
• Monitoramento HIV:
- Contagem CD4/CD8:
Função: monitorar a eficácia do tratamento antirretroviral
Periodicidade: Em média 3x / ano
Metodologia: Citometria de Fluxo
Diferenciação das populações de linfócitos T através da identificação de moléculas expressas na superfície (CD), com uso de anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromo
• citometria de fluxo (Imunofluorescência): 
❑ Imunoensaio marcado
❑ Técnica que permite a detecção de antígenos em células/beads ou anticorpos do sangue, a partir de uma marcação com anticorpos conjugados a uma molécula fluorescente (fluorocromos).
Aplicações:
- Identificação de subpopulações de linfócitos (Ex. CD4 e CD8);
- Imunofenotipagem – Leucemia linfóide ou mielóide (Ex. TdT e MPO) 
Contagem de células CD4 em sangue periférico: 
❑ maior que 500 células/mm3: estágio da infecção pelo HIV com baixo risco de doença;
❑entre 200 e 500 células/mm3: estágio caracterizado por surgimento de sinais e sintomas menores;
❑entre 50 e 200 células/mm3: estágio com alta probabilidade de surgimento de doenças oportunistas;
❑ menor que 50 células/mm3: estágio com grave comprometimento de resposta imunitária.
Monitoramento HIV – CARGA VIRAL:
✔ Estima o número de cópias do genoma viral circulando no paciente
✔ Expresso em número de cópias do RNA de HIV/mL
✔ Há vários métodos - PCR quantitativo (qPCR)
✔ >= 5.000 cópias/mL 🡪 Reagente (positivo)
✔ < 5.000 cópias/mL 🡪 Indeterminado
✔ Limite de detecção/quantificação <= 50 cópias/mL (negativo ou não detectável)
✔ qPCR – Diagnóstico Molecular para HIV em Banco de Sangue (Obrigatório)
PCR:
Responsável pela localização da sequência alvo (Ex. DNA, RNA).
Oligonucleotídeos espécie específica (primers) com 20-24 bases.
O pareamento dos “primers” com a sequência alvo se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, segundo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick:
PCR: Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da Polimerase.
Técnica que permite a amplificação da quantidade de cDNA/DNA específico utilizando a enzima Taq DNA polimerase, dNTP, sequências iniciadoras específicas (primers) e variações de temperatura controladas.
PCR em tempo real (qPCR): Componentes